Pengekstrakan Glikosida Phenylethanoid Daripada Cistanche Tubulosa Dengan Pengekstrakan Homogenisasi Ricih Berkelajuan Tinggi

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei dan Ruili Guo

latar belakang:

Cistanche tubulosaadalah perubatan tradisional Cina yang terkenal berasal dari Xinjiang. Ia diedarkan secara meluas di utara Afrika, India, dll. Objektif: Komponen bioaktif utamaC. tubulosaialah phenylethanoid glycosides (PhGs). Echinacoside dan acteoside ialah komponen indikatif untuk penentuan PhG dan digunakan terutamanya untuk perlindungan hati, perlindungan imun, dll. Oleh itu, adalah sangat penting untuk mengekstrak PhG daripada C. tubulosa. Kaedah: Dalam kajian ini, kaedah pengekstrakan berbantu ultrasound (UAE), pengekstrakan berbantu gelombang mikro (MAE), dan kaedah pengekstrakan homogenisasi ricih berkelajuan tinggi (HSHE) telah dibandingkan. Tambahan pula, keadaan pengekstrakan kaedah HSHE telah dioptimumkan. Keputusan: Keputusan menunjukkan bahawa kaedah HSHE lebih baik daripada kaedah UAE dan MAE, dan parameter pengekstrakan optimum HSHE ialah kepekatan etanol 50 peratus , suhu pengekstrakan 70 darjah , kelajuan putaran 16000 rpm, masa pengekstrakan 2 minit, nisbah pepejal-ke-cecair 1:9, dan satu kitaran pengekstrakan. Hasil echinacoside dan acteoside masing-masing ialah 1.366 dan 0.519 peratus, dan kadar pemindahan echinacoside dan acteoside masing-masing mencapai 87 dan 94 peratus. Kesimpulan: Dapat disimpulkan bahawa kaedah HSHE adalah teknik yang mudah, cepat, dan cekap untuk mengekstrak PhG daripada C. tubulosa. Sorotan: Kaedah HSHE yang cekap dan mesra alam telah disiasat untuk pengekstrakan PhG daripada C. tubulosa. Keadaan optimum kaedah HSHE untuk pengekstrakan PhG daripada C. tubulosa telah diperolehi. Penyelidikan ini menyediakan kaedah baharu untuk pengekstrakan industri PhG daripadaC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaadalah perubatan tradisional Cina biasa yang berasal dari Xinjiang. Ia diedarkan secara meluas di utara Afrika, Semenanjung Arab, Pakistan, dan India dan secara rasmi direkodkan dalam Farmakope Cina pada tahun 2010. Komponen bioaktif utamaC. tubulosaialah phenylethanoid glycosides (PhGs), kelas produk semula jadi larut air termasuk echinacoside, acteoside, isoacteoside dan 2-acetylacteoside (1, 2). Struktur PhG terdiri daripada asid sinamat dan gugusan hidroksifeniletil, kedua-duanya dilekatkan pada a -glucopyranose melalui ikatan ester dan glikosidik, masing-masing (3). Kajian farmakologi telah menunjukkan bahawa PhGs C. tubulosa mempunyai banyak fungsi perubatan, seperti antikeletihan (4), neuroprotektif (5-7), pelindung hati (8-10), dan kesan imunoprotektif (11). Oleh itu, pengekstrakan PhG yang berkesan daripada C. tubulosa adalah sangat penting untuk pembangunan dan penggunaan produk semula jadi.

Kaedah pengekstrakan tradisional semasa PhG ialah pengekstrakan refluks panas, pengekstrakan berbantu ultrasound (UAE), dan pengekstrakan berbantukan gelombang mikro (MAE; 12–16). Kaedah ini mempunyai kelemahan yang berbeza, seperti kecekapan rendah, masa pengekstrakan yang lama dan kos yang tinggi. Berbanding dengan kaedah tradisional, kaedah pengekstrakan homogenisasi ricih berkelajuan tinggi (HSHE) merupakan kaedah pengekstrakan baru yang baru muncul dan mempunyai kelebihan masa pengekstrakan yang lebih cepat, sisa pelarut yang kurang, hasil yang lebih tinggi, peranti yang lebih ringkas dan operasi yang lebih mudah (17). Prinsip kerja kaedah HSHE adalah berdasarkan pemotong dalaman berputar yang digerakkan oleh motor berkelajuan tinggi. Daya ricih yang kuat dihasilkan oleh pemotong dalam dan luar untuk mengganggu dan mencampurkan sampel. Sementara itu, pemotong dengan putaran berkelajuan tinggi menyebabkan perbezaan tekanan antara rongga dalam dan luar pemotong, mengakibatkan pemindahan jisim antara sampel dan pelarut. Dengan gabungan daya ricih yang tinggi, daya perlanggaran, tekanan dan daya lain, keseimbangan larut antara sampel pepejal dan pelarut boleh dicapai dengan cepat (18). Oleh itu, proses pengekstrakan HSHE boleh diselesaikan dalam beberapa minit, malah sepantas berpuluh-puluh saat (19–22).

Baru-baru ini, HSHE telah diterokai dalam pengekstrakan komponen bioaktif daripada pelbagai produk semula jadi (23–25). Cheng et al. menggunakan HSHE untuk mengekstrak lima lignan daripada buah Schisandra Chinensis (26). Keputusan menunjukkan bahawa keadaan optimum ialah kepekatan etanol sebanyak 75 peratus , masa pengekstrakan 1 minit, nisbah pepejal-ke-cecair 1:19, voltan pengekstrakan 180 V dan zarah sampel saiz 120 jerat. Jumlah hasil lima lignan ialah 13.89 ± 0.014 mg/g di bawah keadaan yang dioptimumkan. Tang et al. menggunakan HSHE untuk mendapatkan minyak bioaktif daripada biji perilla (27). Keadaan optimum ialah masa pengekstrakan 2 minit, nisbah pepejal kepada cecair 1:10, voltan pengekstrakan 150 V, dan dua kitaran pengekstrakan. Hasil minyak biji perilla mencapai 59.3 peratus . Keputusan di atas menunjukkan bahawa HSHE mempunyai kelebihan masa pengekstrakan yang singkat, kos rendah, dan hasil yang tinggi. Walau bagaimanapun, terdapat kekurangan penyelidikan mengenai pengekstrakan PhG oleh HSHE.

Dalam kajian ini, HSHE telah digunakan untuk meneroka potensi aplikasinya dalam pengekstrakan PhG daripadaC. tubulosa. Hasil PhG ditentukan oleh HPLC. Tiga kaedah pengekstrakan, HSHE, UAE, dan MAE, telah dibandingkan di bawah keadaan yang sama. Kesan kepekatan etanol, suhu pengekstrakan, kelajuan putaran, masa pengekstrakan, nisbah pepejal-kepada-cecair, dan bilangan kitaran pengekstrakan hasil telah disiasat. Kelebihan dan kekurangan karya ini dan rujukannya dibandingkan dan dibincangkan.

Bahan dan Kaedah

Bahan dan Reagen Kimia

C. tubulosatelah dibeli daripada Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, China). Piawaian echinacoside (ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 98 peratus ) dan acteoside (ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 98 peratus ) telah dibeli daripada Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, China). Acetonitrile, metanol, dan asid asetik adalah gred HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanol gred analitik telah dibeli daripada Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, China). Air ternyahion digunakan sepanjang eksperimen.

Analisis HPLC

Analisis HPLC telah dilakukan pada kromatografi cecair Waters e2695 (Waters, Milford, MA) yang dilengkapi dengan 2489 UV/Visible Detector dan lajur Simetri C18 (Waters), 250 × 4.6 mm, saiz zarah 5 μm. Kepekatan echinacoside dan acteoside dianalisis dengan kaedah HPLC. Fasa bergerak terdiri daripada (1) asetonitril dan (2) larutan akueus asid asetik glasier 2 peratus. Program elusi kecerunan dibentangkan dalam Jadual 1.

Panjang gelombang yang dikesan ialah 330 nm, kadar alir ialah 1 mL/min, isipadu suntikan ialah 10 μL, dan suhu ketuhar ditetapkan pada 30 darjah . Puncak kromatografi analit telah disahkan dengan membandingkan masa pengekalannya dengan piawaian. Kuantifikasi dijalankan dengan mengintegrasikan puncak menggunakan kaedah piawai luaran.

Ujian ketepatan dijalankan dengan menyuntik sampel pengekstrakan yang sama sebanyak lima kali. Untuk ujian kestabilan, sampel yang sama dianalisis dalam kenaikan 0, 1, 2, 4, 12, 24 dan 48 jam. Ujian pemulihan echinacoside dan acteoside telah dijalankan dengan menambahkan piawaian ke dalam sampel pengekstrakan. Semua kawasan puncak dan masa pengekalan echinacoside dan acteoside telah direkodkan. Keputusan keluk penentukuran untuk echinacoside dan acteoside disenaraikan dalam Jadual 2.

Pengiraan Hasil

Echinacoside dan acteoside digunakan sebagai komponen indikatif untuk penentuan PhGs. Hasil echinacoside atau acteoside dikira menggunakan persamaan berikut:

Y=CV/W×100 peratus (1)

dengan Y=hasil echinacoside atau acteoside ( peratus ); C=kepekatan echinacoside atau acteoside (mg/mL); V=isipadu larutan pengekstrakan (mL); dan W=berat serbuk C. tubulosa (mg).

Kaedah Pengekstrakan PhGs

Batang C. tubulosa mula-mula dikisar oleh pengisar elektrik (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) dan ditapis dengan penapis penapis (kira-kira 380 μm). Kemudian, serbuk C. tubulosa dikeringkan di dalam ketuhar pada suhu 70 darjah sehingga beratnya tetap. Lima gram serbuk C. tubulosa dicampur dengan pelarut pengekstrakan dan dimasukkan ke dalam botol pengekstrakan. Selepas, campuran cecair dipanaskan terlebih dahulu (30–80 darjah ) selama 5 minit dalam tab mandi air bersuhu malar (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, China).

(a) Kaedah HSHE.—HSHE telah dijalankan oleh sistem FA25 (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, China), yang terdiri daripada pemotong berputar, motor berkelajuan tinggi dan pengawal. Kelajuan putaran pemotong dalam dikawal dalam julat 10000–28000 rpm, dan masa pengekstrakan diselaraskan dalam julat 2–15 minit.

(b) Kaedah UAE.—Lima gram sampel kering dan 300 mL metanol ditimbang dengan tepat dan dimasukkan ke dalam botol perahan. Botol pengekstrakan direndam ke dalam mandi ultrasonik dan dijalankan pada kuasa ultrasonik 300 W selama 10 minit. Suhu pengekstrakan ditetapkan pada 30 darjah .

(c) Kaedah MAE.—Lima gram sampel kering dan 300 mL metanol ditimbang dengan tepat dan dimasukkan ke dalam botol perahan. Botol pengekstrakan dimasukkan ke dalam reaktor gelombang mikro dan dijalankan pada 180 W selama 10 minit. Suhu pengekstrakan ditetapkan pada 30 darjah .

Kaedah HSHE dibandingkan dengan kaedah UAE dan MAE dengan pelarut pengekstrakan yang sama, masa pengekstrakan, suhu pengekstrakan, nisbah pepejal kepada cecair, dan nombor kitaran pengekstrakan. Larutan pengekstrakan telah ditapis oleh membran 0.22 μm dan dianalisis melalui HPLC untuk menentukan kepekatan echinacoside dan acteoside. Semua proses pengekstrakan diulang tiga kali

Penentuan Kadar Pemindahan

Berdasarkan kaedah standard dalam 2015 China Pharmacopoeia, kandungan echinacoside dan acteoside dalam serbuk C. tubulosa telah ditentukan (28). Satu gram serbuk C. tubulosa dan 50 mL 50 peratus metanol ditimbang dengan tepat dan dimasukkan ke dalam kelalang isipadu coklat 50 mL. Campuran cecair ditimbang dan direndam selama 30 minit. Kemudian, kelalang isipadu coklat direndam dalam mandi ultrasonik dan dijalankan pada kuasa ultrasonik 250 W dan frekuensi 35 kHz selama 40 minit. Campuran cecair ditimbang semula, dan 50 peratus metanol ditambah untuk membekalkan kehilangan pelarut. Larutan pengekstrakan telah ditapis oleh membran 0.22 μm dan dianalisis menggunakan HPLC untuk menentukan kepekatan echinacoside dan acteoside. Proses pengekstrakan diulang tiga kali.

Kadar pemindahan echinacoside atau acteoside dikira menggunakan persamaan berikut:

X= M1/M2 ×100 peratus (2)

di mana X=kadar pemindahan echinacoside atau acteoside ( peratus ); M1=kualiti echinacoside atau acteoside dalam ekstrak (mg); dan M2=kualiti echinacoside atau acteoside dalam serbuk C. tubulosa (mg).

Keputusan dan perbincangan

Pengesahan Kaedah HPLC

Profil HPLC echinacoside dan acteoside daripada C. tubulosa menggunakan HSHE ditunjukkan dalam Rajah 1. RSD bagi kawasan puncak echinacoside dan acteoside ialah 1.89 dan 1.40 peratus, masing-masing. Keputusan menunjukkan bahawa kaedah HPLC mempunyai ketepatan yang baik dalam analisis kuantitatif echinacoside dan acteoside. Pada pelbagai masa (0–48 j), RSD bagi kawasan puncak echinacoside dan acteoside ialah 1.71 dan 1.70 peratus, masing-masing, menunjukkan bahawa sampel itu stabil dalam 48 jam. Pemulihan echinacoside dan acteoside masing-masing ialah 99.3 dan 99.1 peratus, dan RSD mereka masing-masing ialah 0.70 dan 0.67 peratus, yang mengesahkan kebolehpercayaan kaedah HPLC.

Perbandingan Kaedah Pengekstrakan Berbeza

Perbandingan kaedah HSHE dengan kaedah MAE dan UAE mengenai hasil echinacoside dan acteoside telah dijalankan, keputusannya ditunjukkan dalam Rajah 2. Adalah diperhatikan bahawa hasil echinacoside dan acteoside yang diperolehi oleh HSHE adalah lebih tinggi daripada yang diperolehi. oleh kedua-dua MAE dan UAE. Berbanding dengan MAE, hasil echinacoside dan acteoside yang diperolehi oleh HSHE adalah lebih besar, masing-masing sebanyak 20.5 dan 20.8 peratus. Dan berbanding dengan UAE, hasil echinacoside dan acteoside yang diperoleh oleh HSHE adalah lebih besar, masing-masing sebanyak 6.6 dan 7.4 peratus. Keputusan ini menunjukkan bahawa HSHE boleh meningkatkan hasil PhG dengan ketara.

Pengoptimuman Kaedah HSHE

Parameter pengekstrakan PhG oleh HSHE termasuk kepekatan etanol, suhu pengekstrakan, kelajuan putaran, masa pengekstrakan, nisbah pepejal-kepada-cecair, dan bilangan kitaran pengekstrakan (26, 29).

Kesan Kepekatan Etanol terhadap Pengekstrakan PhG

Kepekatan etanol merupakan faktor penting yang mempengaruhi hasil PhG. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, hasil echinacoside dan acteoside daripada C. tubulosa di bawah kepekatan etanol yang berbeza telah disiasat. Ia mendedahkan bahawa hasil echinacoside meningkat daripada 0 kepada 30 peratus dan kemudian menurun daripada 30 hingga 90 peratus dengan meningkatkan kepekatan etanol. Hasil acteoside meningkat daripada 0 hingga 70 peratus dan kemudian menurun daripada 70 hingga 90 peratus dengan peningkatan kepekatan etanol. Apabila kepekatan etanol ialah 50 peratus , jumlah hasil echinacoside dan acteoside berada pada tahap maksimum. Kepekatan etanol yang berbeza mempunyai kekutuban yang berbeza, yang membawa kepada keterlarutan yang berbeza bagi echinacoside dan acteoside. Oleh itu, kepekatan etanol optimum ialah 50 peratus .

Kesan Kelajuan Putaran terhadap Pengekstrakan PhG

Rajah 5 menunjukkan kesan kelajuan putaran yang berbeza terhadap hasil PhG. Hasil echinacoside dan acteoside meningkat dengan peningkatan kelajuan putaran. Peningkatan kelajuan putaran boleh meningkatkan daya ricih pemotong dalam dan luar, sekali gus meningkatkan hasil PhG. Kelajuan putaran optimum ialah 16000 rpm.

Kesan Masa Pengekstrakan terhadap Pengekstrakan PhG

Hasil echinacoside dan acteoside di bawah masa pengekstrakan yang berbeza ditunjukkan dalam Rajah 6. Hasil echinacoside dan acteoside adalah stabil dengan peningkatan masa pengekstrakan. Oleh itu boleh disimpulkan bahawa PhGs boleh diekstrak sepenuhnya daripada C. tubulosa dalam 2 minit, dan masa pengekstrakan optimum ialah 2 min.

Kesan Nisbah Pepejal kepada Cecair terhadap Pengekstrakan PhG

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7, hasil echinacoside dan acteoside di bawah nisbah pepejal-ke-cecair yang berbeza telah dibincangkan. Hasil echinacoside dan acteoside meningkat daripada 1:3 kepada 1:9 dan menjadi stabil daripada 1:9 kepada 1:24. Oleh kerana sejumlah kecil pelarut pengekstrakan tidak dapat melarutkan sepenuhnya echinacoside dan acteoside, kadar pemindahan jisim telah dikurangkan. Pengekstrakan pelarut yang berlebihan menyebabkan pembaziran yang tidak perlu. Oleh itu, nisbah pepejal-kepada-cecair optimum ialah 1:9.

Kesan Bilangan Kitaran Pengekstrakan terhadap Pengekstrakan PhG

Rajah 8 menunjukkan bahawa kesan beberapa kitaran pengekstrakan ke atas hasil PhG. Hasil echinacoside dan acteoside meningkat dengan peningkatan bilangan kitaran pengekstrakan. Walau bagaimanapun, masa pengekstrakan meningkat dengan ketara dengan peningkatan kitaran pengekstrakan, dan lebih banyak tenaga telah digunakan. Bilangan optimum kitaran pengekstrakan ialah satu.

Membandingkan Kaedah HSHE dengan Kaedah Pengekstrakan Lain untuk Mengekstrak PhG

Keputusan kaedah HSHE berbanding kaedah pengekstrakan lain untuk mengekstrak PhG daripada C. tubulosa disenaraikan dalam Jadual 3. HSHE adalah lebih mudah dan lebih mudah daripada kaedah gandingan seperti pengekstrakan dua fasa berair berbantukan ultrasound dan teknologi pengekstrakan gelombang mikro ultrasonik kaedah. Di samping itu, tekanan pengekstrakan HSHE adalah lebih rendah daripada kaedah pengekstrakan cecair bertekanan, dan keadaan operasi bekas adalah lebih selamat. Lebih penting lagi, dapat dilihat daripada Jadual 3 bahawa HSHE menunjukkan masa pengekstrakan terpendek dan penggunaan pelarut paling sedikit di antara semua kaedah pengekstrakan. Dapat disimpulkan bahawa kaedah HSHE mempunyai banyak kelebihan seperti kecekapan tinggi, keadaan operasi yang sederhana, tahap penggunaan yang rendah, peralatan ringkas, dan operasi yang mudah untuk pengekstrakan produk semula jadi.

Kesimpulan

Dalam kajian ini, kaedah HSHE yang cekap dan mesra alam telah disiasat untuk pengekstrakan PhG daripada C. tubulosa. Berbanding dengan kaedah UAE dan MAE, kaedah HSHE novel menghasilkan hasil PhG yang lebih tinggi dalam keadaan yang sama. Berbanding dengan kaedah MAE, hasil echinacoside dan acteoside masing-masing meningkat sebanyak 20.5 dan 20.8 peratus . Dan berbanding dengan UAE, hasil echinacoside dan acteoside masing-masing meningkat sebanyak 6.6 dan 7.4 peratus. Parameter pengekstrakan HSHE PhGs daripada C. tubulosa telah dioptimumkan. Di bawah parameter yang dioptimumkan, hasil echinacoside dan acteoside masing-masing mencapai 1.366 dan 0.519 peratus, dan kadar pemindahan echinacoside dan acteoside masing-masing mencapai 87 dan 94 peratus. Kaedah HSHE mempunyai kelebihan kecekapan tinggi, keadaan operasi sederhana, tahap penggunaan rendah, peralatan mudah, operasi mudah dan kos rendah. Penyelidikan ini menyediakan kaedah baharu untuk pengekstrakan industri PhG daripada C. tubulosa.