Ekspresi Neuronal Nitric Oxide Synthase dan Renin dalam Buah Pinggang Displastik Anjing Muda

ABSTRAK.

Renin dansintase nitrik oksida neurondalam kawalan buah pinggang yangrenin-angiotensindansistem maklum balas tubuloglomerular. Kajian ini menyiasat ekspresi renin dan neuronnitrik oksida sintasedi dalambuah pinggang displastikdaripada tiga anjing muda. Reninimmunoreaktiviti, yang berlaku dalam sel juxtaglomerular dan tiub buah pinggang displastik, tidak berbeza daripada buah pinggang normal anjing muda. Sel-sel padat makula dalam buah pinggang normal menunjukkan neuron nitric oxide synthase-immunoreactivity, tetapi sel-sel dalam buah pinggang displastik tidak menunjukkan isyarat yang jelas. Pemerhatian ini mungkin dikaitkan dengan mekanisme patologi kegagalan buah pinggang pada anjing muda.

KATA KUNCI: penyakit buah pinggang yang kronik, buah pinggang displastik, imunohistokimia, sintase nitrik oksida neuron, renin

Kegagalan buah pinggangkadang-kadang berlaku pada anjing muda. Dalam kes sedemikian, pemeriksaan histologi kerap menunjukkan lesi buah pinggang displastik. Walau bagaimanapun, mekanisme patofisiologi yang berlaku dalam buah pinggang displastik anjing masih tidak jelas. Baru-baru ini, kami menunjukkan pengecilan siklooksigenase (COX)-2 dalam penyakit buah pinggang kronik pada anjing muda dengan buah pinggang displastik menggunakan analisis imunohistokimia [19].

Sokongan Tambahan CistancheTambahan Fungsi Buah Pinggang

COX-2 ialah enzim keradangan teraruh yang penting untuk perkembangan buah pinggang yang normal pada peringkat janin dan neonatal [12, 15]. Selepas kelahiran, COX-2 secara konstitutif diekspresikan dalam buah pinggang dan tertumpu di kawasan sekatan makula densa (MD) pada anggota badan menaik yang tebal [1, 4, 22]. MD adalah kawasan khusus bersebelahan dengan kutub vaskular glomerulus. Ia mengawal rembesan renin dan sistem maklum balas tubuloglomerular (TGF). COX-2 yang dinyatakan dalam sel MD mengawal mekanisme ini [6, 8]. Selain COX-2, neuron nitric oxide synthase (nNOS), yang turut dinyatakan dalam sel MD, dikenali sebagai pengawal selia utama sistem TGF [3, 18]. Kedua-dua molekul ini, yang dinyatakan bersama dalam MD, diketahui berinteraksi antara satu sama lain [2, 5, 9]. Dalam kajian ini, kami menyiasat ekspresi renin dan nNOS dalam buah pinggang displastik oleh imunohistokimia untuk menentukan sama ada pengecilan COX-2 dalam buah pinggang displastik mendorong gangguan sistem renin-angiotensin dan sistem TGF dalam anjing muda.

Blok parafin tetap formalin bagi buah pinggang displastik daripada anjing muda (n=3), buah pinggang normal daripada anjing muda (n=3) dan buah pinggang normal daripada anjing dewasa (n=4) adalah sama seperti yang digunakan dalam kajian terdahulu kami, di mana sejarah klinikal dan penyediaan tisu telah diterangkan sebelum ini [19]. Kajian itu telah diluluskan oleh Jawatankuasa Percubaan Haiwan Universiti Kagoshima, Jepun (VM15020). Bahagian telah disediakan dengan ketebalan 3-µm, dan analisis imunohistokimia untuk renin dan nNOS dilakukan mengikut protokol berikut: (1) penyahparafinan; (2) pengambilan antigen melalui pemanasan gelombang mikro dalam 10 mM penimbal sitrat (pH 6.0) untuk nNOS; (3) pengeraman dengan 3% H2O2 selama 30 minit; (4) menyekat dengan 3% albumin serum lembu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) untuk renin atau 0.25% kasein (Sigma-Aldrich) untuk nNOS, dicairkan dalam salin buffer fosfat, selama 30 minit; (5) pengeraman semalaman pada 4 darjah dengan pencairan 1:3,000 antiserum poliklonal renin anti-rekombinan arnab (dibekalkan oleh Dr. Murakami, Universiti Tsukuba, Jepun) atau 1:3,{{32 }} pencairan antiserum poliklonal anti-nNOS arnab (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), dalam larutan penyekat; (6) pengeraman selama 30 minit pada suhu bilik dengan antibodi universal terkonjugasi peroksidase-polimer (imunoglobulin anti-tikus (Ig) G dan anti-arnab IgG; noda mudah MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokyo, Jepun) ; dan (7) pengesanan imunosignal menggunakan sistem 3,3ʹ-diaminobenzidine (tablet penimbal 3,3ʹ-diaminobenzidine; Merck, Darmstadt, Jerman). Untuk bahagian kawalan negatif, IgG arnab biasa (Lab Vision, Fremont, CA, USA) digunakan sebagai pengganti antibodi utama.

Rajah 1. Imunohistokimia untuk renin dalam buah pinggang taring yang displastik. A: Isyarat renin-positif diperhatikan dalam sel juxtaglomerular berhampiran kutub vaskular dan beberapa sel glomerular (anak panah). Bar: 50 µm. B: Rantau bahagian yang berbeza ditunjukkan dalam panel A. Tubul dalam segmen nefron yang tidak dikenal pasti menunjukkan renin-imunoreaktiviti. Bar: 50 µm.

Analisis morfometrik rawak untuk imunoreaktiviti renin telah dilakukan mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini [20]. Secara ringkas, indeks renin ditakrifkan sebagai nisbah jumlah bilangan arteriol positif renin kepada jumlah glomeruli dan dinyatakan setiap 100 glomeruli. Perbezaan antara kumpulan dianalisis menggunakan kaedah perbandingan berganda Bonferroni dengan versi SPSS 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Diagnosis histopatologi dilakukan mengikut kriteria mikroskopik displasia buah pinggang anjing oleh Picut dan Lewis [14]. Bahagian histologi bagi ketiga-tiga kes menunjukkan pembezaan tak segerak, yang menunjukkan kehadiran lesi dengan glomeruli janin/tidak matang. Perubahan sekunder keterukan berubah-ubah seperti kerosakan tiub, fibrosis interstisial, dan glomeruli sklerotik diperhatikan dalam tisu buah pinggang yang matang.

Dalam buah pinggang displastik, isyarat renin-imunoreaktiviti diperhatikan dalam sel juxtaglomerular (JGCs) (Rajah 1A), dan sel tiub terletak di nefron distal (Rajah 1B). Dalam sesetengah glomeruli, beberapa sel menunjukkan isyarat renin-positif berhampiran kutub vaskular (Rajah 1A). Dalam buah pinggang kawalan muda, isyarat renin juga dikesan dalam kedua-dua JGC dan tubul distal, termasuk sel MD. Dalam buah pinggang kawalan dewasa, isyarat renin-positif dihadkan kepada JGC. Secara statistik, bilangan kawasan renin-positif dalam buah pinggang displastik tidak menunjukkan perbezaan yang ketara daripada buah pinggang muda dan dewasa.

Rangsangan pengeluaran renin diketahui memainkan peranan dalam isyarat COX-2 dan kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa aktiviti dan kepekatan renin plasma dikurangkan selepas pentadbiran perencat COX-2 atau dalam kalah mati COX -2 gen [10, 11]. Oleh kerana buah pinggang displastik yang diperiksa dalam kajian ini tidak menunjukkan ekspresi COX buah pinggang-2 [19], pengurangan dalam isyarat imun renin dalam JGC pada mulanya disyaki sebagai kemungkinan keabnormalan fisiologi dalam buah pinggang displastik. Walau bagaimanapun, analisis imunohistokimia sekarang tidak dapat mengesahkan hipotesis ini, dan tiada pengurangan renin yang jelas dicadangkan dalam JGC. Walaupun peranan fisiologi renin tiub belum dijelaskan sebelum ini, pengendalian natrium buah pinggang mungkin merupakan peranan renin tiub, kerana peningkatan ekspresi renin telah diinduksi dalam nefron distal selepas pemakanan diet rendah garam pada tikus. [16], dan buah pinggang displastik anjing yang diperiksa dalam kajian ini mungkin mengekalkan fungsi tiub ini.

COX-2 juga penting dalam pengawalseliaan sistem TGF, yang penting untuk mengekalkan kadar penapisan glomerular. Kajian terhadap tikus menggunakan kaedah mikropunktur menunjukkan penindasan tindak balas TGF selepas rawatan dengan perencat COX-2 [2]. Tindak balas TGF dalam buah pinggang displastik mungkin dilemahkan kerana kekurangan ekspresi COX{3}} buah pinggang. Bagaimanapun, tiada penemuan berkaitan telah dilaporkan sebelum ini. Dalam buah pinggang, nNOS dinyatakan dalam sel MD dan membantu mengawal sistem TGF [18].

Dalam analisis nNOS sekarang, tiada isyarat jelas dikesan di kawasan MD bagi semua kes (Rajah 2). Pengurangan nNOS ini dianggap sebagai kejadian etiopatogenik dalam buah pinggang displastik dan bukannya yang diperoleh selepas kegagalan buah pinggang kes tersebut. Kajian terdahulu kami menggunakan tikus OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty), sebagai model diabetes jenis 2, menunjukkan bahawa nNOS telah diekspresikan secara berlebihan dalam MD dan sel-sel tiub di sekelilingnya pada peringkat akhir nefropati diabetik [21]. Dalam peraturan sistem TGF, fungsi nNOS adalah serupa dan berinteraksi dengan fungsi COX-2. Sesetengah kajian telah mencadangkan bahawa nNOS diletakkan di hulu laluan isyarat dan merangsang ekspresi COX-2 [5, 9]. Sebaliknya, kajian lain telah mencadangkan sebaliknya bahawa COX-2 diletakkan di hulu NOS [2, 13]. Tanpa mengira perbezaan dalam laluan isyarat, kekurangan nNOS-imunosignal dalam sel MD boleh mencetuskan penurunan regulasi ekspresi COX{12}} buah pinggang dalam buah pinggang displastik.