Kesan Cistanche Deserticola Pada Percambahan, Apoptosis Dan Penghijrahan Talian Sel Kanser Payudara T-47D Dengan Mengawal LncRNA LIFR-AS1

[Abstrak]Objektif Untuk menyiasat kesan Cistanche deserticola pada percambahan, apoptosis dan penghijrahan saluran sel kanser payudara T-47D dan peraturannya pada rantai panjang bukan pengekodan (Lnc) RNA leukemia faktor perencatan reseptor RNA antisense RNA-1 (LIFR-AS1). Kaedah T-47Sel D dibiakkan dalam kepekatan yang berbeza (100, 200, 400 μ Tanam ekstrak air Cistanche deserticola dalam medium kultur g/ml selama 24 jam, dibahagikan kepada kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi daripada Cistanche deserticola. Pada masa yang sama, sel kultur normal digunakan sebagai kumpulan kawalan. Pindahkan si-NC dan si-LIFR-AS1 ke dalam sel T-47D dan tambahkan 400 μ Tanam dengan g/ml kultur Cistanche deserticola sederhana selama 24 jam, termasuk kumpulan Cistanche deserticola dos tinggi ditambah si-NC dan kumpulan Cistanche deserticola dos tinggi ditambah si-LIFR-AS1. Tindak balas rantai polimerase kuantitatif pendarfluor masa nyata (qRT PCR) digunakan untuk mengesan ungkapan tahap LIFR-AS1; Keupayaan proliferasi sel pengesanan menggunakan ujian pengklonan plat; Menggunakan sitometri aliran untuk mengesan kitaran sel dan kadar apoptosis; Keupayaan penghijrahan sel telah diuji dengan ujian calar. Keputusan Berbanding dengan kumpulan kawalan, tahap ekspresi dan kadar apoptosis LIFR-AS1 dalam kumpulan dos pertengahan dan tinggi Cistanche deserticola telah meningkat dengan ketara, bilangan klon berkurangan dengan ketara, bahagian sel G0-G1 meningkat dengan ketara, dan bahagian sel S dan penyembuhan calar kadar dikurangkan dengan ketara (P<0 05); Compared with Cistanche deserticola high-dose+si NC group, the number of clones formed in Cistanche deserticola high-dose+si LIFR-AS1 group was significantly increased, the proportion of G0-G1 cells and the apoptosis rate were significantly reduced, and the proportion of S cells and the scratch healing rate were significantly increased (P<0 05). Conclusion Cistanche deserticola can induce cell cycle arrest by up-regulating the expression of LIFR-AS1, thereby reducing the proliferation of breast cancer cells, inducing apoptosis, and inhibiting cell migration.

[Kata kunci] Cistanche deserticola; Rantai panjang bukan pengekodan (Lnc) RNA leukemia faktor perencatan reseptor RNA antisens -1 (LIFR-AS1); Kanser payudara; Percambahan; Apoptosis; pemindahan

Kanser payudara adalah salah satu tumor malignan yang biasa di klinik. Kadar kejadian kanser payudara di China adalah setinggi 12. 5 peratus 2 peratus , kadar penyembuhan kanser payudara awal adalah setinggi lebih daripada 86 peratus, tetapi masih tiada penanda berkesan untuk diagnosis awal kanser payudara. Radiokimia · 624 · Chinese Journal of Gerontology Vol.43, Januari 2023, dan rawatan komprehensif lain boleh meningkatkan kesan rawatan pesakit, tetapi prognosis pesakit adalah buruk. Pada masa ini, patogenesis kanser payudara belum dijelaskan. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa hyperoside, apigenin, dan ubat lain mempunyai kesan anti-kanser payudara, Walau bagaimanapun, mekanisme khusus tindakannya masih belum dijelaskan [1-4].

Kesan Cistanche-Antitumor

Cistanche deserticola tergolong dalam tumbuhan anggur saka keluarga Rubiaceae, yang mempunyai kesan mengencangkan buah pinggang dan menghilangkan angin dan kelembapan. Kajian telah menunjukkan bahawa Cistanche deserticola mempunyai kesan farmakologi seperti kesan anti-tumor dan antioksidan [5]. Walau bagaimanapun, kesan terapeutik Cistanche deserticola pada kanser payudara dan kemungkinan mekanismenya belum dijelaskan. Long chain noncoding (Lnc) RNA leukemia inhibitory factor receptor antisense RNA-1 (LIFR-AS1) rendah dinyatakan dalam kanser payudara dan boleh mengawal percambahan dan penghijrahan sel [6]. Walau bagaimanapun, sama ada LIFR-AS1 boleh digunakan sebagai sasaran terapeutik Cistanche deserticola terhadap kanser payudara tidak diketahui. Kajian ini adalah untuk meneroka sama ada Cistanche deserticola boleh menjejaskan pembiakan, apoptosis dan penghijrahan sel kanser payudara T-47D dengan mengawal selia LIFR-AS1.

1 Bahan dan Kaedah

1.1 Bahan dan reagen

Cistanche deserticola (20190203) telah dibeli daripada Bozhou Baichuan Pharmaceutical Co., Ltd; Sel kanser payudara T-47D telah dibeli daripada Guangzhou Saiku Biotechnology Co., Ltd; Lipofectamine2000 (20190412) dan kit pengesanan apoptosis (20181223) telah dibeli daripada Beijing Solaybao Technology Co., Ltd; Reagen Trizol (20181203) telah dibeli daripada Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd; Transkripsi terbalik (20181103) dan reagen pengesanan tindak balas rantai polimerase kuantitatif (PCR) pendarfluor (20181116) telah dibeli daripada Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd; Si-NC dan si-LIFR-AS1 telah dibeli daripada Shanghai Jima Pharmaceutical Technology Co., Ltd; Limfoma sel B anti-manusia arnab (Bcl) -2 dan antibodi protein X (Bax) berkaitan Bcl-2 telah dibeli daripada Syarikat Santa Cruz di Amerika Syarikat; Antibodi sekunder IgG anti-arnab kambing yang dilabelkan dengan lobak pedas peroksidase (HRP) telah dibeli daripada Wuhan Doctor Bioengineering Co., Ltd. Instrumen PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata StepOnePlus dibeli daripada ABI Corporation di Amerika Syarikat; Sitometri aliran FACS Calibur telah dibeli daripada Syarikat Beckman Kurt di Amerika Syarikat.

Faedah kesihatan serbuk cistanche-Antitumor

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Pengelompokan eksperimen

Ekstrak air Cistanche deserticola [7]: Timbang 100 g ubat Morinda officinalis, rendam dalam air selama 30 minit, dan kemudian rebus selama 60 minit. Tapis air rebusan dan rebus semula selama 45 minit. Kumpulkan turasan dua kali dan pekat di bawah tekanan yang dikurangkan kepada isipadu 160 ml. Sejukkan dan masukkan ke dalam peti sejuk selama 24 jam. Selepas sentrifugasi pada 3000 r/min, ambil supernatan dengan kepekatan ubat 2 g/ml. Cairkan larutan kultur kepada kepekatan yang diperlukan 100, 200, dan 400 μ g /ml. Sel T-47D dibiakkan dalam kepekatan yang berbeza (100, 200, 400 μ Tanam ekstrak air Cistanche deserticola dalam medium kultur g/ml selama 24 jam, dibahagikan kepada kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi bagi Cistanche deserticola. Pada masa yang sama, sel kultur normal digunakan sebagai kumpulan kawalan. Pindahkan si-NC dan si-LIFR-AS1 ke dalam sel T-47D dan tambahkan 400 μ Medium kultur g/ml Cistanche deserticola telah dikultur selama 24 jam, termasuk kumpulan Cistanche deserticola plus si-NC dos tinggi dan kumpulan Cistanche deserticola plus si-LIFR-AS1 dos tinggi.

1.3 Pengesanan tahap ekspresi LIFR AS1 menggunakan kuantifikasi pendarfluor masa nyata (qRT) - PCR

Jumlah RNA sel T-47D dalam setiap kumpulan telah diekstrak menggunakan kaedah Trizol dan ditranskripsi terbalik untuk mensintesis cDNA. Enzim DeRNA (DEPC) telah ditambah dan dicairkan 20 kali dalam air sebelum disimpan dalam peti sejuk -20 darjah. Sistem qRT-PCR dan prosedur tindak balas dikendalikan mengikut arahan kit pengesanan kuantitatif pendarfluor, dan ungkapan relatif LIFR-AS1 (rujukan dalaman GAPDH) dalam sel telah dikesan.

1.4 Eksperimen pengklonan plat

Inokulasikan sel T-47D dalam setiap kumpulan pada 6-plat perigi (1 × 103 sel/perigi) dan kemudian letakkannya dalam inkubator untuk penanaman selanjutnya selama 14 hari. Basuh dengan penimbal fosfat (PBS) yang telah disejukkan dan tambah metanol (500 μ l) Letakkannya di dalam peti sejuk -20 darjah selama 20 minit, buang metanol dan tambah 1 peratus larutan pewarna kristal ungu (400 μ l) Inkubasi pada suhu bilik selama 15 minit dan basuh dengan air suling. Selepas pengeringan, perhatikan bilangan klon yang terbentuk.

1.5 Eksperimen pengesanan kitaran sel

Sel T-47D dalam setiap kumpulan (1 × Inokulasi 105 keping/ml pada 96 plat perigi (100 μ L/telaga), sentrifuge pada kelajuan 3000 r/min selama 5 minit, buang supernatan dan tambah pra -sel suspensi PBS yang disejukkan semula (500 μ l) Tambah etanol prasejuk (70 peratus ) pada ampaian sel, buang supernatan, dan tambah RNaseA (50 μ l) Tambah larutan pewarna propidium iodide (PI) (450) selepas { {13}}mandi air minit pada 37 darjah μ l) Eramkannya dalam peti sejuk 4 darjah selama 30 minit dan analisa perkadaran kitaran sel dalam setiap kumpulan menggunakan sitometri aliran FACS Calibur dan perisian Flowjoy.

cistanche hidup padang pasir

1.6 Pengesanan sitometri aliran kadar apoptosis sel

Tambahkan PBS prasejuk pada sel T-47D untuk mencuci, buang supernatan dan tambah 500 pada mendakan sel μ Sel penggantungan semula dengan larutan penimbal, beroperasi mengikut kit pengesanan apoptosis dan mengesan kadar apoptosis sel.

1.7 Ujian calar

Inokulasikan sel T{{0}}D pada 6-plat perigi (1 × 103/telaga), selepas setiap kumpulan diproses, lukis garisan dalam arah mendatar di bahagian bawah plat kultur sebagai rujukan. Selepas 48 jam penanaman, lukis garisan sekali lagi dan perhatikan lebar calar pada titik dua masa untuk mengira kadar penyembuhan calar [(lebar calar 0 h - lebar calar 48 h)/lebar calar 0 h × 100 peratus 〕.

1.8 Pengesanan Western blot bagi ekspresi protein Bax dan Bcl-2.

Selepas mengekstrak jumlah protein sel T{{0}}D, mengesan kepekatan protein dan mengambil jumlah sampel protein yang sesuai untuk tindak balas SDS PAGE. Selepas pemindahan membran dan pengedap, tambahkan pelarut antibodi pertama (1:1000) dan pelarut antibodi kedua (1:5000), dan gunakan sistem pengimejan gel automatik untuk menganalisis nilai kelabu setiap jalur protein. 1.9 Pemprosesan statistik menggunakan SPSS 21 Lakukan ujian-t dan ANOVA sehala menggunakan perisian 0.

Kajian Eksperimen mengenai Cistanche deserticola

2 Keputusan

2.1 Kesan Cistanche deserticola pada pembiakan T-47D dan Ungkapan LIFR-AS1

Berbanding dengan kumpulan kawalan, tahap ekspresi LIFR-AS1 dalam kumpulan dos pertengahan dan tinggi Cistanche deserticola adalah lebih tinggi dengan ketara, bilangan klon berkurangan dengan ketara, perkadaran sel fasa G0-G1 jauh lebih tinggi. , dan bahagian sel fasa S adalah jauh lebih rendah, dan perbezaan setiap indeks antara kumpulan dos pertengahan dan tinggi Cistanche deserticola deserticola adalah signifikan secara statistik (semua P<0. 01) 05), but there was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells among the groups (P>0 05), lihat Jadual 1.

2. 2 Kesan Cistanche deserticola pada apoptosis T-47D

Berbanding dengan kumpulan kawalan, kadar apoptosis dan tahap protein Bax dalam kumpulan Cistanche deserticola sederhana dan dos tinggi meningkat dengan ketara, manakala tahap protein Bcl{1}} menurun dengan ketara. Perbezaan dalam pelbagai penunjuk antara kumpulan Cistanche deserticola dos sederhana dan tinggi adalah signifikan secara statistik (semua P<0. 05) 05), as shown in Table 1, Figure 1, and Figure 2

Jadual 1 Kesan Cistanche deserticola pada pembentukan klon kitaran sel T-47D, ekspresi LIFR-AS1 dan apoptosis sel (x ± s, n=3)

Berbanding dengan kumpulan kawalan: 1) P<0 05; Compared with the low-dose group of Cistanche deserticola: 2) P<0 05; Compared with the medium and low dose group of Cistanche deserticola: 3) P<

Rajah 1: Kesan Cistanche deserticola pada apoptosis T-47D dalam setiap kumpulan

1-4: Kumpulan kawalan, kumpulan dos rendah Cistanche deserticola, kumpulan dos sederhana Cistanche deserticola, kumpulan dos tinggi Cistanche deserticola

Rajah 2 Kesan Cistanche deserticola pada ekspresi protein apoptosis T-47D

2.3 Kesan Morinda officinalis pada migrasi T-47D

Berbanding dengan kumpulan kawalan [({0}} ± 1. 39) peratus perbandingan, kumpulan dos sederhana Cistanche deserticola [(43 56 ± 1.00 peratus , dan kadar penyembuhan calar kumpulan Cistanche deserticola dos tinggi [(23 87 ± 0.72 peratus ] menurun dengan ketara, dan kumpulan Cistanche deserticola dos tinggi adalah jauh lebih rendah daripada kumpulan Cistanche deserticola dos pertengahan (P<0 05).

2.4 Kesan daripadagangguan LIFR-AS1 pada pembiakan T-47D yang dirawat dengan Cistanche deserticola

Berbanding dengan kumpulan Cistanche deserticola dos tinggi tambah si NC, bilangan klon yang terbentuk dalam kumpulan Cistanche deserticola dos tinggi tambah si LIFR-AS1 meningkat dengan ketara, perkadaran sel G0-G1 berkurangan dengan ketara dan bahagian sel S meningkat (P<0 There was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells between the two groups (P>0. 05) 05), lihat Jadual 2.

Jadual 2 Kesan Mengganggu LIFR-AS1 pada Kitaran Sel T-47D, Klonogenesis, Apoptosis dan Migrasi dalam Rawatan Cistanche deserticola (x ± s, n=3)

2. 5 Kesan Mengganggu LIFR-AS1 pada Apoptosis T-47D yang Dicetuskan oleh Rawatan Cistanche Deserticola

Berbanding dengan kumpulan Cistanche deserticola tambah si-NC dos tinggi, kadar apoptosis, paras protein Bax dan paras protein Bcl-2 bagi kumpulan Cistanche deserticola berdos tinggi ditambah si-LIFR-AS1 telah dikurangkan dengan ketara. (H<0 05), see Table 2, Figure 3, and Figure 4.

Kesan gangguan 2.6 dengan LIFR-AS1 pada penghijrahan T-47D dan ekspresi LIFR-AS1 dalam sel yang dirawat Cistanche deserticola

Berbanding dengan kumpulan Cistanche deserticola tambah si-NC dos tinggi, kadar penyembuhan calar kumpulan Cistanche deserticola si-LIFR-AS1 dos tinggi ditambah dengan ketara meningkat, dan ekspresi LIFR-AS1 berkurangan dengan ketara (P<0 05), see Table 2.

Rajah 3 Kesan Mengganggu LIFR-AS1 pada Apoptosis T-47D dalam Rawatan Cistanche deserticola

1-2, Cistanche deserticola dos tinggi ditambah kumpulan si-NC, Cistanche deserticola dos tinggi ditambah kumpulan si-LIFR-AS1

Rajah 4: Kesan Mengganggu LIFR-AS1 pada Ekspresi Protein Apoptosis T-47D dalam Rawatan Cistanche deserticola

3 Perbincangan

Perubatan herba cina mempunyai kesan anti jangkitan, anti tumor dan lain-lain. Ia ringan dan berkesan boleh mengurangkan beberapa gejala pada pesakit, tetapi patogenesis kanser payudara adalah lebih kompleks. Mekanisme molekul ubat herba Cina terhadap kanser payudara masih belum dijelaskan [8~10]. Cistanche deserticola mempunyai kesan meningkatkan imuniti, antioksida, dan rawatan osteoporosis yang berkesan, tetapi mekanisme tindakan spesifiknya belum diketahui [11,12]. Hasil kajian ini mencadangkan bahawa Cistanche deserticola boleh mengurangkan percambahan sel kanser payudara dengan mendorong penangkapan kitaran sel, dan ia boleh menggalakkan apoptosis sel kanser payudara dan menghalang penghijrahan sel sel kanser payudara.

Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor

Pengurangan ekspresi LIFR-AS1 dikaitkan dengan kelangsungan hidup yang lemah dalam kanser gastrik [13]. LIFR-AS1 menghalang pencerobohan dan metastasis kanser paru-paru bukan sel kecil melalui paksi miR-942-5p/zink finger protein (ZNF) 471 [14]. Keputusan ini menunjukkan bahawa mengganggu ekspresi LIFR-AS1 dengan ketara boleh membalikkan kesan Cistanche deserticola pada percambahan, apoptosis, dan penghijrahan sel-sel kanser payudara.

Ringkasnya, Cistanche deserticola boleh mendorong penangkapan kitaran sel, melemahkan keupayaan percambahan sel kanser payudara, menggalakkan apoptosis sel, dan menghalang penghijrahan sel. Mekanismenya berkaitan dengan regulasi ekspresi LIFR-AS1.

Herba Cina cistanche-Antitumor

4 Rujukan

1 Si L,Fu J,Liu W,et al． Silibinin menghalang penghijrahan dan pencerobohan sel MDA-MB-231 kanser payudara melalui induksi gabungan mitokondria〔J〕．Mol Cell Biochem,2020; 463( 1-2): 189-201．

2 Qiu J,Zhang T,Zhu X,et al．Hyperoside mendorong apoptosis sel kanser payudara melalui Ｒlaluan isyarat NF-κB pengantara OS〔J〕．Int J Mol Sci,2019; 21( 1): 131-41．

3 Menang YS,Seo KI. Lupiwighteone mendorong apoptosis yang bergantung kepada caspase dan bebas pada sel-sel kanser payudara manusia melalui menghalang laluan PI3K/ Akt /mTOＲ〔J 〕． Toksik Kimia Makanan,2020; 135 ( 1 ) : 110863-9.

4 Bauer D, Mazzio E, Soliman KFA. Analisis transkriptik keseluruhan apigenin pada sel-sel kanser payudara MDA-MB-231 TNF- immuno-activated〔J〕．Cancer Genomics Proteomics,2019; 16( 6): 421-31．

5 Lai Manxiang, Ruan Zhiyan, Xu Yiping Kemajuan penyelidikan tentang kesan farmakologi ubat tradisional Cina yang menguatkan buah pinggang Cistanche deserticola [J]. Perubatan Tradisional Asia Pasifik, 2017; 13( 1): 63-4．

6 Xu F,Li H,Hu C. LIFＲ-AS1 memodulasi Sufu untuk menghalang percambahan sel dan penghijrahan sebanyak miＲ-197-3p dalam kanser payudara〔J〕．Biosci Ｒep, 2019; 39( 7): 1-9．

7 Ilizati Khalifu Kesan ekstrak akueus Cistanche deserticola pada ekspresi EGFR dan protein HER-2 dalam sel osteosarcoma secara in vitro [D]. Beijing: Universiti Perubatan Beijing, 2019

8 Kushwaha PP,Vardhan PS,Kapewangolo P,et al．Bulbine frutescens fitokimia menghalang laluan isyarat takuk dan mendorong apoptosis dalam tiga kali ganda sel kanser payudara negatif dan luminal〔J〕．Life Sci,2019; 234( 1): 116783-9．

9 Zhao Z, Jin G, Ge Y, dan lain-lain． Naringenin menghalang penghijrahan sel kanser payudara melalui laluan isyarat sel radang dan apoptosis 〔J〕．Inflammopharmacology,2019; 27( 5): 1021-36．

10 Zan L, Chen Q, Zhang L, dan lain-lain． Epigallocatechin gallate ( EGCG) menyekat pertumbuhan dan tumorigenisiti dalam sel kanser payudara dengan menurunkan regulasi miＲ-25〔J〕．Bioengineered,2019; 10( 1): 374-82．

11 Zhang Xuexin, Xiao Liuying, Pan Jingqiang Kesan Cistanche deserticola pada percambahan sel tumor tikus dan ekspresi protein Bax dan Bcl-2 [J]. Perubatan Tradisional Cina, 2011; 34( 4): 598-601．

12 Li Yimin, Chen Jian, He Jianquan, et al Kesan serum ubat Cistanche deserticola pada ekspresi onkogen proto dan faktor pengikat teras 1 mRNA dalam sistem kultur ko osteoblas osteoklas ［ J ］. Jurnal Gerontologi Cina, 2015; 35( 9): 2328-31．

13 Wang HF,Lv JQ,Li HH,et al．Ekspresi LIFＲ-AS1 bukan pengekodan panjang yang tinggi berkorelasi dengan kelangsungan hidup yang lemah dalam karsinoma gastrik〔J〕． Eur Ｒev Med Pharmacol Sci,2020; 24( 10): 5378-84．

14 Wang Q,Wu J,Huang H,et al．lncＲNA LIFＲ-AS1 menyekat pencerobohan dan metastasis kanser paru-paru bukan sel kecil melalui paksi miＲ-942- 5p /ZNF471〔J〕．Cancer Cell Int,2020; 20( 1): 180190．