Kesan Tekanan Perfusi Pada Kehilangan Podocyte dalam Buah Pinggang Tetikus Terpencil
Mar 13, 2022
Abstrak
Latar Belakang / Matlamat: Podocytes hilang dalam kebanyakan penyakit glomerular, yang membawa kepada glomerulosklerosis dan progresifpenyakit buah pinggang. Secara amnya diandaikan, bahawa podocytes terdedah kepada aliran penapisan dan dengan itu kepada daya ricih yang ketara yang memacu detasmen mereka dari membran bawah tanah glomerular (GBM). Dalam konteks ini, effacement proses kaki telah dicadangkan sebagai tindak balas penyesuaian yang berpotensi untuk meningkatkan lekatan podosit kepada GBM. Kaedah: Kami telah menguji hipotesis ini menggunakan penjelasan optik dan analisis morfometri 3 dimensi resolusi tinggi dalam murine perfused terpencilBuah pinggang.Kami menyiasat dinamik detasmen podocyte pada tekanan perfusi yang berbeza (50, 300 dan lebih daripada 450 mmHg) pada tikus muda atau tua yang sihat (20 vs 71 minggu umur), atau tikus disuntik dengan serum anti-GBM untuk mendorong effacement proses kaki global. Keputusan: Keputusan menunjukkan bahawa podosit yang sihat pada tikus muda dilampirkan dengan ketat pada GBM dan juga tekanan supramaximal tidak menyebabkan detasmen yang ketara. Berbanding dengan tikus muda, pada tikus dan tikus tua dengan nefritis anti-GBM dan effacement proses kaki, kehilangan podosit progresif secara beransur-ansur telah berlaku sebelum perfusi. Tekanan perfusi yang tinggi mengakibatkan kehilangan podosit tambahan yang agak kecil pada tikus tua. Pada tikus dengan nefritis anti-GBM, kehilangan podosit tambahan yang ketara berlaku pada titik masa awal ini apabila meningkatkan tekanan perfusi kepada 300 mmHg atau lebih tinggi. Kesimpulan: Kerja ini memberikan bukti eksperimen pertama bahawa podocytes sangat tahan terhadap tekanan perfusi yang meningkat secara akut dalam ex vivo terpencilBuah pinggangmodel perfusi. Hanya dalam penyakit glomerular, sebilangan besar podosit yang cedera terlepas berikutan peningkatan akut dalam tekanan perfusi.
Kata kunci:Hipertensi glomerular; Hiperfiltrasi glomerular; Tekanan mekanikal; Perkembangan; Penyakit buah pinggang kronik
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Pengenalan
Hipertensi glomerular dan hiperfiltrasi merosakkan glomerulus yang membawa kepada penyakit glomerular progresif. Adalah dipercayai secara meluas bahawa peningkatan tekanan perfusi mendedahkan tuft kepada peningkatan tekanan mekanikal yang mencabar lekatan podosit ke membran bawah tanah glomerular (GBM), menyumbang kepada detasmen mereka [1, 2]. Podocytes sangat berbeza, sel pasca-mitotik, penting untuk halangan penapisan glomerular utuh. Kehilangan Podocyte kemungkinan besar disebabkan oleh detasmen sel-sel yang berdaya maju dari GBM dan bukannya apoptosis atau nekrosis [3-6] kerana ia telah mungkin untuk membudayakan podosit pulih dari air kencing pesakit [4]. Detasmen podosit yang berdaya maju dari GBM mungkin disebabkan oleh mekanisme lampiran terjejas atau daya altemekanik. Lampiran terjejas kepada GBM mungkin disebabkan oleh kecederaan selular atau pengurangan ekspresi molekul lekatan dan terutamanya dikaitkan dengan penyakit glomerular keradangan. Berkenaan dengan daya mekanikal yang relevan untuk podocyte, terdapat dua penentu utama, iaitu tekanan penapisan dan aliran filtrate [7-9]. Tekanan penapisan menjana tekanan dinding circumferential dan bertindak sebagai daya distending pada GBM. Variasi dalam tekanan hidrostatik transmural dikompensasi dengan berkesan oleh keupayaan GBM untuk bertindak sebagai membran elastik dan mengembang atau mengecut di kawasan permukaan [8, 10]. Sebaliknya, aliran filtrate merentasi GBM memberikan daya tangen pada permukaan podosit, iaitu tekanan ricih. Kami tahu dari kajian in vitro bahawa podosit sangat mudah terdedah kepada tekanan ricih yang melepaskan diri dari substrat mereka apabila terdedah kepada tekanan ricih lebih daripada 0.025 Pa [11] dan mengamalkan fenotip perantaraan yang boleh membantu mereka untuk mengatasi daya yang berasal dari aliran [12]. Sama ada hipertensi glomerular menjejaskan podosit melalui peningkatan tekanan penapisan dan/ atau peningkatan penapisan masih tidak jelas. Dalam kajian ini, kami menyediakan analisis pertama keupayaan podosit untuk menahan peningkatan daya mekanikal dalam model ex vivo. Kehilangan Podocyte diukur dengan resolusi tinggi menggunakan pembersihan tisu dan analisis morfometri 3 dimensi pada tikus muda dan sihat
Bahan dan Kaedah
Semua eksperimen haiwan dijalankan mengikut garis panduan undang-undang Jerman untuk kebajikan haiwan dan telah diluluskan oleh Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). Tikus ditempatkan di kemudahan bebas patogen tertentu dengan akses percuma ke chow dan air dan kitaran siang / malam selama 12 jam. Pembiakan dan genotip dilakukan mengikut prosedur standard. Tikus Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP pada latar belakang genetik FVB/N telah diterangkan sebelum ini [13]. Untuk mengaktifkan ekspresi transgene Pod-rtTA-eGFP, tikus menerima doxycycline melalui libitum iklan air minuman selama 7 hari (2 g / l, 5% sukrosa, dilindungi dari cahaya) diikuti dengan tempoh pembersihan 1 minggu seperti yang dilaporkan sebelumnya. Nefritis anti-GBM disebabkan oleh suntikan intraperitoneal tunggal 5 mg/g serum nefrotoxic berat badan seperti yang diterangkan sebelum ini [14].
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Perfusi buah pinggang
Yang terpencilBuah pinggangModel perfusi digunakan seperti yang diterangkan di tempat lain [15]. Secara ringkas, tikus telah dikorcotized dengan suntikan intraperitoneal xylazine/ketamine (0,1ml/10g berat badan iaitu p.), dan kemudian buah pinggang telah meresap dengan krebs-Henseleit-solution diubahsuai kompleks (Jadual 1) ditambah dengan 5% albumin serum lembu (BSA) pada 37°C untuk meniru milieu fisiologi semasa percubaan. Vasodilatasi maksimum dariBuah pinggangvasculature disebabkan oleh 1. suntikan subkutaneus verapamil (50μl) sejurus selepas induksi anestesia dan 2. penambahan papaverine kepada penyelesaian perfusi. Selepas perfusi awal selama 5 minit pada 50 mmHg, lectin berlabel pendarfluor (Komunisme I - RCA120; Makmal Vektor: RL-1082; 4 μl dalam 986 μl saline) disuntik ke label sel endothelial.Buah pinggangtelah ditenangkan selama 5 minit tambahan dengan penyelesaian Krebs-Henseleit yang diubahsuai dengan 5% BSA. Selepas itu, kiriBuah pinggangyang berfungsi sebagai kawalan berpasangan dalam setiap percubaan telah dialih keluar selepas ligasi berhati-hati kiriBuah pinggangkapal, dipotong menjadi kepingan, dan secara langsung direndam dalam 3% paraformaldehid (PFA) dalam garam fosfat-buffered (PBS). HakBuah pinggangtelah diselitkan sama ada selama 5 minit tambahan pada 300 mmHg atau dengan tekanan supramaximal (>>300mmHg, tekanan penapisan dianggarkan melebihi 400 mmHg), digunakan secara manual, jumlah isipadu 50 ml larutan perfusi. TheBuah pinggangtelah meresap dengan tekanan berterusan 50 mmHg atau 300 mmHg dengan menggunakan pam terkawal tekanan (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Jerman). Kemudian kananBuah pinggangtelah dikeluarkan, dipotong menjadi kepingan 2 mm, dan direndam dalam 3% paraformaldehid (PFA) dalam garam fosfat-buffered (PBS).
Pengimejan 3D dan analisis pengiraan PFA-dibenamkanBuah pinggangkepingan telah diinkubasi pada penggoncang mekanikal selama 5 hari pada suhu bilik. Selepas itu, sampel tetap dibasuh dalam 1x PBS dan diletakkan dalam penggoncang mekanikal semalaman pada suhu bilik.Buah pingganghirisan kemudian diletakkan dalam etanol 100% gred tinggi (Merck; 100983) selama 1 jam pada suhu bilik dengan gegaran lembut (sekurang-kurangnya 1 perubahan kepada etanol segar), diikuti dengan rendaman langsung dalam Ethyl Cinnamate (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) dan dibiarkan semalaman dalam shaker lembut pada suhu bilik di bawah perlindungan cahaya. Kelutsinaran tisu dicapai dalam masa kurang dari 1 jam. Untuk mikroskop tegak, kami menggunakan ruang binaan dalaman pakai buang seperti yang diterangkan sebelum ini [16]. Kebanyakan eksperimen dilakukan menggunakan mikroskop 2-foton (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Kemudahan Teras). Perisian pengimejan Fiji digunakan untuk bergerak melalui paksi Z setiap timbunan bahagian optik bersiri dan untuk mengasingkan glomeruli individu melalui tanaman 3D [16]. 40 glomeruli perBuah pinggang(20 subkortikal dan 20 juxtamedullary) dipilih untuk analisis. Oleh itu, secara keseluruhan 1200 glomeruli dianalisis dalam kajian ini untuk mendapatkan keputusan dengan ketepatan yang mencukupi. Podocytes dikenal pasti sebagai sel eGFP +. Kuantifikasi isipadu kapilari, isipadu glomerular serta nombor nukleus (titik) dan kelantangan dilakukan menggunakan perisian rendering dan analisis 3D (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zurich, Switzerland) Jarak podosit dari tiang vaskular dikira menggunakan Bitplane XTension "Spot Closest. Jarak". Pengkuantifikasi automatik podosit dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [17]. Analisis imej dilakukan menggunakan Imaris (Biplane AG Zurich, Switzerland). Setiap glomerulus ditakrifkan oleh arteriole afferent berlabel lectin. 20 subkortikal dan 20 juxtamedullary (ditakrifkan oleh jarak mereka dari permukaan kortikal).
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN SAKIT BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Mikroskopi ringan & Immunofluorescence
Untuk mikroskopi ringan, 4% penimbal formalin-tetapBuah pinggangserpihan telah dehidrasi, tertanam dalam parafin dan diwarnai dengan asid berkala-Schiff (PAS). Peratusan glomeruli yang tidak normal / cedera dikira berdasarkan pengenalpastian 50 bahagian silang glomerular perwakilan setiap tetikus yang dipilih semasa berjalan sistematik di seluruhBuah pinggangkorteks. Protokol immunofluorescence standard kami [18] dilakukan pada 2 μm bahagian yang dibenamkan parafin. Antibodi berikut digunakan: anti-GFP poliklonal ayam (ab13970; Abcam), tetikus monoklonal anti-synaptopodin (sc-515842; Bioteknologi Santa Cruz), arnab poliklonal anti-tetikus p57 (sc-8298; Bioteknologi Santa-Cruz), poliklonal arnab anti-WT1 (sc-192; Bioteknologi Santa-Cruz), Cy2 keldai anti-ayam (703-225-155; Dianova, Hamburg, Jerman), Alexa Fluor546 kambing anti-tetikus IgG1(A-21123; Thermo Fischer), keldai poliklonal anti-arnab AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).
Mikroskopi Elektron
Potongan kecil korteks telah ditetapkan dalam penyelesaian Karnovsky dan tertanam di Epon (Serva, Heidelberg, Jerman). Bahagian ultrathin telah diperiksa dengan mikroskop elektron penghantaran ZEISS Leo 906 pada 60 kV oleh pembesaran dari 3597-6000x. Sampel dibasuh dalam fosfat 0.1 M Soerensen (Merck, Darmstadt, Jerman), selepas ditetapkan dalam 1% OsO 4 (Roth, Karlsruhe, Jerman) dalam penimbal sukrosa 17% (Merck, Darmstadt, Jerman) dan dehidrasi oleh siri etanol menaik (30, 50, 70, 90 dan 100%) selama 10 minit setiap satu. Langkah terakhir diulang 3 kali. Spesimen kering diinkubasi dalam propylene oksida (Serva, Heidelberg, Jerman) selama 30 minit, dalam campuran resin Epon (Serva, Heidelberg, Jerman) dan propylene oksida (1:1) untuk 1h dan akhirnya dalam Epon tulen untuk 1h. Pempolimeran Epon dilakukan pada 90 ° C untuk 2j. Bahagian ultrathin (70-100 nm) dipotong oleh ultramicrotome (Reichert Ultracut S, Leica dengan pisau berlian (Leica) dan diambil pada grid Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Germany). Sebaliknya dipertingkatkan dengan mengotorkan dengan 0.5% uranyl asetat dan 1% citrate plumbum (kedua-dua EMS, Munich, Jerman). Sampel dilihat pada voltan pecutan 60 kV menggunakan mikroskop elektron penghantaran Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman).
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan perisian GraphPad Prism v8. Semua nilai dinyatakan sebagai cara ± SD. Untuk perbandingan 2 kumpulan, ujian t digunakan. Perbandingan beberapa kumpulan dilakukan menggunakan analisis varians; pembetulan tukey post hoc digunakan untuk berbilang perbandingan. Semua ujian adalah 2 ekor dan kepentingan statistik ditakrifkan sebagai P<>
Keputusan
Kaedah separa automatik untuk menentukan bilangan podocytes per glomerulus Tiga kumpulan telah dikaji, iaitu tikus dan tikus muda dan tua yang sihat dengan glomerulonephritis anti-GBM (♂: ♀ 1:1). Tikus muda dan sihat berumur 15-21 minggu, manakala tua (umur) berusia 74 minggu. Efluen proses kaki global disebabkan oleh tikus ol 14-20 minggu melalui suntikan tunggal serum anti-GBM 3 hari sebelum menubuhkan perfused terpencilBuah pinggangmodel (Rajah 1A), seperti yang diterangkan sebelum ini [19].
Untuk menentukan pengaruh tekanan perfusi intrarenal pada podocytes,Buah pinggangtelah tertakluk kepada tekanan perfusi yang berbeza dalam terpencilBuah pinggangmodel perfusi. Pertama, kedua-duanyaBuah pinggangsentiasa meresap pada 50 mmHg selama 5 minit. Untuk menguji sama ada penyelesaian perfusi kami mengekalkan integriti glomerulus dalam berdaya maju yang tidak tetapBuah pinggang, 2 tikus telah meresap pada tekanan malar 100 mmHg selama 90 minit. Perfusi, aliran kencing (25 μl / min / gr berat badan) serta pelepasan inulin (22 μl / min) kekal stabil sepanjang masa (Rajah Tambahan 1 - untuk semua bahan tambahan lihatwww.cellphysiolbiochem.com).Dalam tikus eksperimen, selepas perfusi awal pada 50 mmHg, kiriBuah pinggangtelah dikeluarkan dan berfungsi sebagai kawalan dalam semua eksperimen. Seterusnya, tekanan berterusan 300 mmHg atau tekanan yang jauh lebih tinggi daripada 300 mmHg (>>300 mmHg; tekanan penapisan supramaximal kira-kira 450 - 500 mmHg) digunakan pada baki kananBuah pingganguntuk 5 minit. (Gamb. 1B). Dalam terpencil yang diselitkanBuah pinggang, podocytes dikenal pasti menggunakan pelabelan nuklear dengan eGFP-histone dalam tikus transgenik kami menyatakan eGFP di bawah promoter podocin (eGFP:Pod-rtTA tikus). Nombor Podocyte telah diukur menggunakan gabungan pelabelan metabolik in vivo ini dan morfekometri 3D (Rajah 1C).
Kehilangan Podocyte pada tikus yang sihat dan tua
Tikus yang sihat mengandungi 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus pada garis dasar (i.e.at tekanan perfusi fisiologi 50 mmHg) (Rajah 2A). Glomeruli Juxtamedullary lebih besar daripada yang ada di korteks luar (Rajah Tambahan 2), tetapi ini tidak dikaitkan dengan nombor podosit yang lebih tinggi (87.0± 23.65 vs 90.1 ± 18.49, masing-masing, Fib 2B). Tiada perbezaan dalam bilangan podocytes yang berkaitan dengan seks diperhatikan (lihat di bawah). Pada tikus muda, tiada kehilangan ketara podosit pada tinggi (300 mmHg) atau maksimum (>>300 mmHg) tekanan perfusi (85.62 ± 10.83 dan 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, masing-masing) (Rajah 1A). Di bahagian-bahagian PAS, perubahan histologi ringan diperhatikan terutamanya pada tikus tua (Rajah 2A), yang bebas daripada tekanan perfusi. Di samping itu, pelebaran tiub dan edema interstisial adalah jelas akibat perfusi. Pada manusia, usia yang lebih tua (53 ± 10 tahun) telah dikaitkan dengan kekurangan podosit mutlak dan relatif [20]. Berbanding dengan tikus muda, tikus kita yang berumur 72 minggu mengandungi bilangan podosit yang jauh lebih rendah bagi setiap glomerulus pada garis dasar (52.81 ± 13.8 SD), menunjukkan bahawa kira-kira 40% podosit telah hilang. Perfusi pada tekanan tinggi atau maksimum mengakibatkan hanya pengurangan nombor podosit yang sangat ringan (48.65 ± 16.8 SD dan 41.06 ± 17.7 SD, masing-masing). Kerana ketepatan kaedah pengiraan (nombor podocyte mutlak dalam 40 glomeruli per tetikus) [21], kehilangan podosit 7.9% dan 22% selepas perfusi dengan 300 atau >>300 mmHg masing-masing berbanding garis dasar menunjukkan bahawa peningkatan kecil dalam kehilangan podosit dengan tekanan yang lebih tinggi ini bukanlah penemuan kebetulan. Di bahagian PAS, perubahan glomerular ringan diperhatikan pada tikus tua di garis dasar (pengembangan mesangial dan sklerosis sekali-sekala, Rajah 2F). A
Kehilangan Podocyte selepas kecederaan akut
Serum anti-GBM digunakan untuk tikus muda yang sihat untuk menyebabkan kecederaan yang ketara dan spesifik kepada podosit. Pada titik masa yang sangat awal (iaitu 3 hari) selepas induksi anti-GBM glomerulonephritis, effacement proses kaki umum diperhatikan dalam semua glomeruli oleh mikroskopi elektron penghantaran (Rajah 3A-D). Dalam terpencil perfusedBuah pinggangdiperolehi daripada tikus ini, pada garis dasar (iaitu perfusi dengan 50mmHg) nombor podocyte per glomerulus dikurangkan sebanyak 20% berbanding dengan kawalan (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, masing-masing) (Rajah 3E). Perfusi dengan tekanan yang lebih tinggi (300 dan >>300 mmHg) menghasilkan pengurangan ketara bilangan podocyte per glomerulus (50.84 ± 7.82 dan 53.18 ± 4.26, masing-masing), iaitu 27% dan 24% pengurangan tambahan (Rajah 3E). Apabila menganalisis glomeruli individu, tikus anti-GBM, perfusi dengan >>300 mmHg menyebabkan lebih daripada 80% kehilangan podocyte dalam minoriti glomeruli (Rajah 3E). Ini selaras dengan sifat fokus model anti- GBM. Dalam glomeruli juxtamedullary, kerugian podocyte lebih ketara berbanding glomeruli subkortikal (56.66 ± 16.9 dan 47.35 ± 17.07, masing-masing) (Rajah 3F)
Dengan mikroskopi elektron penghantaran (TEM), perubahan tertentu diperhatikan selepas tekanan perfusi yang tinggi, khususnya detasmen podosyte fokal dari GBM dan membran bawah tanah yang dikecam (Rajah.3D). Serpihan selular hadir di dalam kapilari serta dalam ruang Bowman (>>300 mmHg); endothelium tidak menunjukkan perubahan ketara. PAS mengenal pasti pelebaran tiub. Tiga hari selepas suntikan serum anti-GBM, tiada lesi sabit telah berkembang lagi (Gamb. 3G-I). Lelaki menunjukkan tahap kehilangan podosit yang lebih tinggi berbanding wanita (63.71 ± 2.11 vs 75.81 ± 3.83 podocytes per glomerulus), yang konsisten dengan pemerhatian bahawa tikus mal lebih mudah terdedah kepada anti-GBM anti-GBM dan membentuk lebih banyak bulan sabit selular semasa penyakit (Rajah 3J). Walau bagaimanapun, kehilangan tambahan podosit selepas tekanan perfusi yang tinggi adalah serupa pada lelaki dan perempuan (Rajah 3J).
Rajah 3. Kehilangan Podocyte selepas kecederaan akut. (A-B) Mikroskopi elektron penghantaran dari kawalanBuah pinggangsetiap- bersatu pada tekanan rendah dan selepas tekanan supramaximal (>>300 mmHg) menunjukkan seni bina proses kaki biasa. (C-D) Mikroskopi elektron penghantaran mendedahkan penemuan tipikal effacement proses kaki selepas suntikan serum anti-GBM pada garis dasar. Selepas perfusi dengan tekanan yang lebih tinggi, kawasan membran bawah tanah yang dikecam diperhatikan. (E) Jumlah bilangan podocytes per tetikus dalam tikus anti-GBM pada garis dasar dan di bawah tekanan yang lebih tinggi (300 mmHg) atau supramaximal (>> 300 mmHg); (setiap bulatan mewakili 1 buah pinggang; n = 7 buah pinggang kawalan dengan 50mmHg, n = 8 buah pinggang anti-GBM dengan 50mmHg, n = 4 buah pinggang dengan 300 mmHg atau >> 300mmHg). (F) Jumlah bilangan podocytes per glomerulus dalam juxtamedullary dan subkortical glomeruli; setiap bulatan mewakili 1 glomerulus subkortikal (n= 20 glomeruli pro tetikus) dan setiap segi tiga mewakili 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro tetikus). (G-I) Pewarnaannya terhadap tikus anti-GBM di garis dasar mengenal pasti protein, manakala tiga hari selepas suntikan serum anti-GBM tiada lesi sabit boleh ditemui. Selepas perfusi dengan tekanan yang lebih tinggi, pelebaran tubule-interstisial dan edema diperhatikan. (J) Jumlah nombor podocyte setiap tetikus antara lelaki dan perempuan; setiap bulatan mewakili 1 buah pinggang (n = 4 buah pinggang kawalan dengan 50mmHg, n = 4 buah pinggang anti-GBM dengan 50mmHg, n = 2 buah pinggang dengan 300 mmHg atau >> 300mmHg). Untuk pelbagai perbandingan ANOVA. P<0.0001, ***p ="">< 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">
Mengesan podocytes yang hilang dalam tubules
eGFP+ podocytes sentiasa diperhatikan dalam lumen tubules proksimal di mana mereka kelihatan mematuhi sempadan berus sel tubule proksimal (Rajah 4A). Podocytes ini tidak dihanyutkan dalam hyperperfusedBuah pinggangs, sebaliknya mereka mematuhi agak ketat ke sempadan berus untuk menahan aliran luar biasa air kencing utama pada tekanan perfusi yang sangat tinggi. Untuk mengesahkan identiti mereka, podocytes telah diwarnakan bersama dengan penanda khusus podocyte (iaitu, p57, synaptopodin dan WT-1) sebagai tambahan kepada penanda pengesanan keturunan genetik nuklear eGFP (Rajah 4B). Nombor Podocyte jauh lebih rendah dalam glomeruli tersebut dengan mematuhi podocytes dalam tubule proksimal yang berkaitan, dan kehadiran podocytes dalam tubules secara songsang dikaitkan dengan bilangan podocytes per glomerulus (Rajah 4C).
Kehilangan keutamaan podocytes di lokasi perihilar
Akhirnya, kami menyiasat sama ada kehilangan podocyte yang didorong oleh peningkatan akut dalam tekanan perfusi mungkin berlaku di lokasi keutamaan glomerulus (iaitu di tiang vaskular berbanding tiang tiub tuft glomerular). Untuk menganalisis pengagihan ruang detasmen podocyte, tiang vaskular ditandakan dalam setiap glomerulus (diperolehi dalam 3D) berdasarkan isyarat lectin dan jarak setiap podosit dari tiang vaskular ditentukan secara separa automatik. Jarak individu dari tiang vaskular dipisahkan menjadi kuartil (Gamb. 4E). Seperti yang digambarkan dalam Rajah 4E, majoriti podocytes berkelompok dalam 2 kuartil tengah (iaitu kuartil 2 dan 3). Kurang daripada 12% daripada podocytes disetempatkan sama ada pada yang pertama, iaitu tiang vaskular, atau kuartil keempat, iaitu yang paling jauh dari tiang vaskular. Apabila perfusi dengan tekanan >> 300 mmHg, tiada perubahan ketara dalam pengedaran spacial podocytes diperhatikan pada tikus muda dan sihat. Pada tikus yang berumur, jarak podocyte dari tiang vaskular secara amnya meningkat, kemungkinan besar mencerminkan hipertrofi glomerular, manakala hiperperfusi mengakibatkan detasmen istimewa podocytes dekat dengan tiang vaskular (kuartil pertama dikurangkan dari 11.5 hingga 4.9% pada tikus tua, Rajah 4E). Begitu juga, detasmen istimewa podocytes dekat dengan tiang vaskular diperhatikan dalam podocytes effaced (anti-GBM, kuartil pertama dikurangkan dari 25 hingga 5%).
Perbincangan
Dalam kajian ini, kami mengkaji kesan akut tekanan penapisan tinggi dan aliran penapisan pada kehilangan podosit dalam buah pinggang murine perfused terpencil, menggunakan kaedah yang paling tepat pada masa ini untuk menentukan nombor podosit. Penemuan utama pertama kajian kami adalah bahawa podosit yang sihat tidak terdedah kepada tekanan ricih akut dalam vivo, seperti yang dicadangkan sebelum ini oleh kajian kultur sel [11]. Yang mengejutkan kami, walaupun tekanan suprafisiologi yang melampau (lebih daripada 450 mmHg) menyebabkan detasmen podocyte yang ketara. Sebaliknya, mikroskopi elektron penghantaran mendedahkan bahawa ketiga-tiga lapisan penghalang penapisan kekal dipelihara dengan baik. Tikus yang lebih tua menunjukkan bilangan podocyte yang dikurangkan (seperti yang dilaporkan sebelum ini) dan ini dikaitkan dengan hanya peningkatan kerentanan yang sangat terhad kepada tekanan perfusi yang tinggi. Penemuan utama kedua adalah bahawa kecederaan podocyte sebelumnya menjadikan podosit terdedah kepada detasmen pada tekanan perfusi yang tinggi. Tikus anti-GBM menunjukkan proses kaki global effacement tiga hari selepas suntikan anti-GBM anti-GBM anti-GBM dan bilangan yang ketara terlepas pada tekanan perfusi tinggi. Dalam tikus yang berumur, kami membuat hipotesis bahawa fisiologi podocyte agak dipelihara dengan baik, menjadikan mereka kurang terdedah kepada detasmen. Dengan menggunakan pendekatan pengiraan separa automatik, setiap glomerulus dianalisis secara berasingan (jumlah 1200 glomeruli dianalisis). Kami mengesahkan bahawa glomeruli juxtamedullary mempunyai jumlah yang lebih tinggi daripada glomeruli subkortikal. Menariknya, nombor podocyte adalah sama, menunjukkan bahawa ketumpatan podocyte dikurangkan dalam glomeruli juxtamedullary. Di samping itu, glomeruli juxtamedullary juga lebih terdedah kepada peningkatan tekanan penapisan berbanding glomeruli subkortikal. Penemuan ini dapat menjelaskan sebahagiannya, mengapa lesi FSGS dapat diperhatikan pada frekuensi yang lebih tinggi dalam glomeruli yang lebih besar [22, 23].
Rajah 4. Pengesanan podosit dalam prox bersebelahan. (A) Imej wakil menunjukkan podocytes eGFP+ (hijau) dalam tubules. (B) Immunofluorescence mengotorkan podocytes yang dilabel bersama oleh transgene histone eGFP (hijau), dan penanda podosyte endogen p57 (merah), wt-1 (merah), dan synaptopodin (ungu). (C) Persatuan bilangan podosit per glomerulus dengan bilangan podosit yang dikenal pasti dalam tubule (n = 81 glomeruli dari tikus kawalan, n = 41 glomeruli dari tikus tua, dan n = 81 glomeruli dari tikus anti GBM). Untuk pelbagai perbandingan, ANOVA telah digunakan. P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">
Batasan kajian ini adalah tempoh pemerhatian yang singkat, kerana tiada kesimpulan boleh dibuat mengenai penyesuaian jangka panjang podosit kepada peningkatan tekanan penapisan. Telah dicadangkan bahawa tindak balas pertama podosit yang terdedah kepada tekanan ricih adalah untuk menjalani perubahan struktur pelindung [8, 24]. Perubahan ini termasuk kehilangan celah penapisan (iaitu FPE) dan penggantian slit-diafragma oleh persimpangan yang ketat atau ketat. Persimpangan yang merangkumi sebelum ini telah diterangkan dalam beberapa model penyakit glomerular [25-28]. Walau bagaimanapun, dalam kajian kami, kami mendapati bahawa podocytes dengan FPE lebih mudah terdedah kepada tekanan perfusi+ yang lebih tinggi. Oleh itu, keputusan kami menunjukkan bahawa perubahan penyesuaian ini tidak mencukupi untuk melindungi daripada detasmen atau berpotensi sebaliknya, bahawa mereka menjadikan podocytes lebih mudah terdedah kepada detasmen. Seterusnya, boleh dikatakan bahawa terpencil itu meresapBuah pinggangbukan sistem fisiologi dan bahawa tekanan yang digunakan jauh lebih tinggi daripada di bawah keadaan vivo. Untuk pengetahuan kami, tidak ada model lain yang menggunakan yang utuh berdaya majuBuah pinggangwujud yang akan membolehkan menyiasat kesan peningkatan tekanan perfusi secara langsung. Dengan penggunaan vasodilators sebelum dan semasa perfusi, pelebaran maksimum kapal pra-glomerular seperti yang disebabkan untuk membolehkan aliran yang tidak terhad (hiperfiltrasi) dan penghantaran maksimum tekanan perfusi yang meningkat ke dalam glomerulus. Dalam kajian ini, kesan akut tekanan perfusi yang lebih tinggi telah dikaji. Kesan jangka panjang hiperperfusi patologi boleh menjadi lebih merosakkan, membawa kepada kehilangan lebih banyak podocyte. Walau bagaimanapun, kajian kami mencadangkan, bahawa kehilangan podosit kronik ini tidak didorong oleh daya aliran penapisan semata-mata tetapi lebih kepada perubahan (mal-)adaptif dalam podocytes yang mengurangkan kepatuhan mereka kepada GBM. Pesakit dengan penyakit glomerular mendapat manfaat daripada rawatan antihipertensi dengan mencegah (mal-)perubahan struktur penyesuaian podosit.
Kesimpulan
Kerja ini memberikan bukti in vivo pertama bahawa podosit yang sihat sangat melekat pada GBM dalam buah pinggang tikus yang sihat dan dapat menahan tekanan perfusi yang sangat tinggi. Penuaan atau kecederaan podosit akut yang lebih ketara dengan effacement global, menjadikan podosit terdedah kepada detasmen pada peningkatan tekanan perfusi.
