Meneroka Peranan Novel Interleukin-17 Homolog Daripada Invertebrata Kerang Marin Mytilus Coruscus dalam Tindak Balas Imun Semula Jadi: Adakah Peraturan Negatif Oleh Mc-Novel_miR_145 Kuncinya?
Dec 11, 2023
Abstrak: Interleukin-17 (IL-17) mewakili kelas sitokin proinflamasi yang terlibat dalam gangguan keradangan dan degeneratif kronik. Sebelum kajian ini, adalah diramalkan bahawa homolog IL-17 boleh disasarkan oleh Mc-novel_miR_145 untuk mengambil bahagian dalam tindak balas imun Mytilus coruscus. Kajian ini menggunakan pelbagai kaedah penyelidikan biologi molekul dan sel untuk meneroka perkaitan antara Mc-novel_miR_145 dan IL-17 homolog dan kesan imunomodulatornya. Ramalan bioinformatik mengesahkan kaitan homolog IL-17 dengan keluarga IL-17 kupang, diikuti dengan ujian PCR masa nyata kuantitatif (qPCR) untuk menunjukkan bahawa McIL-17-3 sangat dinyatakan dalam tisu yang berkaitan dengan imun dan bertindak balas terhadap cabaran bakteria. Keputusan daripada ujian wartawan luciferase mengesahkan potensi McIL{15}} untuk mengaktifkan NF-κb hiliran dan penyasarannya oleh Mc-novel_miR_145 dalam sel HEK293. Kajian itu juga menghasilkan antiserum McIL-17-3 dan mendapati Mc-novel_miR_145 mengawal selia McIL-17-3 secara negatif melalui western blotting dan ujian qPCR. Tambahan pula, analisis sitometri aliran menunjukkan bahawa Mc-novel_miR_145 secara negatif mengawal McIL-17-3 untuk mengurangkan apoptosis yang disebabkan oleh LPS. Secara kolektif, keputusan semasa menunjukkan bahawa McIL{31}} memainkan peranan penting dalam pertahanan imun moluska terhadap serangan bakteria. Tambahan pula, McIL- 17-3 dikawal secara negatif oleh Mc-novel_miR_145 untuk mengambil bahagian dalam apoptosis yang disebabkan oleh LPS. Penemuan kami memberikan pandangan baharu tentang peraturan RNA bukan pengekodan dalam model invertebrata.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Kata kunci: Mytilus couscous; interleukin-17; mikroRNA; apoptosis; imuniti semula jadi
1. Pengenalan
Sistem imun memainkan peranan penting dalam pertahanan organisma terhadap pencerobohan patogen eksogen. Secara konvensional, sistem pertahanan dibahagikan kepada imuniti semula jadi dan imuniti diperoleh. Imuniti semula jadi mewakili barisan pertama pertahanan badan terhadap patogen, yang boleh mengesan pencerobohan patogen dan menghapuskan sebahagiannya [1]. Imuniti semula jadi dimediasi oleh pelbagai jenis sel, termasuk sel pembunuh semulajadi, monosit, neutrofil, eosinofil, basofil dan sel dendritik yang beredar, yang secara kolektif dikenali sebagai sel imun semula jadi. Sel-sel ini melepaskan sejumlah besar sitokin yang terlibat dalam komunikasi selular dan dengan itu membantu menyelaraskan tindak balas imun [2]. Dalam kes jangkitan dan keradangan, sitokin berfungsi sebagai modulator: sesetengah sitokin menjadikan penyakit lebih teruk (proinflamasi), manakala yang lain menggalakkan kesihatan (anti-radang) [3]. Sitokin tertakluk kepada tahap tekanan evolusi yang tinggi dan dengan itu mempamerkan kepelbagaian jujukan [4], manakala keluarga sitokin IL-17 menunjukkan pemuliharaan yang tinggi, yang ditunjukkan oleh lipatan simpulan sistein dalam seni bina berfungsi yang terbentuk melalui interaksi antara empat sisa sistein terpelihara [5]. Kajian terkini telah menunjukkan bahawa IL-17 ialah kelas sitokin proinflamasi yang terlibat dalam gangguan keradangan dan degeneratif kronik [6]. Fungsi IL{10}} dengan mengikat secara khusus kepada reseptor untuk menggalakkan perkembangan keradangan, penolakan imun dan hematopoiesis. Keluarga IL-17 sitokin pada manusia terdiri daripada enam ahli (IL-17A hingga IL-17F), yang dihasilkan oleh limfosit T diaktifkan dan populasi sel semula jadi yang lain sebagai tindak balas kepada IL -1 dan IL-23 [7,8]. Walau bagaimanapun, kumpulan bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa keluarga IL-17 mengalami pengembangan yang ketara dalam spesies moluska marin dan echinoderm. Dalam genom landak laut ungu Strongylocentrotus purpuratus, kira-kira 30 IL-17 gen telah dikesan [9]. Begitu juga, 31 gen seperti IL-17-octopus ditemui dalam cephalopod Coleoid, di mana 27 gen mempunyai ekspresi yang hebat dalam penyedut dan kulit [10]. Saco, et al. [11] mendapatkan 379 jujukan IL-17 unik daripada 15 genom kupang yang disusun semula dan genom rujukan M. galloprovincialis [12] dan membahagikannya kepada 23 isoform melalui analisis filogenetik. Selanjutnya, mereka mendapati bahawa isoform IL-17 daripada spesies Mytilidae telah dipelihara dalam kalangan individu dan dikongsi antara spesies yang berkait rapat. Selain spesies Mytilidae, famili IL-17 yang besar juga ditemui dalam spesies moluska lain, termasuk Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis dan Pinctada fucata martensii [13]. Air laut dipenuhi dengan patogen, dan moluska marin sentiasa bersentuhan dengannya, dan oleh itu senjata molekul imun yang kuat diperlukan, seterusnya pengembangan keluarga IL-17 memberikan haiwan ini dengan tindak balas imun yang lebih berkesan.
Terdapat beberapa kajian yang menunjukkan peranan penting yang dimainkan oleh IL-17 dalam imuniti semula jadi haiwan moluska. Sebagai contoh, penyelidikan mendapati bahawa apabila dijangkiti oleh Vibrio harveyi, tahap mRNA IL-17D sangat dikawal dalam Tegillarca granulosa [14], manakala dalam C. gigas, CgIL17-5 menunjukkan tindak balas yang berbeza terhadap Vibrio splendidus [15]. Selain itu, IL-17 moluska telah ditunjukkan untuk bertindak balas kepada banyak corak molekul berkaitan patogen (PAMP), seperti lipopolysaccharide (LPS), polyinosinic: polycytidylic acid (polyI: C) dan peptidoglycan (PGN). LPS ialah komponen utama dinding luar dinding sel bakteria Gram-negatif dan mewakili salah satu perangsang imun yang paling biasa digunakan. Sebaliknya, polyI: C ialah analog RNA beruntai dua yang kerap digunakan sebagai simulator virus dalam penyelidikan saintifik. Selepas rangsangan oleh LPS, ekspresi transkrip gen keluarga IL-17 telah dicetuskan dengan cepat dalam tiram Pasifik C. gigas dan tiram mutiara P. fucata [16,17]. Juga dalam tiram mutiara, PfIL{13}} didapati terlibat dalam tindak balas imun terhadap rangsangan polyI: C [17].
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Di samping itu, ujian luciferase dwi menunjukkan bahawa PfIL-17 dapat mengaktifkan gen sasaran vertebrata yang mengandungi tapak pengikatan NF-kB dan mengambil bahagian dalam laluan isyarat NF-kB dalam sel HEK293 [17]. PGN terdapat dalam dinding sel bakteria Gram-positif dan sering digunakan sebagai mimik untuk bakteria Gram-positif. Rekombinan C. gigas IL17-5 telah terbukti mempunyai pertalian yang kuat dengan PGN, yang tidak pernah dilaporkan dalam interleukin vertebrata [18]. Kajian-kajian ini memberikan permulaan untuk mendedahkan fungsi imunomodulator IL-17 dalam moluska. Sebagai kelas sitokin pro-radang, ekspresi IL{11}} yang berlebihan boleh menyebabkan kerosakan serius pada sel. Organisma telah membangunkan pelbagai mekanisme untuk mengawal tindak balas berlebihan IL-17, yang mana mikroRNA (miRNA) mewakili kelas RNA bukan pengekodan yang paling kuat dan dipelajari dengan baik. MiRNA adalah keluarga RNA pendek kira-kira 22 nt panjang yang boleh mengawal ekspresi gen sasaran dengan penindasan translasi atau degradasi mRNA [19]. Penyelidikan semasa tentang pengawalseliaan IL-17 oleh miRNA terutamanya tertumpu pada kesan sinergiknya dalam penyakit autoimun manusia seperti sklerosis berbilang, arthritis rheumatoid, psoriasis dan lain-lain [20]. Pembangunan teknik penjujukan pemprosesan tinggi dan pengiraan biologi memungkinkan untuk mengimbas miRNA moluska pada tahap genomik, dan sejumlah besar miRNA yang dipelihara dan baru telah dikenal pasti daripada spesies moluska seperti tiram rata Ostrea edulis, tiram Pasifik C. gigas , Lymnaea stagnalis, kupang M. galloprovincialis, dsb. [21–29]. Kajian ini menyediakan data asas dan sokongan yang hebat untuk tafsiran fungsional miRNA dalam moluska. Mengenai peranan imunoregulasi miRNA tertentu dalam moluska, Tian, et al. [30] mendapati bahawa Pm-miR-29a boleh mengawal IL secara positif-17 dalam Pinctada martensii; selepas ekspresi berlebihan Pm-miR-29a, ungkapan IL-17 dalam mantel dan insang spesies telah dikawal selia. Dalam C. gigas, cgi-miR-2d menambah fagositosis hemosit tiram dengan mengawal selia negatif CgIκB2 [31] dan mengawal selia negatif ekspresi gen seperti pengangkut kolin pada peringkat awal jangkitan, yang terlibat dalam imunomodulasi canggih [32].
sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Semasa pengeringan, cgi-miR-365 didapati didorong oleh norepinephrine dan secara langsung mempromosikan ungkapan CgHSP90AA1 [33]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa perancah miRNA659_26519 menyasarkan calmodulin untuk mengawal ekspresi IL-17 dalam fasa awal tindak balas imun C. gigas [34]. Di samping itu, fungsi khusus miRNA tertentu telah diterangkan dalam invertebrata lain, seperti gamat Apostichopus japonicus [35–39] dan udang Litopenaeus vannamei [40]. Kajian-kajian ini telah membuka tabir kepada mekanisme asas miRNA dalam invertebrata dan juga menyediakan rujukan teknikal dan metodologi untuk penyelidikan semasa kami. Dalam kajian terdahulu kami, 26 miRNA dan 667 gen M. coruscus telah dikira secara biologi untuk ekspresi pembezaan selepas cabaran Vibrio alginolyticus, yang mana Mcnovel_miR_145 boleh menyasarkan homolog IL-17 dan terlibat dalam tindak balas imun terhadap jangkitan bakteria [41]. Objektif kajian ini adalah untuk mengenal pasti gen IL-17 dan menyiasat potensi peranannya dalam imuniti semula jadi dan pengawalannya oleh miRNA Mcnovel_miR_145 dalam M. coruscus. Melalui kajian ini, kami berhasrat untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme tindak balas imun moluska dan menjelaskan asas molekul pertahanan imun mereka terhadap patogen. Penyelidikan ini juga boleh memberikan pandangan tentang peraturan RNA bukan pengekodan dalam model invertebrata.
2. Keputusan
2.1. Pencirian McIL-17-3
Urutan cDNA McIL-17-3 yang mengandungi ORF, 30 -UTR dan separa 50 - UTR lengkap telah diklon dalam siliko daripada transkriptom penuh M. coruscus (nombor penyertaan: PRJNA798880, F{ {5}}transkrip_12404). McIL-17-3 mengandungi rantau ORF 585 bp yang mengekodkan 194 asid amino. Berat molekul yang diramalkan ialah 21.77 kDa, dan titik isoelektrik ialah 5.21. Analisis SMART mendedahkan domain IL{14}} biasa dalam protein ini (Rajah 1A). Pokok filogenetik telah dibina dengan merekrut ahli IL{16}} vertebrata dan spesies Mytilidae, dan IL2 digunakan sebagai kumpulan luar. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, IL-17 ini dikumpulkan ke dalam cawangan tertentu untuk membezakannya daripada IL-2s. Dalam kelompok IL-17, dua klad jelas ditunjukkan, satu terdiri daripada IL-17 vertebrata dan satu lagi terdiri daripada IL kerang-17s. Dalam kumpulan IL-17 kupang, McIL-17-3 mula-mula berkumpul dengan molekul yang sepadan daripada spesies Mytilus yang lain, M. galloprovincialis (Rajah 1B).
2.2. Penjajaran Berbilang dan Ramalan Struktur Tertiari
Teras McIL-17-3 terdiri daripada dua pasang helai antiselari; satu pasangan termasuk helai 1 (sisa 52–58) dan 2 (sisa 66–72 dan 77–79), manakala satu lagi termasuk helai 3 (sisa 89–103) dan 4 (sisa 110–125) (Rajah 2B, C) . Dua jambatan disulfida (Cys97/Cys134 dan Cys125/Cys169) masing-masing menyambungkan helai 1 dan 3, 2 dan 4 (Rajah 2A, C). Secara konsisten, IL moluska lain-17 juga mempunyai dua jambatan disulfida ini antara helai 1 dan 3, 2 dan 4 (Rajah 2A, C). Terutama, walaupun IL{32}} vertebrata juga mempunyai dua jambatan disulfida, ia wujud antara 2 dan 4 (Rajah 2A, C).
2.3. Ungkapan Transkrip McIL-17-3
Profil pengedaran tisu transkrip McIL{{0}} telah dinilai oleh qPCR. Transkrip McIL-17-3 telah dinyatakan dalam semua tisu yang diuji, dan tahap ekspresi dalam hemosit dan insang adalah jauh lebih tinggi daripada dalam otot adduktor (Rajah 3A). Ekspresi sementara transkrip McIL{3}} hemocyte sebagai tindak balas kepada cabaran V. alginolyticus turut dinilai. Tahap mRNA McIL-17-3 dikawal dengan ketara pada 3 dan 12 HPC (masing-masing meningkat 3.13- atau 4.35-berbanding 0 HPC), tetapi tiada ketetapan temporal yang jelas secara umum (Rajah 3B).
Rajah 1. Pencirian molekul McIL-17-3. (A) Analisis seni bina domain terpelihara dalam McIL-17-3 menggunakan SMART. Domain IL-17 yang dipelihara telah ditunjukkan. (B) Analisis filogenetik McIL-17-3. Pokok filogenetik telah dibina menggunakan perisian MEGAX dengan 2000 replikasi bootstrap menggunakan kaedah jiran-mencantum. McIL-17-3 telah dilabelkan dengan segi tiga hijau. Spesies yang termasuk dalam pokok filogenetik semuanya telah diambil daripada pangkalan data Genebank, dan nombor penyertaan juga disenaraikan dalam pokok itu. Segitiga hijau bagi pihak McIL-17-3. (Untuk tafsiran rujukan kepada warna dalam legenda angka ini, pembaca dirujuk kepada versi Web artikel ini.)
2.4. Pengaktifan Downstream oleh McIL-17-3
Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, rekombinan McIL-17-3 meningkatkan aktiviti luciferase pGLNF-κB-luc dalam cara yang bergantung kepada dos. Pada 0.5 dan 1.0 µg/telaga, aktiviti luciferase pGLNF-κB-luc masing-masing meningkat 2.07- dan 11.07-kali ganda.
2.5. Pengesahan McIL-17-3 sebagai Gen Sasaran Mc-novel_miR_145
Melalui ramalan bioinformatik, gen McIL{{0}} mengandungi jujukan sasaran standard untuk Mc-novel_miR_145 pada 30 UTR (Rajah 5A). Mimik dan perencat Mc-novel_miR_145 telah ditransfeksi bersama dengan plasmid wartawan UTR McIL{11}} jenis liar ke dalam sel HEK293 untuk mengesahkan korelasinya. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5B, mimik Mc-novel_miR_145 boleh menghalang aktiviti luciferase McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}penurunan kali ganda berbanding kawalan), manakala perencat Mc-novel_miR_145 amat mengurangkan kesannya (1.64-peningkatan kali ganda berbanding dengan Mc-novel_ miR_145 meniru sebagai kumpulan tambahan sahaja). Untuk menilai sama ada Mc-novel{{3{0}}miR_145 secara langsung menyasarkan gen McIL-17-3 melalui tapak sasaran dalam 30 UTR, kami membina versi mutan plasmid wartawan luciferase yang memutasi urutan penyasaran Mc-novel_miR_145 dalam McIL-17-3 30 UTR. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5C, Mc-novel_miR_145 meniru dengan ketara mengurangkan aktiviti luciferase sel yang ditransfeksi dengan McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-lipat ganda menurun), manakala tiada perubahan dalam aktiviti luciferase diperhatikan dalam sel yang ditransfeksi dengan McIL-17-3-30 UTR-MUT. Selain itu, kesan bergantung dos Mc-novel_miR_145 meniru perencatan McIL-17-3-30 aktiviti luciferase UTR-WT juga boleh diperhatikan pada 24 jam selepas pemindahan (0 .71-, 0.43- dan 0.20-penurunan kali ganda berbanding kawalan, masing-masing, Rajah 5D).
Rajah 2. Penjajaran berbilang McIL-17-3 dengan ahli keluarga IL-17 yang lain. (A) Urutan asid amino McIL-17-3 telah diselaraskan dengan IL-17 lain yang diambil daripada kerang dan vertebrata, termasuk tikus dan ikan zebra. Sistein ini, yang membentuk simpulan kanonik, ditandakan dengan hijau, dengan sisa asid amino digantikan dengan tanda merah. Simpulan sistein ditunjukkan oleh garis warna, biru bermakna kehadiran mereka dalam moluska dan merah bermakna kehadiran mereka dalam vertebrata. Nota: Hanya separuh kedua penjajaran jujukan dikekalkan untuk visualisasi. (B) Struktur tertier protein McIL-17-3 telah diramalkan menggunakan model Swiss dan perisian pyMol. Sistein ini, yang membentuk simpulan kanonik, telah ditanda. (C) Gambaran kartun lipatan simpul sistein kanonik. Sisa sistein ditunjukkan oleh bulatan yang diisi; yang terdapat dalam protein IL-17 berwarna kuning, manakala dua yang terlepas berwarna kelabu. (Untuk tafsiran rujukan kepada warna dalam legenda angka ini, pembaca dirujuk kepada versi Web artikel ini.)
Rajah 3. Analisis profil ekspresi transkrip McIL-17-3. (A) Taburan transkrip McIL-17-3 dalam tisu kupang biasa. (B) Perubahan ekspresi sementara transkrip McIL-17-3 sebagai tindak balas kepada cabaran V. alginolyticus. Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0.01). (Untuk tafsiran rujukan kepada warna dalam legenda angka ini, pembaca dirujuk kepada versi Web artikel ini.)
Rajah 4. Pengaktifan wartawan NF-κB oleh McIL-17-3. Vektor rekombinan pEGFP-McIL- 17-3 dalam tiga kepekatan (0.1, 0.5 dan 1.{{10}} µg/perigi) telah ditransfeksi bersama ke dalam sel HEK293 menggunakan Lipo6000TM selama 24 jam. Aktiviti luciferase relatif dikira dengan menormalkan kepada nilai pRLTK. Keputusan eksperimen dinyatakan sebagai perubahan lipatan dengan membandingkan aktiviti luciferase sel yang disebabkan oleh vektor rekombinan dengan sel yang disebabkan oleh vektor kosong pada kepekatan yang sama. Setiap nilai ditunjukkan sebagai min ± SD (n=3), dan bar dengan simbol asterisk adalah berbeza dengan ketara (* p < 0.05, ** p < 0.01).
Rajah 5. Mc-novel_miR_145 sasaran McIL-17-3. (A) Urutan McIL-17-3 30 UTR telah dimasukkan ke dalam vektor pmiR-RB-Report™, masing-masing dibina jenis liar dan plasmid mutan. Urutan Mcnovel_miR{{10}} dan McIL-17-3-30 UTR tapak sasaran dan jujukan tapak mutan telah dilabelkan dengan penanda merah. (B) McIL-17-3-30 plasmid UTR-WT telah ditransfeksi bersama dengan Mc-novel_miR_145 mimic atau Mc-novel_miR{{2{{37} }}} perencat ke dalam sel HEK293. (C) Sel HEK293 telah ditransfeksi dengan McIL-17-3-30 UTR-WT atau jenis mutan McIL-17-3-30 UTR-MUT, bersama-sama dengan Mc-novel_miR_145 atau NC , selama 24 jam. Aktiviti luciferase diukur menggunakan sistem ujian wartawan dwi-luciferase. (D) Percubaan kecerunan kepekatan telah dijalankan untuk pemindahan_miR_145 Mc-novel. Semua data dibentangkan sebagai min ± SD daripada sekurang-kurangnya tiga percubaan tiga kali ganda bebas. **, p < 0.01, *, p < 0.05 berbanding kawalan. (Untuk tafsiran rujukan kepada warna dalam legenda angka ini, pembaca dirujuk kepada versi Web artikel ini.)
2.6. Mc-novel_miR_145 Mengawal Ungkapan McIL secara Negatif-17-3
Hemosit M. coruscus telah ditransfeksi dengan Mc-novel_miR_145 mimic, Mcnovel_miR_145 inhibitor, dan kawalan masing-masing, dan perubahan dalam McIL{{ 5}} telah dinilai pada tahap transkrip dan protein. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6A, ungkapan Mc-novel_miR_145 telah dikawal dengan ketara (peningkatan 8.83-kali ganda) dengan meniru dan dikawal ke bawah ({{14 }}.41-penurunan kali ganda) oleh penindasnya dalam hemosit, mencadangkan kesan berkesan bahan kompaun sintetik ini. Dalam Rajah 6B, ungkapan McIL endogen-17-3 telah dihalang dengan ketara (0.51-penurunan kali ganda) oleh Mc-novel_miR_145 meniru pada tahap transkrip dan teraruh dengan ketara (2.42-peningkatan kali ganda) oleh perencat Mcnovel_miR_145. Untuk menyiasat kesan Mc-novel_miR_145 pada ekspresi McIL-17-3 pada tahap protein, antibodi poliklonal terhadap McIL-17-3 telah dihasilkan. Seperti yang ditunjukkan dalam lorong 2 dan 3 dalam Rajah 6C, protein McIL{35}} rekombinan berjaya dinyatakan dalam E. coli. Kekhususan antibodi diperiksa dengan protein kerang daripada hemosit oleh Western blot. Satu jalur kira-kira 22 kDa, sepadan dengan jisim molekul McIL-17-3, telah diperhatikan (lorong 4 dalam Rajah 6C). Keputusan Western blot dalam Rajah 6D menunjukkan peraturan negatif McIL-17-3 pada tahap protein oleh Mc-novel_miR_145.
Frajah 6. Mc-novel_miR_145 menghalang ekspresi McIL-17-3 dalam M. coruscus hemocytes. (A) Ekspresi Mc-novel_miR_145 dinilai oleh qPCR dalam hemosit yang ditransfeksi dengan 145 mimik, 145 perencat, dan kawalan masing-masing. (B) Selepas pemindahan selama 24 jam, tahap transkripsi McIL-17-3 ditentukan oleh qPCR. (C) Ekspresi rekombinan, penulenan dan penyediaan antiserum untuk McIL-17-3. Lane M, penanda berat molekul protein standard. Lorong 1, kawalan negatif (tanpa induksi). Lorong 2, protein rekombinan teraruh McIL-17-3. Lorong 3, McIL yang telah dimurnikan- 17-3. Lorong 4, Western blot dengan antibodi anti-McIL{{20}} dalam hemosit M. coruscus. (D) Selepas pemindahan selama 24 jam, tahap protein McIL-17-3 ditentukan oleh Western blot. ** p < 0.01 berbanding kawalan
2.7. Apoptosis Hemosit
Kadar apoptosis hemosit bagi empat kumpulan, iaitu, NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS dan Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS dianalisis oleh sitometri aliran menggunakan pewarnaan berganda. Selepas McIL{10}} diekspresikan secara berlebihan, kadar apoptosis hemosit yang dicabar dengan LPS dikawal dengan ketara berbanding kumpulan kawalan (Rajah 7A(a,b), B). Apabila McIL-17-3 ditransfeksi bersama dengan Mc-novel_miR_145, kadar apoptosis hemosit yang disebabkan oleh LPS menurun dengan ketara berbanding dengan McIL-17-3 yang ditransfeksi sahaja (Rajah 7A( b, c), B). Sebaliknya, kadar apoptosis hemocyte menunjukkan peningkatan yang ketara dalam kumpulan Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS berbanding kumpulan McIL-17-3+LPS (Rajah 7A (b,d), B).
Rajah 7. Kadar apoptosis hemosit dinilai oleh sitometri aliran menggunakan propidium iodide (PI) dan pewarnaan FITC-Annexin-V
3. Perbincangan
IL-17 diiktiraf sebagai salah satu keluarga sitokin pro-radang yang penting, yang boleh mengambil bahagian secara berkesan dalam patogenesis pelbagai penyakit [42]. Dalam kajian terdahulu kami, homolog M. coruscus IL-17 menunjukkan ekspresi berbeza sebelum dan selepas jangkitan V. alginolyticus melalui penjujukan transkriptom [41], mencadangkan potensi peranannya dalam tindak balas imun semula jadi terhadap cabaran bakteria. Di sini, kami mencirikan homolog IL-17 ini dan menamakannya McIL-17-3. Ramalan domain berfungsi mendedahkan domain IL-17 biasa, memberikan gabungan gen yang dikenal pasti pada masa ini kepada keluarga sitokin IL-17. Dalam pokok filogenetik, gen IL-17 novel ini menunjukkan pertalian yang sangat rapat dengan IL-17- 3 daripada spesies Mytilus yang lain, M. galloprovincialis. Selain itu, mereka berkongsi identiti asid amino 95% yang sangat tinggi, dan oleh itu kami mencalonkan gen IL-17 novel semasa sebagai McIL-17-3 untuk mengikut konvensyen penamaan yang digunakan dalam spesies Mytilus. Keluarga IL-17 terdiri daripada enam ahli dan lima reseptor pada manusia [43], tetapi ia telah mengalami perkembangan genetik yang besar dalam invertebrata marin, terutamanya dalam kerang [11]. Berdasarkan ini, data kami mencadangkan bahawa McIL{17}} tidak berkaitan secara langsung dengan gen tertentu dalam keluarga IL{18}} manusia. Lipatan simpul sistein yang terletak di -helaian ialah ciri tipikal keluarga IL-17 [5]. Dijangkakan, ramalan struktur tertiari mendedahkan lipatan simpul sistein dalam protein McIL-17-3, seterusnya memperdalam atribusi McIL-17-3 kepada keluarga sitokin IL-17. Untuk meneroka lebih lanjut pembezaan jujukan asid amino IL-17 antara spesies berbeza, beberapa IL-17 kupang tipikal dan Mus musculus IL-17-A kepada IL-17-F dan Danio rerio IL-17-1 kepada IL-17-3 telah dipilih untuk melaksanakan analisis penjajaran berbilang. Keputusan menunjukkan penemuan menarik bahawa kedudukan pautan disulfida IL-17 dalam kerang dan vertebrata adalah tidak konsisten: kedua-dua kaitan disulfida ini wujud antara -helai 1 dan 3, 2 dan 4, masing-masing, dalam kerang, tetapi hanya antara -helai 2 dan 4 dalam vertebrata. Pada tapak sistein pertama dan keempat, IL vertebrata-17 menggantikan sistein dengan serin; Sebaliknya, di tapak sistein kedua, IL kupang-17 menggantikan sistein dengan threoninentiation pada kaitan disulfida dalam kupang dan vertebrata, dan mekanisme asasnya tidak jelas dan memerlukan kajian lanjut. Memandangkan polimorfisme IL-17 dalam kerang, kaitan disulfida antara -helai 1 dan 3 mungkin tidak sekuat antara 2 dan 4, memberikan keplastikan yang lebih besar dalam kerang. Bagaimanapun, analisis domain berfungsi dan struktur tertiari menunjukkan bahawa McIL-17-3 yang dikenal pasti pada masa ini adalah tipikal bagi sitokin IL-17 kupang dan mungkin memainkan peranan fungsi yang serupa dengan rakan sejawatnya dalam moluska. Ekspresi gen IL-17 dalam tisu manusia berbeza-beza, dengan sesetengahnya dinyatakan dalam beberapa sel sahaja dan yang lain dalam sejumlah besar tisu [44,45]. Kebanyakan kajian mengenai moluska menunjukkan bahawa IL-17s mempunyai profil ekspresi konstitutif [13,15,17,46,47]. Namun begitu, Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu dan Yu [47] menunjukkan hasil yang tidak konsisten dalam C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}}, dan -6 sangat diekspresikan dalam insang C. gigas, kelenjar pencernaan dan mantel, tetapi jarang diekspresikan dalam tisu lain. Di sini, transkrip McIL-17-3 ditemui dalam semua tisu yang diperiksa, mencadangkan pelbagai peranan fungsinya dalam pelbagai aktiviti fisiologi. Walau bagaimanapun, tahap ekspresi McIL yang tinggi-17-3 dalam beberapa tisu berkaitan imun moluska, seperti hemosit, insang dan kelenjar pencernaan, mencadangkan penglibatannya yang lebih rapat dengan tindak balas imun. Berikutan, tindak balas pantasnya terhadap serangan V. alginolyticus memperdalam perkara ini. Suntikan V. alginolyticus telah mengawal selia ekspresi McIL-17-3 dengan ketara, dan keputusan serupa juga telah diperhatikan dalam IL moluska lain-17s. Suntikan V. anguillarum ke dalam C. gigas mendorong peningkatan pantas dalam kelimpahan transkrip CgIL-17 dalam hemosit, menunjukkan bahawa ia adalah gen fasa awal imun [46]. Apabila C. gigas mengalami serangan oleh patogen lain, V. splendidus, tahap mRNA CgIL-17-5 dalam hemosit juga meningkat dengan ketara [15]. Rangsangan LPS, komponen patogen utama bakteria, secara mendadak meningkatkan ekspresi PfIL-17 dalam kelenjar pencernaan tiram mutiara P. fucata [17]. Selain itu, LPS boleh mendorong ungkapan CgIL-17-3 dalam C. gigas [47] dan PmIL-17-2 dalam P. fucata martensii [13]. Keputusan ini secara kolektif menunjukkan bahawa IL-17 memainkan peranan penting dalam pertahanan imun moluska terhadap serangan bakteria. Dalam kajian ini, McIL-17-3 menunjukkan kapasiti pengaktifan laluan NF-κB hiliran. Keputusan yang sama juga diperhatikan dalam beberapa spesies moluska. Dalam tiram mutiara P. fucata, PfIL-17 juga mempamerkan pengaktifan laluan NF-κB dalam sel HEK293 oleh ujian wartawan luciferase [17]. Dalam C. gigas, CgIL-17-5 menggalakkan pengaktifan CgMAPK dan translokasi nuklear CgRel dan CgAP-1 untuk mempromosikan ekspresi mRNA sitokin dan peptida antibakteria [15]. Telah ditunjukkan bahawa mod tindakan IL-17 adalah berdasarkan penyatuannya menjadi dimer (homodimer atau heterodimer), yang aktivitinya sangat bergantung pada perlekatannya pada reseptor (IL-17Rs) yang sasaran. Reseptor ini mengandungi domain sitoplasma terpelihara (SEFIR) yang berinteraksi dengan protein penyesuai untuk memulakan laluan transduksi isyarat hiliran untuk mengaktifkan faktor transkripsi seperti NF-κB dan menggalakkan ekspresi gen sasaran imun dan pro-radang, seperti sitokin dan peptida antimikrob. 11,48,49].
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Keputusan ini menunjukkan bahawa moluska IL-17 mungkin mempunyai cara tindakan yang sama seperti rakan mereka dalam vertebrata. Ini perlu disahkan dalam kajian akan datang. Kaitan antara miRNA dan IL-17 telah ditemui dalam beberapa model penyakit manusia. Niimoto, et al. [50] mengesahkan korelasi positif antara miR-146a dan IL-17suatu ungkapan dalam sel mononuklear darah periferal dan sinovium daripada pesakit rheumatoid arthritis dan meringkaskan fungsi penting miR-146a dalam pembezaan sel penghasil IL-17-. Dalam pesakit psoriasis, miR-146a bertindak sebagai perencat kuat IL-17-keradangan kulit yang didorong oleh IL, dan tahap rendahnya boleh menyumbang kepada permulaan penyakit awal pada individu yang terdedah secara genetik [51]. MiR-146a boleh memperbaiki periodontitis dengan mengawal selia ekspresi IL-17 dan menghalang pembiakan sel stem ligamen periodontal manusia [52]. MiR-155 mengawal selia ekspresi IL-17 secara negatif untuk mengambil bahagian dalam tindak balas imun hos kepada radang paru-paru bakteria postviral dalam paru-paru tikus; Tikus yang dihalang miR-155 menunjukkan ekspresi IL-17 yang lebih kuat dalam paru-paru, disertai dengan pembersihan bakteria yang lebih baik [53]. Kajian ini mencadangkan bahawa IL-17 dikawal oleh berbilang miRNA dan berbeza mengikut penyakit dan jenis sel [20]. Dalam kajian terdahulu, kami melakukan analisis bersepadu miRNAome dan transkriptom untuk meneroka peraturan interaktif miRNA-mRNA oleh M. coruscus sebagai tindak balas kepada jangkitan V. alginolyticus. Keputusan meramalkan bahawa Mc-novel_miR_145 boleh menyasarkan McIL-17-3 untuk mengambil bahagian dalam tindak balas imun semula jadi kepada jangkitan bakteria [41]. Bertujuan untuk meneroka mekanisme asas peraturan Mcnovel_miR_145 McIL-17-3 secara mendalam, satu siri eksperimen makmal telah dijalankan dalam kajian ini. Pengiraan meramalkan bahawa Mc-novel_miR_145 boleh menyasarkan 30 UTR McIL-17-3. Ujian wartawan luciferase berikut dilakukan dalam sel HEK293 yang ditransfeksi bersama oleh Mc-novel_miR_145 mimic, mimic NC, inhibitor, inhibitor NC with McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT reporter plasmid seterusnya mengesahkan perkara ini. Selanjutnya, Mc-novel_miR_145 mimic, mimic NC, inhibitor dan inhibitor NC telah dipindahkan ke M. coruscus hemocytes untuk menilai kesannya pada ekspresi McIL-17-3 pada tahap transkrip dan protein . Ungkapan McIL-17-3 dikawal dengan ketara ke bawah dalam kumpulan pemindahan_miR_145 Mc-novel, manakala dikawal dengan ketara dalam Mc-novel_miR _145 kumpulan pemindahan perencat, mencadangkan peraturan negatif McIL-17-3 oleh Mc-novel_miR_145. Keputusan semasa adalah bertentangan dengan kajian terdahulu. Dalam Pinctada martensii, Tian, Zheng, Huang, Jiao dan Du [30] mendapati bahawa walaupun Pm-miR-29a boleh menyasarkan IL-17, peraturan itu adalah positif, seperti ungkapan IL{{ 65}} dalam mantel dan insang Pinctada martensii dikawal selia selepas ekspresi berlebihan Pm-miR-29a. Memandangkan P. martensii dan M. coruscus kedua-duanya tergolong dalam bivalves dan berkait rapat, keputusan yang tidak konsisten ini menunjukkan bahawa peraturan IL-17 dalam moluska mungkin berbeza dengan miRNA. Selain daripada ini, tiada literatur telah melaporkan korelasi antara miRNA dan IL-17s dalam moluska, dan oleh itu tiada lagi kajian selari untuk membandingkan keputusan semasa. Walau bagaimanapun, beberapa kajian telah melaporkan hubungan penyasaran antara miRNA tertentu dan gen berkaitan imun khusus dalam moluska.
Contohnya, cgi-miR-2d menambah fagositosis hemosit tiram dengan mengawal selia CgIκB2 secara negatif dalam Crassostrea gigas [31]. Selain itu, cgi-miR-2d juga secara negatif mengawal ekspresi satu gen seperti pengangkut kolin untuk mengambil bahagian dalam imunomodulasi canggih hemosit tiram semasa peringkat awal jangkitan [32]. Kajian ini sekurang-kurangnya mencadangkan bahawa miRNA memainkan peranan yang berpotensi dalam isyarat imun semula jadi dengan menyasarkan gen tertentu dalam moluska, sama seperti yang mereka lakukan dalam vertebrata. Seterusnya, kami berusaha untuk meneroka potensi fungsi interaksi antara Mcnovel_miR_145 dan McIL{{10}} dalam imuniti semula jadi M. coruscus, dan peranannya dalam Apoptosis yang disebabkan oleh LPS adalah tumpuan perhatian kami. LPS ialah molekul yang sangat proinflamasi yang merupakan komponen sampul luar semua bakteria Gram-negatif. LPS telah ditunjukkan untuk mendorong apoptosis dalam pelbagai sel dan tisu, seperti makrofaj [54], sel endothelial [55], dan paru-paru tikus [56]. Eksperimen awal telah menunjukkan bahawa pendedahan LPS pada kepekatan nominal 0.1 mg/mL selama 24 jam secara signifikan menyebabkan apoptosis hemosit daripada M. coruscus. Selepas ekspresi berlebihan McIL{19}}, tahap apoptosis hemosit M. coruscus telah meningkat dengan ketara berbanding dengan kumpulan kawalan, menunjukkan bahawa McIL-17-3 mungkin menguatkan apoptosis hemosit yang disebabkan oleh LPS dalam M. coruscus. Keputusan semasa adalah konsisten dengan beberapa kajian terdahulu. Dalam neutrofil manusia, IL-17A boleh mengurangkan kesan anti-apoptosis yang dimediasi oleh faktor rangsangan koloni makrofaj granulosit [57]. IL-17 mendorong apoptosis sel endothelial vaskular, yang merupakan mekanisme berpotensi sindrom koronari akut [58]. Pemadaman genetik IL-17A mengurangkan apoptosis sel alveolar jenis II dan dengan itu mengurangkan penyakit pulmonari obstruktif kronik [59]. Walau bagaimanapun, masih terdapat beberapa hujah yang bertentangan. Apabila tikus dijangkiti oleh virus murine encephalomyelitis Theiler, IL-6 dan IL-17 secara sinergistik menggalakkan kegigihan virus dengan menghalang apoptosis selular [60]. Konflik ini menunjukkan bahawa mekanisme asas apoptosis pengantara IL-17-adalah kompleks dan IL-17 mungkin memainkan fungsi yang bertentangan bergantung pada jenis jangkitan.
Apabila McIL-17-3 ditransfeksi bersama dengan Mc-novel_miR_145, tahap apoptosis yang disebabkan oleh LPS dikawal dengan ketara ke bawah berbanding dengan satu-satunya McIL-17-3 yang ditransfeksi kumpulan, sejajar dengan itu, tahap apoptosis dikawal dengan ketara selepas McIL-17-3 ditransfeksi bersama dengan Mc-novel_miR_145 inhibitor. Mc-novel_miR_145 telah ditunjukkan untuk mengawal selia McIL-17-3 secara negatif, dan oleh itu kami membuat kesimpulan bahawa McIL-17-3 memburukkan lagi apoptosis hemosit yang disebabkan oleh LPS, manakala Mc-novel _miR_145 mengurangkan kesannya. Beberapa miRNA yang telah terbukti terlibat dalam apoptosis sel manusia dan tetikus telah dikenal pasti dalam moluska dalam beberapa tahun kebelakangan ini. Sebagai contoh, miR-125b dan miR- 335 ditemui dalam tiram rata Ostrea edulis [21], miR-184 ditemui dalam hemosit tiram Crassostrea gigas [23] dan miR{{ 26}}, -29, -96, -182, dan -193 ditemui dalam sistem saraf pusat yang menjana semula L. stagnalis [25]. MiRNA berkaitan apoptosis ini dikenal pasti melalui penjujukan tinggi dan pengiraan biologi mengesahkan kewujudan apoptosis yang dimediasi miRNA dalam moluska. Chen et al. melaporkan peningkatan peraturan miR-2d selepas cabaran Vibrio splendidus dalam hemosit Crassostrea gigas. Ekspresi berlebihan miR-2d dikaitkan dengan ekspresi mengetuk ke bawah IκB2, dan peningkatan ketara dalam kadar fagositosis hemosit, dikaitkan dengan penindasan apoptosis [31]. Hasilnya konsisten dengan kajian semasa kami, secara kolektif, seolah-olah menyiratkan bahawa miRNA mempunyai fungsi perencatan pada apoptosis sel dalam moluska. Malah, kebanyakan miRNA berkaitan apoptosis pada manusia telah menunjukkan kesan perencatan pada apoptosis. MiR-146 melindungi sel A549 dan H1975 daripada apoptosis yang disebabkan oleh LPS dan kecederaan keradangan melalui Sirt1 yang mengawal selia sehingga menyekat laluan NF-κB dan Notch [61]. Tambahan pula, miR-146 melemahkan penyinaran dan apoptosis hepatosit yang disebabkan oleh LPS melalui perencatan laluan TLR4 [62]. MiR-93 menghalang apoptosis kondrosit dalam osteoarthritis dengan menyasarkan laluan isyarat TLR4/NF-κB [63]. MiR-129-5p mengurangkan kecederaan saraf tunjang pada tikus melalui penindasan apoptosis melalui laluan HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. Walau bagaimanapun, masih terdapat beberapa miRNA khusus yang menunjukkan tindakan pengukuhan pada apoptosis. Sebagai contoh, miR-203 didapati mempercepatkan apoptosis yang disebabkan oleh LPS dengan menyasarkan PIK3CA dalam sel epitelium alveolar [65]. Keputusan ini mencadangkan kerumitan mekanisme asas apoptosis pengantara miRNA.
4. Bahan dan Kaedah
4.1. Reka bentuk eksperimen
Pertama, McIL-17-3 telah dikenal pasti dan dicirikan daripada M. coruscus melalui analisis bioinformatik. Berikutan itu, pengedaran tisu transkrip McIL-17-3 serta tindak balasnya terhadap cabaran bakteria telah dinilai oleh ujian PCR (qPCR) masa nyata kuantitatif. Seterusnya, perkaitan antara McIL-17-3 dan Mc-novel_miR_145 ditentukan oleh analisis wartawan luciferase yang dilakukan dalam sel HEK293 dan M. coruscus hemocytes. Di samping itu, peranan fungsi mereka dalam apoptosis yang disebabkan oleh LPS dinilai oleh sitometri aliran.
4.2. Air Laut Buatan
Selepas tiga hari pengudaraan air paip perbandaran, kristal laut segera (Haiding LTD, Ji'an, China) telah ditambah, dikacau dengan teliti dan dicairkan untuk mencapai kemasinan 30‰. Air laut buatan yang dikonfigurasikan perlu diudara selama 2 jam sebelum digunakan.
4.3. Haiwan
Kupang bercengkerang tebal M. coruscus (panjang cangkerang, 9.82 ± 0.53 sm; lebar cangkerang, 4.68 ± 0.45 sm; berat basah, 71.2 ± 2.7 g) dibeli dari pasar Donghe di Zhoushan, Wilayah Zhejiang, China. Semua kupang disimpan dalam tangki yang diisi dengan ASW kira-kira 25 ◦C dan kemasinan 30‰ selama lebih daripada seminggu sebelum eksperimen seterusnya.
4.4. Pengenalan cDNA McIL{2}}
Homolog IL-17 (McIL-17-3) telah diklon dalam siliko daripada transkrip penuh M. coruscus (nombor penyertaan: PRJNA798880, F01_transkrip_12404). Prosedur Blast dilakukan untuk meramalkan jujukan asid amino McIL-17-3 yang diduga, diikuti dengan analisis domain berfungsi dengan SMART dan penilaian hubungan filogenetik dengan MEGA-X. Penjajaran berbilang dilakukan menggunakan prosedur ClustalW. Model dan kumpulan Switzerland digunakan untuk meramalkan struktur tertier protein McIL-17-3. Prosedur terperinci adalah mengikut kajian terdahulu kami [66].
4.5. Ujian PCR Masa Nyata Kuantitatif
Ujian PCR masa nyata kuantitatif (qPCR) ialah alat yang berkuasa untuk mengesan dan mengukur tahap ekspresi gen. Di sini, taburan tisu McIL-17-3 telah dinilai menggunakan kaedah qPCR. Di samping itu, perubahan dalam ekspresi mRNA McIL-17-3 sebagai tindak balas kepada jangkitan bakteria juga dikesan oleh qPCR. Profil pengedaran tisu McIL-17-3 ditentukan dalam insang, mantel, kelenjar pencernaan, gonad, otot adduktor dan hemosit menggunakan qPCR yang diprogramkan pada 95 ◦C selama 10 min, diikuti dengan 40 kitaran 95 ◦C selama 10 s, 60 ◦C selama 45 s. Tisu-tisu ini telah dibedah daripada sembilan individu kupang dan dikumpulkan bersama untuk mengurangkan pembezaan individu. Dalam eksperimen cabaran bakteria, V. alginolyticus hidup digunakan sebagai rangsangan imun. Isipadu 100 µL bakteria yang dilarutkan dalam air laut (1 × 108 CFU mL−1 ) telah disuntik ke dalam adductor kupang. Tiada kupang yang disuntik digunakan sebagai kawalan. Sembilan kupang diambil secara rawak daripada setiap kumpulan pada 0, 3, 6, 12, 24, dan 36 jam selepas cabaran (hpc). Hemosit daripada tiga kupang dikumpulkan bersama untuk dianggap sebagai satu sampel, dan terdapat tiga sampel untuk setiap titik masa. MikroRNA telah diekstrak menggunakan Kit Pengekstrakan miRNA (HaiGENE, Cat. No.: B1802), dan cDNA telah disintesis menggunakan miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, Cat. No.: 4992786) dan qPCR dilakukan menggunakan Kit miRcute Plus miRNA qPCR (Tiangen, Cat. No.: 4992887). Gen U6 dan -actin digunakan sebagai rujukan dalaman untuk qPCR dan miRNAs qPCR, masing-masing. Pasangan primer khusus yang digunakan dalam eksperimen ini disenaraikan dalam Jadual 1. Tahap ekspresi relatif diukur menggunakan kaedah 2−∆∆Ct [67].
Jadual 1. Pasangan primer PCR telah digunakan dalam kajian ini.
4.6. Kultur sel
Sel HEK293 mamalia (RiboBio Ltd., Guangzhou, China) telah digunakan untuk melakukan ujian wartawan luciferase untuk menentukan pengaktifan hiliran oleh McIL- 17-3 serta perkaitan antara Mc-novel_miR{{ 4}} dan McIL-17-3. Sel HEK293 telah dibiakkan dalam medium OPTI-MEM (GIBCO) pada 37 ◦C, 5% CO2. Untuk meneroka lebih lanjut peraturan McIL-17-3 oleh Mc-novel_miR_145 dan peranan fungsinya dalam apoptosis yang disebabkan oleh LPS, hemosit M. coruscus telah diambil daripada otot adduktor setiap kupang dengan 0.5 mm diameter (25 G) jarum pakai buang yang mengandungi 0.5 mL antikoagulan. Hemosit dikumpul melalui sentrifugasi selama 5 minit pada 3000 rpm, 4 ◦C, dan 0.25% trypsin (Solarbio) telah ditambah. Hemosit digantung dalam medium L-15 yang mengandungi 15% serum lembu janin (Solarbio) dan dikultur pada suhu 26 ◦C dengan 5% CO2.
4.7. Sintesis miRNA Mimic dan Inhibitor
Mc-novel_miR_145 mimik, perencat dan nukleotida kawalan telah digubah oleh GenePharma (Shanghai). Urutannya adalah seperti berikut: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Perencat Mc-novel_miR_145, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (diubah suai secara kimia oleh 20 Ome); kawalan negatif meniru, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; dan perencat kawalan negatif, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (diubah suai secara kimia oleh 20 Ome).
4.8. Analisis Wartawan Luciferase
Ujian wartawan Luciferase digunakan secara meluas untuk mengkaji ekspresi gen dan aktiviti pengawalseliaan. Jumlah cahaya yang dihasilkan adalah berkadar dengan jumlah enzim luciferase yang dihasilkan, yang seterusnya mencerminkan aktiviti elemen pengawalseliaan. Aktiviti luciferase kemudiannya diukur menggunakan luminometer, dan hasilnya dianalisis dan ditafsirkan untuk menentukan aktiviti pengawalseliaan unsur yang dikaji. Ujian wartawan Luciferase digunakan untuk menganalisis pengaktifan hiliran McIL{{0}}. Dalam percubaan ini, plasmid pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5 dan 1.0 µg/well) bersama-sama dengan pGLNF-κb- plasmid reporter luc (0.25 µg/well) telah ditransfeksi bersama ke dalam sel HEK293 menggunakan Lipo6000TM selama 24 jam. Plasmid pEGFP-N1 kosong digunakan sebagai kawalan. Aktiviti Luciferase diukur menggunakan Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) mengikut spesifikasi, dengan Renilla luciferase digunakan sebagai intercontrol. Mc-novel_miR_145 menyasarkan McIL-17-3 turut disahkan oleh ujian wartawan luciferase. Pengiraan bioinformatik meramalkan bahawa Mc-novel_miR_145 boleh menyasarkan 30 -UTR McIL-17-3, dan seterusnya mengklon 30 -UTR of McIL{{ 29}} ke dalam vektor wartawan luciferase pmiR-RB-ReportTM untuk membina plasmid wartawan McIL-17-3-30 UTR-WT liar. Vektor wartawan McIL{35}} UTR-MUT jenis mutan telah dibina dengan memutasi nukleotida pada tapak 1023–1040: TCCGAAGCGCTTTTCTGG kepada AGGCTTCGCGAAGACC. RNA oligo (Mc-novel_miR_196 NC, mimic, NCi, inhibitor) telah dipindahkan bersama-sama dengan McIL-17-3- 3 0 UTR-WT atau McIL-17-3-30 UTR-MUT ke HEK293 sel menggunakan Lipo6000TM.
4.9. Ekspresi Rekombinan, Pemurnian dan Penyediaan Antiserum
Untuk menilai kesan Mc-novel_miR_145 pada ekspresi protein McIL-17-3, antiserum McIL-17-3 telah disediakan. Serpihan cDNA yang meliputi bingkai bacaan terbuka (ORF) McIL-17-3 telah dikuatkan dengan satu pasangan primer tertentu (Jadual 1) dan dimasukkan ke dalam pET-32vektor. PET plasmid rekombinan-32a-McIL{{10}} telah diubah menjadi Escherichia coli (DE3) (Takara) dan diinkubasi dalam medium LB (mengandungi 50 mg L−1 kanamycin) pada 37 ◦C dengan goncangan pada 130 rpm selama 4 jam. Selepas ketumpatan optik mencapai penyerapan 0.6 pada 600 nm, isopropyl-beta-D-thiogalactopy inside (IPTG) dengan kepekatan akhir 1 mM telah ditambah kepada larutan bakteria untuk mendorong ekspresi McIL rekombinan{ {24}} protein (rMcIL-17-3). Selepas pengeraman pada 37 ◦C selama 6 jam, medium telah disentrifugasi pada 8000 rpm selama 30 minit untuk mengumpul bakteria, diikuti dengan penggantungan dalam penimbal TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0). rMcIL-17-3 telah disucikan oleh kromatografi pertalian asid Ni-nitrilotriacetic (NI-NTA), dan protein yang telah disucikan telah dialisis daripada imidazole selama 24 jam. Protein yang terhasil telah diasingkan dengan mengurangkan 12% elektroforesis gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE). Protein yang telah disucikan telah dilipat semula dalam penimbal gliserol urea-TBS kecerunan (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, glutation terkurang 2 mM, gliserol 10%, glutation oksida 0.2 mM, kepekatan urea kecerunan 6, 24, 3, , 1, dan 0 M urea dalam setiap kecerunan, pH 7.4, setiap kecerunan pada 4 ◦C selama 12 jam). Kemudian, protein yang terhasil digunakan untuk mengimunkan 6-tikus berumur seminggu untuk memperoleh antibodi poliklonal.
4.10. Western Blotting
Sampel protein diekstrak daripada hemosit dengan penimbal lisis RIPA (Beyotime), dan kemudian kepekatan dikesan dengan kit BCA. Selepas diasingkan oleh SDS-PAGE, protein dipindahkan ke membran PVDF dengan pengedap sebanyak 5% susu tepung skim dalam TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), diikuti oleh antibodi terhadap pengeraman McIL-17-3 semalaman. Selepas itu, membran diinkubasi dengan larutan cair antibodi IgG anti-tikus kambing dan konjugat alkali fosfatase (Thermo Fisher Scientific, Cat. No.: 31324) dalam penimbal pencairan antibodi sekunder (Beyotime, P0258) selama 3 jam. Akhirnya, protein imunoreaktif dikesan oleh sistem pengesanan ECL.
4.11. Apoptosis
Apoptosis hemosit dinilai menggunakan cytometry aliran mengikut manual Kit Pengesanan Apoptosis FITC-Annexin-V (Beyotime). Secara ringkas, hemosit yang dikumpul telah dirawat selama 24 jam dengan LPS (0.1 mg/mL), 20 nM pEGFP-McIL-17-3 plasmid, novel Mc_miR{{9} } mimic, dan Mc-novel_miR_145 inhibitor. Selepas mencuci dengan PBS, sel-sel itu digantung semula dalam medium L15 pada kepekatan akhir 1 × 106 sel mL−1 dan diwarnai dengan FITC-Annexin-V dan PI dengan diinkubasi pada suhu bilik selama 25 minit dalam gelap. . Akhir sekali, instrumen sitometri aliran (Beckman CytoFLEX FCM) digunakan untuk mengesan apoptosis sel, dan data dianalisis menggunakan perisian FlowJoTM 10. 4.12. Analisis Statistik Keputusan eksperimen dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Hasilnya diproses menggunakan analisis varians ANOVA dua hala dengan ujian perbandingan berbilang Tukey, dan perisian Origin2021 digunakan untuk menganalisis data dan membina angka.
sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche
5. Kesimpulan
Dalam kajian ini, homolog IL-17 novel, McIL-17-3, telah dikenal pasti daripada M. coruscus dan didapati memainkan peranan penting dalam pertahanan imun moluska terhadap serangan bakteria. Selain itu, didapati bahawa McIL-17-3 dikawal secara negatif oleh Mc-novel_miR_145, yang menyumbang kepada penyertaannya dalam apoptosis yang disebabkan oleh LPS. Hasil kajian ini memberikan cerapan berharga tentang peranan pengawalseliaan IL-17 dalam tindak balas imun kerang dan menyerlahkan potensi RNA bukan pengekodan dalam mengawal selia mekanisme pertahanan imun invertebrata. Walau bagaimanapun, adalah penting untuk diperhatikan bahawa beberapa batasan wujud dalam kajian ini. Khususnya, mekanisme yang mendasari mod tindakan McIL-17-3 tidak dikaji dan memerlukan penyiasatan lanjut. Selain itu, kajian ini hanya menumpukan pada interaksi antara Mc-novel_miR_145 dan McIL-17-3 dan tidak meneroka kemungkinan penglibatan miRNA lain dalam tindak balas imun. Secara keseluruhan, kajian ini menekankan peranan penting RNA bukan pengekodan dalam mekanisme pertahanan imun dan mencadangkan bahawa modulasi mereka boleh berfungsi sebagai strategi yang berpotensi untuk terapi sasaran untuk pelbagai penyakit.
Rujukan
1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Kekebalan semula jadi. N. Inggeris. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]
2. Lacy, P.; Stow, JL Pembebasan sitokin daripada sel imun semula jadi: Persatuan dengan laluan pemerdagangan membran yang pelbagai. Darah J. Am. Soc. Hematol. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]
3. Dinarello, CA Sitokin proinflamasi. Dada 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]
4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Sistem imun dan tindak balas imun dalam ikan dan peranannya dalam kajian imuniti perbandingan: Model untuk organisma yang lebih tinggi. Immunol. Lett. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]
5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17s mengamalkan lipatan simpulan sistin: Struktur dan aktiviti sitokin baru, IL-17F dan implikasi untuk pengikatan reseptor. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]
6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, faktor JP IL17 adalah pengawal selia awal dalam epitelium usus semasa tindak balas keradangan kepada Vibrio dalam larva landak laut. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]
7. Cua, DJ; Tato, CM Innate IL-17-sel penghasil: Sentinel sistem imun. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 479–489. [CrossRef]
8. Kilang, KH IL-17 dan IL-17-menghasilkan sel dalam perlindungan berbanding patologi. Nat. Rev. Immunol. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]
9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Repertoir gen imun dikodkan dalam genom landak laut ungu. Dev. biol. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]
10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Genom sotong dan evolusi kebaharuan saraf dan morfologi cephalopod. Alam 2015, 524, 220–224. [CrossRef]
11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Evolusi dan kepelbagaian interleukin-17 menyerlahkan pengembangan dalam invertebrata marin dan peranannya yang dipelihara dalam imuniti mukosa. Depan. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]
12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Variasi kehadiran-ketiadaan gen yang besar membentuk pan-genom terbuka dalam kupang Mediterranean. Genome Biol. 2020, 21, 1–21. [CrossRef]
13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Analisis evolusi dan fungsi gen interleukin-17 daripada Pinctada fucata martensii. Immunol Kerang Ikan. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]
14. Wang, Q.; Xiao, G.; Peluk.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interleukin-17D mengantara perubahan berkaitan jangkitan Vibrio harveyi dalam Tegillarca granulosa melalui pengaktifan protein pengaktif 1 dalam vivo. Akuakultur 2023, 566, 739178. [CrossRef]
15. Lv, X.; Matahari, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 mengawal selia ekspresi mRNA pengesan imun melalui mendorong fosforilasi CgMAPK dan translokasi nuklear CgRel dan CgAP-1 dalam tiram Pasifik Crassostrea gigas. Dev. Komp. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]
16. Wang, L.; Matahari, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 mengawal selia ungkapan IL17-4 dan IL17-5 dalam tiram Pasifik Crassostrea gigas. Immunol Kerang Ikan. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]
17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Dia, M.-X. Interleukin-17 dalam tiram mutiara (Pinctada fucata): Pengklonan molekul dan pencirian fungsi. Immunol Kerang Ikan. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]
18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, sitokin radang purba dalam Crassostrea gigas yang mempamerkan fungsi heterogen berbanding dengan molekul interleukin17 vertebrata. Dev. Komp. Immunol. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]
19. Denli, AM; Puncak, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Pemprosesan mikroRNA primer oleh kompleks Mikropemproses. Alam 2004, 432, 231–235. [CrossRef]
20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Peraturan IL-17 dalam penyakit autoimun oleh faktor transkripsi dan mikroRNA. Depan. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]
21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Peranan mikroRNA dalam proses imuniti tiram rata Ostrea edulis terhadap bona miosis. Jangkitan. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]
22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Pengenalpastian mikroRNA yang dipelihara dan baru dalam tiram Pasifik Crassostrea gigas melalui penjujukan dalam. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]
23. Zhou, Z.; Wang, L.; Lagu, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Pengenalpastian dan ciri-ciri mikroRNA berkaitan imun dalam hemosit tiram Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]
24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Peraturan mikroRNA yang berpotensi bagi gen berkaitan imun dalam hemosit invertebrata. Sci. Total Alam Sekitar. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]
25. Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, A.; Carlone, RL Pengenalpastian dan pencirian mikroRNA semasa penjanaan semula yang disebabkan oleh asid retinoik sistem saraf pusat moluska. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]
26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. Tindak balas tekanan pengantaraan MicroRNA dalam spesies bivalve. Ecotoxicol. alam sekitar. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]
27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Penemuan dan pemahaman fungsi miRNA dalam moluska: Pendekatan profil seluruh genom. RNA Biol. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]
28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Menggali miRNAomes bivalve: Antara pemuliharaan dan inovasi. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]
29. Matahari, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, J.; Liu, Z. Tanda tangan ekspresi MicroRNA dalam otot adduktor berjalur dan licin Yesso scallop Patinopecten yessoensis. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]
30. Tian, R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a mengambil bahagian dalam pembentukan nacre dan tindak balas imun dengan menyasarkan Y2R dalam Pinctada martensii. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]
31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. MikroRNA khusus invertebrata dan respon imun meningkatkan fagositosis hemosit tiram dengan menyasarkan CgIκB2. Sci. Rep. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]
32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. MiRNA khusus invertebrata menyasarkan sistem neuroendokrin kolinergik purba tiram. Buka Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]
33. Chen, H.; Xin, L.; Lagu, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. MiRNA yang responsif norepinephrine secara langsung menggalakkan ekspresi CgHSP90AA1 dalam hemosit tiram semasa pengeringan. Immunol Kerang Ikan. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]
34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Calmodulin yang disasarkan oleh perancah miRNA659_26519 mengawal ekspresi IL-17 dalam tindak balas imun awal tiram Crassostrea gigas. Dev. Komp. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]
35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 memodulasi aktiviti antibakteria coelomocytes dan penyebuan LPS melalui penyasaran Tollip dalam Apostichopus japonicus. Immunol Kerang Ikan. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]
36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 memodulasi letusan pernafasan dalam Apostichopus japonicus coelomocytes melalui penyasaran reseptor seperti Tol. Dev. Komp. Immunol. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]
37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a mengawal selia apoptosis coelomocytes dalam gamat Apostichopus japonicus melalui penyasaran Aj14-3-3ζ dalam vivo. Immunol Kerang Ikan. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]
38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 memautkan metabolisme lipid dan apoptosis sel dalam Apostichopus japonicus yang dicabar bakteria melalui penyasaran CTRP9. Depan. Immunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]
39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 daripada Apostichopus japonicus menyekat tindakan apoptosis coelomocyte sebagai miR-92span untuk mengawal ekspresi Bax sebagai tindak balas kepada jangkitan Vibrio splendidus. Akuakultur 2023, 562, 738812. [CrossRef]
40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; Dia, J.; Xu, X. A MicroRNA-1–Rencatan Pengantaraan Laluan NF-κB oleh Laluan JAK-STAT dalam Invertebrata Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]
41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. Analisis bersepadu miRNAome dan transkriptom mendedahkan peraturan rangkaian miRNA-mRNA dalam Vibrio alginolyticus yang dijangkiti kupang kulit tebal Mytilus coruscus. Mol. Immunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]
42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martín, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Peranan kritikal interleukin (IL)-17 dalam gangguan keradangan dan imun: Kajian terkini bukti yang memfokuskan dalam kontroversi. Autoimun. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]
43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 keluarga sitokin. J. Klin Alahan. Immunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]
44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Kelebihan: IL-17D, ahli baru keluarga IL-17, merangsang pengeluaran sitokin dan menghalang hemopoiesis. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]
45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. Keluarga sitokin IL-17. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]
46. Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Pengumpulan pantas transkrip homolog interleukin 17 dalam hemosit Crassostrea gigas berikutan pendedahan bakteria. Dev. Komp. Immunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]
47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Analisis pencirian dan ekspresi genom bagi lima gen IL-17 novel dalam tiram Pasifik, Crassostrea gigas. Immunol Kerang Ikan. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]
48. Gaffen, SL Struktur dan isyarat dalam keluarga reseptor IL-17. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]
49. Hata, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 merangsang tindak balas keradangan melalui laluan NF-κB dan MAP kinase dalam myofibroblas kolon manusia. Am. J. Physiol. -ujian gastrousus. Fisiol Hati. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]
50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a mengekspresikan dalam interleukin-17 menghasilkan sel T dalam pesakit arthritis rheumatoid. Muskuloskelet BMC. Kecelaruan. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]
51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a menindas IL-17–peradangan kulit dan dikaitkan secara genetik dengan psoriasis. J. Klin Alahan. Immunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]
52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG microRNA-146a merendahkan IL-17 dan IL-35 dan menghalang pembiakan sel stem ligamen periodontal manusia. J. Sel. Biokim. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]
53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 mengawal tindak balas imun hos kepada pneumonia bakteria pasca virus melalui laluan IL-23/IL-17. Am. J. Physiol. -Sel Paru-paru. Mol. Fisiol. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]
54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS mendorong apoptosis dalam makrofaj kebanyakannya melalui pengeluaran autokrin TNF- . Darah J. Am. Soc. Hematol. 2000, 95, 3823–3831.
55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Mekanisme apoptosis endothelial yang disebabkan oleh lipopolysaccharide bakteria. Am. J. Physiol.-Sel Paru-paru. Mol. Fisiol. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]
56. Loyang, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Penyedutan LPS kronik menyebabkan perubahan seperti emfisema dalam paru-paru tikus yang dikaitkan dengan apoptosis. Am. J. Respirator. Sel Mol. biol. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]
57. Naga, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 melemahkan kesan anti-apoptosis GM-CSF dalam neutrofil manusia. Mol. Immunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]
58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Mac.; Zhang, L. IL-17 mendorong apoptosis sel endothelial vaskular-Mekanisme yang berpotensi untuk sindrom koronari akut manusia. Clin. Immunol. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]
59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Pemadaman genetik IL-17A mengurangkan keradangan akibat asap rokok dan apoptosis sel alveolar jenis II. Am. J. Physiol. -Sel Paru-paru. Mol. Fisiol. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]
60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) dan IL-17 secara sinergistik menggalakkan kegigihan virus dengan menghalang apoptosis selular dan fungsi sel T sitotoksik. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]
61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 melindungi sel A549 dan H1975 daripada apoptosis akibat LPS dan kecederaan keradangan. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]
62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p melemahkan pengaktifan sel stellate hepatik akibat penyinaran dan LPS dan apoptosis hepatosit melalui perencatan laluan TLR4. Kematian Sel Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]
63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 menghalang apoptosis kondrosit dan keradangan dalam osteoarthritis dengan menyasarkan laluan isyarat TLR4/NF-κB. Int. J. Mol. Med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]
64. Wan, G.; An, Y.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p mengurangkan kecederaan saraf tunjang pada tikus melalui menekan apoptosis dan tindak balas keradangan melalui laluan HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]
65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 mempercepatkan apoptosis dalam sel epitelium alveolar yang dirangsang LPS dengan menyasarkan PIK3CA. Biokim. Biophys. Res. Commun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]
66. Qi, P.; Tang, Z. Molekul Nrf2 mencetuskan pertahanan antioksidan terhadap pendedahan benzo(a)pirena akut dalam kupang kulit tebal Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]
67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Menganalisis data PCR masa nyata dengan kaedah CT perbandingan. Nat. Protoc. 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]