Kesan Ekstrak Sargassum Thunbergii Pada Pemutihan Kulit Dan Anti-Kedutan Melalui Perencatan TRP-1 Dan MMP

Kenalan: ali.ma@wecistanche.com

Da-Hye Gam 1, Jae-Hyun Park 1, Ji-Woo Hong 1, Seong-Jin Jeon 1, Jun-Hee Kim 1 dan Jin-Woo Kim 1,2,*

Abstrak: Sargassum thunbergiitelah digunakan secara tradisional sebagai bahan yang boleh dimakan dan perubatan negara-negara inoriental. Walau bagaimanapunpemutihan kulitdananti kedutkesan S. thunbergii belum lagi disiasat. Kajian ini dijalankan untuk mewujudkan keadaan pengekstrakan yang optimum bagi penghasilan sebatian bioaktif dengan aktiviti antioksidan serta kesan pemutihan kulit dan anti-kedut menggunakan pengekstrakan berbantukan ultrasound (UAE) di S. thunbergii. Masa pengekstrakan(5.30~18.7 min), suhu pengekstrakan (22.4~79.6 ◦C) dan kepekatan etanol (0.0~99.5 peratus ), yang merupakan pembolehubah utama bagi UAE, telah dioptimumkan menggunakan reka bentuk komposit pusat. Persamaan regresi kuadratik diperoleh berdasarkan data eksperimen dan menunjukkan pekali penentuan yang tinggi (R2 > 0.85), menunjukkan kesesuaian untuk ramalan. Keadaan optimum UAE untuk memaksimumkan semua pembolehubah bersandar, termasuk aktiviti penghapusan radikal (RSA), aktiviti perencatan tirosinase (TIA), dan aktiviti perencatan kolagenase (CIA), telah dikenal pasti sebagai masa pengekstrakan 12.0 min, suhu pengekstrakan 65.2 ◦C, dan etanol sebanyak 53.5 peratus. Di bawah syarat ini, RSA, TIA dan CIA bagi ekstrak S. thunbergii ialah 86.5 peratus , 88.3 peratus dan 91.4 peratus . Kami juga mengesahkan ekstrak S. thunbergii mempunyai kesan perencatan pada ekspresi mRNA protein berkaitan tyrosinase-1, matriks metalloproteinase-1 dan matriks metalloproteinase-9, yang merupakan gen utama sintesis melanin dan hidrolisis kolagen . Spektrometri jisim tandem kromatografi cecair telah digunakan untuk mengenal pasti sebatian fenolik utama dalam ekstrak S. thunbergii, dan asid kafeik dikenal pasti sebagai puncak utama, menunjukkan bahawa bahan-bahan bernilai tambah tinggi denganpemutihan kulitdananti kedutkesan boleh dihasilkan daripada S. thunbergii dan digunakan untuk membangunkan bahan kosmetik.

Kata kunci: S. thunbergii; pengoptimuman;pemutihan kulit; anti kedut; TRP-1; MMP-1; MMP-9

Klik untuk manfaat ekstrak cistanche untuk memutihkan kulit

1. Pengenalan

Melanogenesis adalah proses fisiologi yang membawa kepada sintesis pigmen melanin [1]. Melanin ialah pigmen hitam atau coklat yang dirembeskan daripada melanosit yang terdapat dalam lapisan basal epidermis dan menentukan warna kulit, mata dan rambut [2]. Walau bagaimanapun, penjanaan pigmen melanin yang berlebihan boleh menyebabkan penyakit berkaitan hiperpigmentasi, seperti malignan. melanoma [3]. Tyrosinase, enzim utama dalam laluan biosintesis themelanin, menggalakkan hidroksilasi L-tirosin kepada L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) dan kemudian menggalakkan pengoksidaan L-DOPA kepada dopachrome dandopaquinone, yang mensintesis melanin melalui proses auto-pengoksidaan oleh protein berkaitan tyrosinase (TRP-1 dan 2) melalui beberapa peringkat [4–6]. Sehingga kini, kaedah menghalang pembentukan melanin dengan menghalang protein berkaitan tyrosinase telah digunakan secara meluas dalam industri kosmetik untuk pembangunan agen pemutihan kulit [7,8]. Walau bagaimanapun, asid kojik, asid azelaik, dan hidrokuinon, digunakan secara konvensionalpemutihan kulitbahan, telah dilaporkan menyebabkan alahan serta menyebabkan ketoksikan kulit dan kanser [9]. Oleh itu, menghasilkan agen pemutihan kulit yang lebih selamat dan berkesan berasaskan bahan semula jadi dianggap penting [10].

Kolagen ialah protein matriks ekstraselular (ECM) yang melindungi kulit dengan memberikan kekuatan dan ketegangan; ia juga membantu melambatkan proses penuaan dengan menghalang kedutan dan kehilangan lembapan. ECM boleh diuraikan oleh metalloproteinase matriks (MMPs) [11]. MMP-1,biasanya dikenali sebagai kolagenase, menguraikan sebahagian kolagen jenis 1 yang membentuk kulit, manakala MMP-9, dikenali sebagai gelatinase, juga menyahpolimer kolagen yang dihidrolisiskan oleh MMP-1 [12]. Di samping itu, Telah dilaporkan bahawa tekanan oksidatif yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif (ROS) mempercepatkan sintesis enzim ini, membawa kepada degradasi ECM dan, akhirnya, pembentukan kedutan [13]. Oleh itu, adalah perlu untuk mencari bahan semula jadi yang boleh menghalang ekspresi TRP dan MMP dan mengandungi antioksidan yang boleh menghilangkan spesies oksigen reaktif untuk mencegah penuaan kulit dengan mengurangkan pigmentasi dan kedutan kulit [14]. Baru-baru ini, kerana bahan-bahan berfungsi untuk kosmetik telah dibangunkan terutamanya dalam tumbuhan darat, batasan telah mula timbul dalam meneroka spesies baru dan bekalan bahan semula jadi yang stabil [15]. Akibatnya, minat dan permintaan terhadap bahan-bahan semula jadi yang berasal dari tumbuhan laut telah meningkat, dan pelbagai bahan baru telah dikenal pasti daripada sumber marin [16].

Sargassum thunbergiiialah spesies makroalga coklat kepunyaan famili gulfweed dan berasal dari pantai Korea dan China [17]. Ia diiktiraf sebagai pencemar marin yang menyebabkan kerosakan kepada rumpai laut dan ladang ikan dengan mengurangkan oksigen terlarut [18]. Beberapa daripadanya digunakan sebagai ubat anthelmintik dalam terapi tradisional atau sebagai kompos [19]. Walau bagaimanapun, bahan antikanser telah dikenal pasti daripadanya. ekstrak pada tahun 1995; sejak itu, ia telah mendapat perhatian sebagai makroalga dengan potensi tinggi untuk digunakan dalam pembuatan sebatian bioaktif baru [20]. Pengekstrakan sebatian bioaktif menggunakan proses konvensional, termasuk pengekstrakan mekanikal, pengekstrakan superkritikal, pengekstrakan gelombang mikro, dan pengekstrakan tekanan ultra tinggi, dikaitkan dengan batasan seperti keperluan untuk menggunakan pelarut berlebihan, hasil pengekstrakan rendah, dan penggunaan tenaga yang tinggi [21]. Membangunkan kaedah pengekstrakan baharu adalah salah satu cabaran utama dalam inovasi teknologi untuk mendapatkan sebatian bioaktif daripada makroalga [22]. Di antara proses pengekstrakan konvensional, pengekstrakan berbantukan ultrasound (UAE) amat menarik kerana kesederhanaannya, kos peralatan yang rendah, hasil pengekstrakan yang tinggi daripada matriks yang berbeza, penggunaan tenaga yang rendah, jumlah pelarut yang lebih rendah diperlukan, dan masa yang lebih singkat [23]. UAE diketahui melibatkan gelombang bunyi frekuensi tinggi 20–100 kHz [24]. Hasil pengekstrakan adalah meningkatkan penggunaan ultrasound, dan ini dikaitkan dengan gangguan tisu tumbuhan, pengurangan saiz dalam zarah, dan peningkatan pemindahan jisim ekstrak kepada pelarut yang disebabkan oleh keruntuhan gelembung yang dihasilkan oleh peronggaan akustik berulang [25,26] . Disebabkan kelebihan ini, UAE diiktiraf sebagai proses yang murah, boleh diperbaharui dan cekap yang digunakan secara meluas dalam industri makanan untuk mengekstrak bahan-bahan berfungsi daripada biojisim darat dan akuatik [27].

Oleh itu, dalam kajian ini, kami menggunakan UAE untuk mengekstrak sebatian bioaktif daripada S. thunbergii dan memperoleh keadaan UAE optimum yang membolehkan pengekstrakan maksimum antioksidan sertapemutihan kulitdan bahan anti-kedut menggunakan pengoptimuman berasaskan statistik, dan pelbagai kesan perencatan ekspresi gen TRP-1, MMP-1 dan MMP-9oleh ekstrak S. thunbergii telah dinilai untuk mengesahkan kulit -pemutihan dananti kedutkesan sebatian bioaktif yang diperolehi dan mengesahkan kemungkinan menggunakan ekstrak S. thunbergii sebagai bahan kosmetik berfungsi.

ekstrak cistanche

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1. Reka bentuk Eksperimen

Memasang model adalah penting untuk mentafsir ketepatan model matematik metodologi permukaan tindak balas (RSM) untuk meramal aktiviti penghapusan radikal (RSA), aktiviti perencatan tyrosinase (TIA), dan aktiviti perencatan kolagenase (CIA) bagiS. thunbergiiekstrak. Reka bentuk komposit pusat (CCD) RSM ialah kaedah reka bentuk eksperimen yang menganalisis secara statistik permukaan tindak balas yang dihasilkan secara bebas atau melalui interaksi dua pembolehubah bebas yang mempengaruhi tindak balas. CCD mempunyai kelebihan menganggarkan kelengkungan secara berkesan menggunakan titik tengah dan berbilang titik paksi untuk meramalkan keadaan optimum [28–30]. Dalam kajian ini, CCD telah digunakan untuk meramalkan keadaan UAE yang optimum untuk memaksimumkan respons, termasuk RSA, TIA dan CIA, S. thunbergiiextract. 5 peringkat (- , −1, 0, 1, ) telah dikodkan dan 17 larian percubaan telah dilakukan sebagai asas pada CCD (Jadual 1). Berdasarkan kajian terdahulu kami, 3 pembolehubah bebas utama, termasuk masa pengekstrakan (5.30~18.7 min), suhu pengekstrakan (22.4~79.6 ◦C), dan kepekatan etanol (0~99.5 peratus ), telah dipilih untuk mendapatkan tahap maksimum pembolehubah bersandar [31]. Dalam membangunkan model regresi kuadratik, pembolehubah eksperimen telah dikodkan mengikut persamaan berikut.

xi {{0}} (Xi − X0)/∆X (1)

di mana xi ialah nilai berkod bagi pembolehubah Xi; X0 ialah nilai X pada titik tengah dan ∆X ialah nilai perubahan langkah.

Nilai eksperimen untuk 17 keadaan dengan perbezaan dalam masa pengekstrakan, suhu pengekstrakan, dan kepekatan etanol ditunjukkan dalam Jadual 2.

2.2. Kesan Keadaan UAE pada RSA

Mengikut 17 syarat yang digunakan untuk pengekstrakanS. thunbergiimenggunakan UAE,RSA ialah 2.37~89.9 peratus , dengan nilai maksimum pada 12.0 masa pengekstrakan min, 51.0 ◦C suhu pengekstrakan dan 50.{{11} } peratus kepekatan etanol dan nilai minimum pada 12.0 masa pengekstrakan min, 51.0 ◦C suhu pengekstrakan, dan 99.5 peratus kepekatan etanol; ini menunjukkan bahawa kepekatan etanol mempunyai kesan yang paling besar terhadap RSA (Jadual 2). Seperti yang dicadangkan oleh perisian Design-Expert, persamaan regresi kuadratik telah dipilih dan dipasang untuk ketiga-tiga pembolehubah bebas dan tindak balas. Dari segi nilai berkod, respons yang diramalkan untuk RSA, TIA, dan CIA boleh dinyatakan menggunakan persamaan regresi kuadratik melalui analisis regresi berbilang (Jadual 3). Pekali model CCD telah disahkan menggunakan analisis varians (ANOVA) untuk pembolehubah tindak balas model regresi kuadratik diringkaskan dalam Jadual 4. Jika pekali penentuan (R2), yang mewakili persetujuan antara nilai eksperimen dan ramalan, adalah hampir kepada 1, bermakna kebaikan kesesuaian yang boleh diterima [32]. R2 bagi persamaan regresi kuadratik untuk meramalkan keadaan optimum UAE dengan RSA ialah 0.8554, menetapkan bahawa Lebih daripada atau sama dengan 85.5 peratus daripada nilai ramalan yang terhasil boleh dijelaskan sepenuhnya, dengan itu mengiktiraf kesesuaian persamaan regresi kuadratik (Jadual 3).

Kepentingan setiap pembolehubah model ditentukan menggunakan nilai p; nilai-p<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">0.05 menunjukkan tidak penting pada RSA [33]. Keputusan ANOVA kajian pengoptimuman menunjukkan bahawa model itu adalah signifikan (p=0.0283), iaitu kurang daripada tahap keertian yang ditetapkan, menunjukkan bahawa kesignifikanan telah diiktiraf dalam 5 peratus . Oleh itu, keputusan menunjukkan bahawa model boleh meramalkan RSA, TIA dan CIA bagi ekstrak S. thunbergii dengan cekap apabila pembolehubah bebas berada dalam julat yang digambarkan di sini. Setelah menyemak kepentingan setiap pembolehubah tidak bersandar, kami mendapati kepekatan etanol mempunyai kesan paling besar pada RSA(p=0.0025), manakala kesan masa pengekstrakan (p=0.7418) dan suhu (p=0.1622)adalah tidak penting (Jadual 4).

Untuk menilai kesan setiap pembolehubah tidak bersandar ke atas pembolehubah bersandar, kami menyatakan perubahan dalam RSA mengikut masa pengekstrakan, suhu pengekstrakan, dan kepekatan etanol sebagai plot gangguan (Rajah 1A).

Akibatnya, nilai tertinggi muncul pada 14.1 min masa pengekstrakan dan kemudian menurun; nilai maksimum telah disahkan pada 60.7 ◦C dan 46.2 peratus untuk suhu pengekstrakan dan kepekatan etanol, masing-masing. Walau bagaimanapun, apabila menggambarkan kadar perubahan dalam RSA disebabkan oleh interaksi antara pembolehubah menggunakan lengkung permukaan tindak balas tiga dimensi, perubahan dalam masa pengekstrakan dan suhu mempunyai sedikit kesan ke atas RSA, manakala kepekatan etanol mempunyai kesan yang ketara (Rajah 2A, B)

Ini adalah sama dengan hasil kajian oleh Kim et al. mengenal pasti kesan kepekatan pelarut pada RSA ekstrak Gynostemma pentaphyllum [34]. RSA cenderung meningkat kepada maksimum dan kemudian menurun dengan kepekatan etanol, menunjukkan nilai maksimum pada 48.1 peratus kepekatan etanol. Perubahan kekutuban larutan pengekstrakan akibat pencampuran air suling dan etanol membawa kepada peningkatan dalam kesan antioksidan G. pentaphyllum dan ekstrak S. thunbergii. Di samping itu, ini selaras dengan keputusan yang melaporkan bahawa sebatian bioaktif larut air yang dihasilkan oleh pengekstrakan air panas daripada alga menunjukkan kurang aktiviti antioksidan dan ekstrak yang menggunakan 50 peratus etanol menunjukkan aktiviti antioksidan yang lebih tinggi, menunjukkan bahawa penggunaan pelarut binari (air dan etanol) dalam menghasilkan sebatian bioaktif adalah berfaedah dalam meningkatkan hasil pengekstrakan [35,36].

2.3. Kesan Keadaan UAE terhadap TIA

TIA daripadaS. thunbergiiekstrak mengikut 17 syarat UAE yang digunakan untuk eksperimen ditunjukkan dalam Jadual 2. Nilai TIA maksimum 92.6 peratus telah dikenal pasti pada 12.0 min, 79.6 darjah dan 50.{{13} } peratus dan nilai minimum 55.3 peratus diramalkan pada 12.0 min, 51.0 darjah , dan 0.{{20}} peratus pengekstrakan masa, suhu pengekstrakan, dan kepekatan etanol, masing-masing. Akibatnya, suhu pengekstrakan dan kepekatan etanol telah disahkan mempunyai kesan ketara ke atas TIA. Berdasarkan keputusan eksperimen, kami memperoleh persamaan regresi kuadratik menggunakan CCD dan menggunakannya untuk meramalkan keadaan UAE yang optimum (Jadual 3). R2 ialah 0.8591, menunjukkan padanan 85.91 peratus antara nilai model yang diramalkan dan data eksperimen dan membayangkan bahawa persamaan regresi kuadratik adalah sesuai untuk ramalan TIA. Untuk tindak balas RSA, TIA dan CIA, model-model tersebut adalah sangat signifikan apabila nilai-F yang dikira lebih besar daripada nilai-F yang dijadualkan dan nilai kebarangkalian adalah rendah (p <0.001); ini="" menunjukkan="" bahawa="" istilah="" individu="" dalam="" setiap="" model="" tindak="" balas="" adalah="" signifikan="" dari="" segi="" kesan="" interaksi="" [37].="" anova="" digunakan="" untuk="" menilai="" secara="" statistik="" kesan="" signifikan="" persamaan="" regresi="" kuadratik.="" model="" percubaan="" adalah="" signifikan="" (p="0.0262)," menunjukkan="" tahap="" keertian="" dalam="" 5="" peratus="" (jadual="">

Apabila kita memvisualisasikan kadar perubahan TIA dengan perubahan pembolehubah tunggal semasa menetapkan nilai pembolehubah lain, variasi TIA disebabkan kepekatan etanol adalah yang terbesar, dengan TIA maksimum ditemui pada kepekatan etanol 76.8 peratus (Rajah 1B). Interaksi pembolehubah bebas divisualisasikan menggunakan keluk permukaan tindak balas tiga dimensi dengan menukar dua pembolehubah secara serentak (Rajah 3).

Apabila suhu dan masa pengekstrakan meningkat, TIA meningkat pada mulanya; walau bagaimanapun, julat variasi tidak besar, jadi kami mengesahkan semula bahawa kesan interaktif suhu dan masa pengekstrakan tidak ketara, seperti yang ditentukan menggunakan ANOVA (Rajah 3A). Sebaliknya, TIA meningkat dan menurun semula dengan kepekatan etanol, dengan TIA maksimum diramalkan pada 75.6 peratus kepekatan etanol (Rajah 3B). Keputusan ini konsisten dengan kajian Park, et al., yang menunjukkan bahawa 70~80 peratus kepekatan etanol membawa kepada TIA yang lebih tinggi daripada air dalam pengekstrakan sebatian bioaktif daripada ekstrak beras liar [38]. Kajian itu melaporkan bahawa kepekatan etanol adalah pembolehubah utama dalam TIA dan cenderung berbeza mengikut perkadaran dengan kepekatan etanol.

2.4. Kesan Keadaan UAE terhadap CIA

Apabila kami mengukur CIA di bawah setiap 17 keadaan, kami mendapati bahawa nilai CIA maksimum ialah 92.3 peratus pada 16.0 min, 63.0 darjah dan 80.{{ 12}} peratus dan CIA minimum ialah 48.1 peratus pada 12.0 min, 51.0 darjah , dan 0.0 peratus masa pengekstrakan, suhu pengekstrakan, dan kepekatan etanol, masing-masing (Jadual 2). Persamaan regresi kuadratik yang dijana mengikut masa pengekstrakan, suhu, dan kepekatan etanol mempunyai R2 0.9237, membayangkan bahawa variasi sampel 92.37 peratus dikaitkan dengan pembolehubah bebas, dan hanya 7.63 peratus daripada jumlah variasi tidak dapat dijelaskan oleh model (Jadual 3). Ini menunjukkan tahap korelasi yang baik antara nilai ramalan dan percubaan CIA dan mengiktiraf kesesuaiannya dalam meramalkan model eksperimen [39]. ANOVA menunjukkan kepentingan statistik (p=0.0037) di bawah paras keertian 1 peratus dan mengesahkan bahawa suhu pengekstrakan (p=0.0030) dan kepekatan etanol (p=0.0006) antara istilah linear ialah pembolehubah bebas yang mempengaruhi CIA dengan ketara (Jadual 4).

Untuk menilai kesan setiap pembolehubah bebas pada CIA, kami membandingkan CIA dengan perubahan dalam satu pembolehubah menggunakan plot gangguan (Rajah 1C). Apabila pembolehubah bebas meningkat, CIA pada mulanya meningkat kepada nilai maksimum, dan kepekatan etanol didapati paling berpengaruh. Keluk permukaan tindak balas tiga dimensi mewakili perubahan CIA disebabkan oleh kesan interaktif pembolehubah bebas, yang cenderung meningkat dan menurun dengan masa pengekstrakan dan kepekatan etanol. CIA meningkat dengan peningkatan masa pengekstrakan dan kepekatan etanol, menunjukkan CIA maksimum pada 12.1 min masa pengekstrakan dan 73.6 peratus kepekatan etanol. Perubahan dalam CIA dengan suhu pengekstrakan dan kepekatan etanol pada masa pengekstrakan yang tetap juga cenderung sama; bagaimanapun, variasi dalam CIA dengan kepekatan etanol telah disahkan lebih ketara (Rajah 4B).

Nilai maksimum CIA yang diramalkan oleh CCD ialah 93.8 peratus dengan masa pengekstrakan 14.5 min, suhu pengekstrakan 65.1 ◦C, dan kepekatan etanol 69.3 peratus . Ini adalah lebih daripada dua kali lebih tinggi daripada 39.4 peratus dan 40.3 peratus CIA untuk teh hijau dan ekstrak air teh putih yang ditemui dalam kajian terdahulu [40]. Kesimpulannya,S. thunbergiiekstrak dianggap mampu digunakan sebagai bahan kosmetik berfungsi untuk mengurangkan kedutan, kerana ia menghalang aktiviti kolagenase.

2.5. Pengoptimuman Proses UAE

Untuk mengenal pasti keadaan UAE yang optimum untuk pengekstrakanpemutihan kulitdan sebatian bioaktif anti-kedut daripada ekstrak S. thunbergii, kami memperoleh titik optimum untuk memaksimumkan pembolehubah bersandar dengan bertindih permukaan tindak balas individu RSA, TIA dan CIA (Rajah 5).

Apabila julat pembolehubah tidak bersandar dihadkan kepada masa pengekstrakan 5.30~18.7 min, suhu pengekstrakan 22.4~79.6 ◦C dan kepekatan etanol 0~99.5 peratus , keadaanUAE optimum telah diramalkan menjadi 12.0 min masa pengekstrakan, 65.2 ◦C suhu pengekstrakan, dan 53.5 peratus kepekatan etanol. Keadaan UAE yang optimum diperolehi berdasarkan kriteria meminimumkan masa pengekstrakan kerana masa proses yang singkat bermanfaat dalam mengurangkan kos proses. Di bawah keadaan optimum UAE yang diperolehi, 86.5 peratus , 88.3 peratus dan 91.4 peratus RSA, TIA dan CIA, masing-masing telah diramalkan. Dalam kajian lepas, Yuan et al. melaporkan bahawa keadaan optimum untuk pengekstrakan sebatian bioaktif daripada S. thunbergii adalah seperti berikut: nisbah cecair kepada pepejal 120 mL/g, masa pengekstrakan 210 minit, dan suhu pengekstrakan 97 ◦C [41]. Manakala Yuan et al. mengoptimumkan keadaan pengekstrakan air panas untuk pengekstrakan sebatian bioaktif, dalam kajian ini, keadaan UAE untuk pengekstrakan sebatian bioaktif telah dioptimumkan. Oleh itu, keadaan UAE di bawah masa pengekstrakan yang singkat dan suhu rendah telah terbukti sebagai proses pengekstrakan yang berkesan untuk sebatian bioaktif berbanding proses pengekstrakan air panas sebelumnya.

Untuk mengesahkan keputusan, satu eksperimen pengesahan telah dijalankan dengan tiga ulangan pada keadaan optimum seperti yang diramalkan oleh model CCD. Apabila nilai percubaan RSA, TIA dan CIA dinilai di bawah keadaan optimum, nilai tersebut ialah 88.9 peratus ± 3.11 peratus ,85.1 peratus ± 2.76 peratus dan 89.7 peratus ± 4.09 peratus , masing-masing dan menunjukkan persetujuan yang kukuh dengan nilai model ramalan (p > 0.05). Oleh itu, nilai percubaan adalah dalam persetujuan yang baik dengan nilai yang diramalkan, yang membuktikan kebolehpercayaan keputusan pengoptimuman UAE.

2.6. Ungkapan mRNA TRP-1, MMP-1 dan MMP-9

TRP-1 berfungsi sebagai 5,6-dihydroxyindole-2-asid karboksilik oksidase, yang diketahui sebagai penyebab utama pigmentasi kulit yang bertindak oleh rangsangan tyrosinase dan eumelaninsintesis dalam sel epitelium [42]. Sebaliknya, MMP-1 dan MMP-9 memecahkan jenis 1kolagen, yang membentuk 90 peratus daripada lapisan kulit, dengan itu menyebabkan degradasi kolagen, kehilangan keanjalan dan penuaan kulit [43].

Dalam kajian ini,S. thunbergiiekstrak dihasilkan menggunakan keadaan optimum UAE yang ditetapkan melalui pengoptimuman berasaskan statistik, dan ekstrak telah diuji pada talian sel B{{0}}F0 untuk menilaipemutihan kulitdananti kedutsifat dengan membandingkan tahap ekspresi RNA mereka bagi TRP{{0}}, MMP-1 dan MMP-9. Tahap ekspresi TRP-1, gen utama yang berkaitan dengan sintesis melanin, didapati bergantung kepada kepekatan dalamS. ekstrak thunbergii dan menurun dengan ketara selepas rawatan dengan 1 dan 2 mg/mL ekstrak berbanding dengan kumpulan kawalan (p < 0.05)="" (rajah="">

Kami juga mendapati bahawa ungkapan MMP{{{{10}}}} dan MMP-9 menurun secara berkadar dengan kepekatan ekstrak S. thunbergii (Rajah 6B, C). Khususnya, tahap ekspresi MMP-1 dan MMP-9 masing-masing dihalang sebanyak 58.6 peratus dan 78.8 peratus, dalam kumpulan yang dirawat dengan 2 mg/mL ekstrak S. thunbergii berbanding dengan kumpulan kawalan (p < 0.05).="" daripada="" keputusan="" di="" atas,="" telah="" disahkan="" bahawa="" ekstrak="" s.="" thunbergii="" yang="" dihasilkan="" di="" bawah="" keadaan="" uae="" optimum="" boleh="" menghalang="" ekspresi="" mrna="" trp-1,="" mmp-1="" dan="" mmp-9="" inb16-="" dengan="" berkesan="" dengan="" berkesan="" garis="" sel="" f0,="" dengan="" itu="" menghalang="" pengeluaran="" melanin="" dan="" penguraian="">

2.7. Pengenalpastian Asid Kafeik dalam Ekstrak S. thunbergii

Dalam percubaan sebelumnya, UAE menetapkan syarat untuk memaksimumkan antioksidan, pemutihan kulit, dananti kedutkesan ekstrak S. thunbergii telah dioptimumkan; bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan untuk meneroka bahan bioaktif dalam ekstrak. Oleh itu, sebatian fenolik daripadaS. thunbergiiekstrak dikenal pasti menggunakan spektrometri jisim tandem kromatografi cecair (LC-MS/MS), kerana teknologi ini membolehkan pengecaman tepat sebatian fenolik dengan pencirian struktur dan pengesanan molekul kecil dalam sumber semula jadi. Pengenalpastian puncak adalah berdasarkan masa pengekalan (RT), ion prekursor, dan ion serpihan yang berkaitan dengan piawaian. Dalam sistem LC-MS / MS, asid kafeik menunjukkan puncak pada 1.95 min RT (Rajah 7).

Dalam mod ion negatif, ion m/z 179.10, yang menunjukkan salah satu daripada dua puncak ion dalam spektrum jisim, sepadan dengan formula molekul asid kafeik dan ion serpihan yang dipisahkan bagi m/z 135.56. Secara amnya, selepas penceraian akibat perlanggaran, sebatian fenolik menghasilkan ion serpihan yang dicirikan oleh kehilangan CO2 (44 Da) daripada kumpulan asid karboksilik. Disebabkan oleh kehilangan ini, pembelahan seterusnya 44-Da CO2 daripada ion pada m/z 179.10 memberikan ion pada m/z 135.56. Asid kafeik ialah sebatian fenolik C6-C3 yang dihasilkan daripada fenilalanin atau tirosin oleh tumbuhan melalui laluan shikimat metabolisme sekunder dan merupakan wakil kelas asid sinamat (atau fenilpropanoid). Ia memasuki diet manusia melalui beberapa sayur-sayuran dan buah-buahan [44]. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, banyak kajian telah menunjukkan bahawa pengambilan asid kafeik mempunyai banyak manfaat kesihatan kerana sifat antioksidan yang membantu mencegah pelbagai penyakit yang berkaitan dengan tekanan oksidatif [45]. Oleh itu, kajian tentang sebatian fenolik ini sangat berguna dan mungkin memainkan peranan penting dalam proses kawalan kualiti dan penerokaan masa depan S. thunbergiia sebagai bahan denganpemutihan kulitdananti kedutharta benda.

3. Bahan dan Kaedah

3.1. Bahan dan Reagen

S. thunbergiidikumpulkan dari pantai selatan Pulau Jeju, Korea, pada 2 Oktober019 telah dibeli di Para Jeju (Jeju, Korea). Sebelum percubaan, S. thunbergii diserbukkan di bawah 0.42 mm menggunakan pengisar (HMF-3000S, Hanil Co., Wonju, Korea) dan disimpan dalam peti sejuk pada suhu -5◦C. Etanol untuk pengekstrakan pelarut telah dibeli daripada SamchunChemical Co. (95.0 v/v peratus, Pyungtaek, Korea). Asid askorbik (vitamin C), arbutin, dan asid kojik yang digunakan sebagai piawaian untuk ujian kawalan telah dibeli daripada Sigma-Aldrich Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA). Semua bahan kimia lain yang digunakan dalam eksperimen ini adalah gred analitik.

3.2. Proses UAE

Serbuk kering sampel (1 g) dimasukkan ke dalam bekas tekanan (XF100, AntonPaar Co., Ltd., Graz, Austria) dengan 10 mL pelarut dan dicampur menggunakan pengadun vorteks(VM-10, Daihan sci. Co., Wonju, Korea) selama 1 min. Sampel ini diekstrak di bawah 17 keadaan UAE individu yang diperolehi daripada CCD dengan masa pengekstrakan 5.30~18.7 min, suhu pengekstrakan 22.4~79.6 ◦C, dan kepekatan etanol 0.0~99.5 peratus. UAE telah dijalankan menggunakan peranti ultrasound (SD-D250H, Sungdong Co., Seoul, Korea) dengan kuasa elektrik 200 W dan frekuensi 40 kHz dilengkapi dengan pemasa digital dan pengawal suhu. Selepas pengekstrakan, supernatan diasingkan pada 10,000 rpm selama 10 minit menggunakan emparan (1236R, Labogene Co., Daejeon, Korea). Kemudian larutan itu ditapis melalui penapis cakera selulosa asetat dengan keliangan 0.45 µm dan digunakan untuk analisis RSA, TIA, dan CIA (Rajah 8).

3.3. Reka Bentuk Eksperimen

Perisian Pakar Reka Bentuk (Ver. 8.0, Stat-Ease, Minneapolis, MN, USA) telah digunakan untuk memaksimumkan pengekstrakan sebatian bioaktif daripadaS. thunbergiimelalui pengoptimuman keadaan UAE menggunakan CCD. Sebagai pembolehubah bebas, pembolehubah utama termasuk masa pengekstrakan (X1), suhu pengekstrakan (X2), dan kepekatan etanol (X3) telah dipilih, dan ia dikodkan kepada 5 (-1.68, -1, 0, 1, 1.68) tahap , seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1. RSA,TIA, dan CIA telah ditetapkan sebagai pembolehubah bersandar yang dipengaruhi oleh pembolehubah bebas utama. Nilai eksperimen diperoleh di bawah 17 keadaan yang dihasilkan oleh CCD, dan korelasi setiap pembolehubah bebas dan bersandar dikira menggunakan persamaan regresi kuadratik. [46]. Persamaan regresi kuadratik berikut digunakan untuk mengira nilai pembolehubah bersandar mengikut perubahan dalam pembolehubah bebas:

Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj(2)

dengan Y mewakili pembolehubah bersandar (RSA, TIA, CIA), 0 ialah pekali malar, dan k ialah pembolehubah ujian. i, ii, dan ij ialah pekali regresi untuk istilah linear, kuadratik, dan interaksi, masing-masing.

Untuk menilai model yang diramalkan pada pembolehubah bebas, analisis varians (ANOVA) dengan tahap keyakinan 95 peratus telah dijalankan untuk menilai kesan setiap pembolehubah termasuk suhu pengekstrakan, masa dan kepekatan etanol. Di samping itu, pekali regresi (R2), nilai-p model regresi, digunakan untuk menentukan kesesuaian model regresi [47].

3.4. Ujian Radical Scavenging Activity (RSA).

Kesan antioksidan daripadaS. thunbergiiekstrak dinilai berdasarkan aktiviti penghapusan mereka pada 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich) radikal bebas menggunakan ujian DPPH yang diubah suai [48]. Larutan stok disediakan dengan melarutkan 0.1 M DPPHdengan metanol dan kemudian disimpan pada suhu bilik. Larutan DPPH yang dicairkan dengan metanol telah disediakan untuk mendapatkan penyerapan 1.0 ± 0.02 pada 517 nm menggunakan UV-visspektrofotometer (Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea) . Sebanyak 1.25 mL aliquot larutan DPPH dicampur dengan 0.25 mL ekstrak S. thunbergii yang dicairkan (50–500 mg/mL) dan dibiarkan berdiri pada suhu bilik dalam gelap selama 20 minit. Perubahan penyerapan dipantau pada 517 nm, dan RSA dikira menggunakan formula berikut:

RSA ( peratus )={1 −Abs (sampel) / Abs (kawalan)} × 100 (3)

di mana Abs(kawalan) ialah penyerapan kawalan dan Abs(sampel) ialah penyerapan ekstrak. Kepekatan asid askorbik yang sama (50-500 mg/mL) digunakan sebagai kawalan apositif.

3.5. Tirosinase Inhibitory Activity (TIA) Assay

TIA diukur mengikut kaedah yang dilaporkan oleh Yagi [49]. Campuran tindak balas mengandungi 0.4 mL penimbal natrium fosfat (67 mM, pH 6.8), 0.2 mL 10 mM3,{{10}} dihydroxy phenylalanine (L-DOPA, Sigma-Aldrich), 0.2 mL cendawan tyrosinase(125 unit/mL, Sigma-Aldrich), dan 0.2 mL larutan ekstrak. Tindak balas dijalankan pada suhu 25 ◦C selama 30 minit. Selepas tindak balas, penyerapan diukur pada 475 nm, dan hasilnya dibandingkan dengan kawalan. TIA dikira mengikut persamaan di bawah:

TIA ( peratus )={1 −Abs (sampel) / Abs (kawalan)}× 100 (4)

di mana Abs(kawalan) ialah penyerapan kawalan dan Abs(sampel) ialah penyerapan ekstrak.

cistanche mengurangkan aktiviti tyrosinase

3.6. Ujian Aktiviti Perencatan Collagemase (CIA).

Ujian CIA telah dilakukan mengikut kaedah yang dilaporkan oleh Wünsch danHeindrich [50]. Kolagenase (0.2 mg/mL, Sigma-Aldrich)telah dilarutkan dalam 0.1 M Tris–HCl(pH 7.5). Substrat, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0.4 mg/mL,Sigma-Aldrich), telah dilarutkan dalam 0.1 M Tris–HCl (pH 7.5) mengandungi 4 mM CaCl2. Campuran tindak balas untuk menilai hidrolisis kolagen mengandungi kolagenase (75 μL), sampel (50 μL), dan larutan substrat (125 μL). Untuk kumpulan kawalan, 50 µL air suling dimasukkan ke dalam campuran tindak balas dan bukannya ekstrak. Campuran dibenarkan untuk mengeram 37 ◦C selama 30 minit, dan 0.25 mL asid sitrik 25 mM telah ditambah untuk penamatan tindak balas enzim. Selepas bercampur dengan etil asetat, supernatan dipisahkan, dan penyerapan diukur pada 320 nm. Peratusan perencatan dikira mengikut formula berikut:

CIA ( peratus ) ={1 −Abs (sampel)/Abs (kawalan)}× 100 (5)

di mana Abs(kawalan) ialah penyerapan kawalan dan Abs(sampel) ialah penyerapan ekstrak.

3.7. Pengesahan Model

Keadaan optimum untuk UAE (masa pengekstrakan, suhu pengekstrakan, kepekatan andetanol) telah disahkan dengan penilaian in vitro aktiviti antioksidan,pemutihan kulit, dan kesan anti-kedut (RSA, TIA, dan CIA) mengikut nilai yang diperoleh daripada CCD. Semua jawapan telah ditentukan sekali lagi di bawah keadaan optimum UAE. Nilai eksperimen dibandingkan dengan yang diramalkan oleh model untuk menilai kesahihannya. Analisis LC-MS/MS dilakukan ke atas ekstrak yang dijana dalam keadaan optimum untuk mencari komponen utama dalamS. thunbergiiekstrak.

3.8. Kultur sel

B{{0}}Sel melanoma F0 telah dibeli daripada Korean Cell Line Bank Co. (KCLB,Seoul, Korea) dan dikultur dalam medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (DMEM, Gibco BRL Co., Ltd., Gaithersburg , MD, USA) kandungan dengan 10 peratus serum lembu janin, dan 1 peratus penisilin (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA). Sel telah diinkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 5 peratus CO2(MCO-5AC, Sanyo Co., Ltd., Tokyo, Jepun) dan ditanam sebagai lapisan tunggal dalam kelalang kultur 25 cm2. Apabila garisan sel mencapai kira-kira 80 peratus pertemuan, subkultur dilakukan dengan merawat dengan trypsin-EDTA untuk mendapatkan sel tunggal untuk memastikan pertumbuhan dan kesihatan sel yang betul.

3.9. Tindak Balas Rantaian Polimerase Transkripsi Terbalik (RT-PCR)

Untuk melaksanakan RT-PCR, 1.0 × 106sel telah disadur setiap telaga 24-plat perigi. TotalRNA diekstrak daripada sel dengan kit pengekstrakan RNA universal AccuPrep (BioneerCo., Daejeon, Korea). Transkripsi terbalik dilakukan dengan 0.5 µg jumlah sintesis RNA forcDNA menggunakan campuran induk platinum sintesis cDNA amfiRivert (GenDEPOTCo., TX, USA). cDNA telah dikuatkan dengan setiap primer, seperti TRP-1, MMP-1, MMP-9 dan -actin (Jadual 5). PCR dilakukan dalam isipadu 20 µL yang mengandungi 1 µL cDNA, 10 µLTaq Premix (Genet bio, Daejeon, Korea), dan 9 µL diethylpyrocarbonate (DEPC). Keadaan PCR adalah seperti berikut: 94 ◦C selama 5 minit, diikuti oleh 25 kitaran pada 95 ◦C selama 5 saat, 60 ◦C selama 31 saat (untuk TRP-1) atau 55 ◦C selama 30 saat (untuk MMP{ {26}}) atau 59 ◦C selama 30 saat (untuk MMP-9) dan 72 ◦C untuk sambungan 30 saat. Setiap produk PCR dielektroforesis pada 1 peratus gel agarose dan divisualisasikan dengan menggunakan sistem tambah Gel Doc TM XR dan perisian kuantiti satu (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA). -actin sebagai gen pengemasan telah digunakan untuk menormalkan tahap ekspresi TRP-1, MMP-1 dan MMP-9.

3.10. Analisis LC-MS/MS

Pemisahan kromatografi ekstrak S. thunbergii telah dilakukan menggunakan Sistem HPLC Juruukur Plus Finni gan (Thermo Electron Corporation, San Jose). Pemisahan dicapai dengan menggunakan lajur ROC C18 dengan panjang lajur 150 mm, diameter dalaman 3 mm dan saiz zarah 3 µm (RESTEK Co., Bellefonte, PA, USA) sambil menggunakan kecerunan 0.1 peratus asid formik dalam air (fasa mudah alih A) dan 0.1 peratus asid formik dalam asetonitril(fasa mudah alih B) pada kadar aliran 0.2 mL/min, seperti berikut: 5 peratus kepada 100 peratus fasa mudah alih B selama 11 min, 100 peratus hingga 5 peratus fasa mudah alih B selama 4 minit, 37 peratus fasa mudah alih B selama 2 minit, 37 peratus hingga 10 peratus fasa mudah alih B selama 0.1 minit dan 10 peratus fasa mudah alih B selama 2.4 minit . Isipadu suntikan ialah 10 µL, dan lajur dikekalkan pada 30 ◦C. Eksperimen spektrometri jisim dilakukan menggunakan spektrometer quadrupolemass tiga kali ganda Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMR (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA). Ekstrak S. thunbergii telah dianalisis dengan pengionan elektrospray ion negatif menggunakan pengionan elektrospray (ESI), khususnya menggunakan mod semburan ion turbo. Tetapan sumber ESI untuk pengionan pengekstrakan S. thunbergii dalam mod negatif adalah seperti berikut: suhu gas, 270 ◦C;aliran gas, 19 L/min; suhu gas sarung, 400 ◦C; aliran gas sarung, 10 L/min; voltan kapilari, 3000 V; voltan muncung, 1000 V. Spektrum jisim direkodkan dalam mod ion negatif antara 100 dan 500 m/z menggunakan nitrogen sebagai gas perlanggaran. Analisis komponen utama dalamS. thunbergiiekstrak dijalankan dengan membandingkan molekul yang diperolehi dan corak pemecahan keputusan LC-MS/MS dengan data daripada literatur dan dengan perpustakaan jisim untuk sebatian piawai.

4. Kesimpulan

Kajian ini mencadangkan keadaan optimum untuk proses UAE yang boleh memaksimumkan antioksidan,pemutihan kulit, dananti kedutkesan untuk penghasilan sebatian bioaktif nilai tambah daripada S. thunbergii, yang tersebar luas di pantai subtropika Asia Tenggara, menyebabkan pencemaran marin dan gangguan ekologi. Pembolehubah yang paling berpengaruh dalam melaksanakan pengoptimuman UAE ialah kepekatan etanol, yang mengesahkan bahawa penggunaan dan penentuan kepekatan pelarut binari yang terdiri daripada air dan etanol merupakan pertimbangan penting di UAE. Apabila bertindih setiap permukaan tindak balas untuk pengoptimuman serentak RSA, TIA dan CIA, masa pengekstrakan 12.0 min, suhu pengekstrakan 65.2 ◦C dan kepekatan etanol 53.5 peratus telah diramalkan, di bawah keadaan RSA. nilai 86.5 peratus , nilai TIA sebanyak 88.3 peratus dan nilai CIA sebanyak 91.4 peratus telah dikenal pasti.

Apabila kesan TRP-1, MMP-1 dan MMP-9 pada ekspresi dinilai pada tahap mRNA menggunakan ekstrak S. thunbergii yang dihasilkan dalam keadaan optimum UAE, telah disahkan bahawa ekstrak S. thunbergii boleh mengurangkan tahap mRNA TRP-1, MMP-1 dan MMP-9 dan dengan itu menghalang pengeluaran melanin serta penguraian kolagen kulit.

Oleh itu,S. thunbergiiekstrak dijangka digunakan secara meluas sebagai sumber baharu daripada biomas marin dalam penghasilan bahan-bahan berfungsi untuk kosmetik, makanan, dan ubat-ubatan. Selain itu, proses pengekstrakan sebatian bioaktif menggunakan UAE dipercayai menyediakan data asas tentang pembangunan proses dan menyumbang kepada penentuan keadaan pengekstrakan yang optimum dalam penghasilan bahan berfungsi baharu daripada S.thunbergii dan makroalga lain.