Kesan Shenkang Pada Fibrosis Renal Dan Pengaktifan Fibroblas Interstisial Renal Melalui Laluan JAK2/STAT3
Feb 27, 2022
Latar belakang
Penyakit buah pinggang kronik (CKD) terhasil daripada pelbagai penyakit yang berbeza yang merosakkan buah pinggang yang tidak dapat dipulihkan dan menyebabkan pelbagai jenis komplikasi pada pesakit [1]. Bagi pesakit yang menjalani dialisis, kualiti hidup sangat terjejas, dan kos perubatan adalah sangat tinggi [2]. Proses patologi utamakecederaan buah pinggangmembawa kepada normalbuah pinggangpemusnahan parenkim dan pembentukan tisu parut yang progresif, yang akhirnya membawa kepada fibrosis. buah pinggangfibrosis termasuk fibrosis interstisial tiub dan glomerulosklerosis [3], yang membawa kepada kemusnahanrtisu enal dan kehilangan fungsi.buah pinggangfibrosis tubulointerstitial adalah laluan tipikal untuk perkembangan progresif hampir semua CKD dan asas patologi utama untuk peringkat akhirpenyakit buah pinggang,yang dicirikan oleh atrofi sel epitelium tiub, penyusupan sel radang, pengaktifan menyimpang dan pertumbuhanbuah pinggangfibroblas dan pengumpulan matriks ekstraselular (ECM) yang berlebihan [4, 5]. Sel-sel efektor, -aktin otot licin (-SMA)-miofibroblas positif, mensintesis dan merembeskan ECM. Pengaktifan fibroblas interstisial ke dalam myofibroblas boleh membantu membaiki tisu yang rosak. Walau bagaimanapun, apabila proses pembaikan ini tidak normal dan ECM yang berlebihan dirembeskan, kerosakan buah pinggang yang tidak dapat dipulihkan akan terhasil. Sehubungan itu, laluan isyarat yang menjadi pengantara pengaktifan myofibroblast mungkin menjadi sasaran untuk mengurangkan prosesbuah pinggangfibrosis.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Laluan Janus kinase/transduser isyarat dan pengaktif transkripsi (JAK/STAT) ialah lata isyarat pleiotropik untuk pelbagai faktor pertumbuhan dan sitokin [6] yang mengantara pelbagai fungsi selular, termasuk kemandirian dan percambahan sel [7]. STAT3 diaktifkan oleh fosforilasi tyrosine (Tyr) pada Tyr705 melalui kinase Janus sebagai tindak balas kepada pelbagai faktor pertumbuhan dan sitokin, termasuk faktor pertumbuhan mengubah (TGF- ) [8]. STAT3 berfosforilasi membentuk dimer, yang kemudiannya dipindahkan ke nukleus, di mana mereka secara langsung mengikat urutan DNA dan mengawal ekspresi gen sasaran [9]. Pengaktifan STAT3 dan JAK2 meningkat dalam fibroblas interstisial renal fibrogenik yang disebabkan oleh halangan ureter unilateral (UUO) [10, 11]. Peningkatan dalam fosforilasi STAT3 juga telah diperhatikan dalam TGF{13}}sel NRK{14}}F yang dirawat TGF [12].
Rawatan semasa yang digunakan secara meluas untuk CKD selalunya disertai dengan kesan yang kurang memuaskan [13] dan kesan sampingan yang biasa. Oleh itu, adalah sangat penting untuk menyiasat dan mengenal pasti langkah rawatan yang berkesan untuk mencegah dan mengawal kejadian dan perkembangan CKD untuk meningkatkan prognosis pesakit. Shenkang (SK) ialah formula herba yang biasa digunakan yang mengandungi rhubarb (Rheum palmatum L. atau R. tanguticum Maxim. ex Balf.), sage merah (Salvia miltiorrhiza Bunge), bunga safflower (Carthamus tinctorius L.), dan astragalus (Astragalus mongholicus). Bunge). Sejak 1990-an, SK telah digunakan di China untuk merawat CKD dan penyakit berkaitan, termasuk nefropati diabetik (DN), kronik.kegagalan buah pinggang, glomerulonephritis, nefritis kronik danbuah pinggangketidakcukupan. Dengan kesan terapeutik yang jelas dan sedikit kesan sampingan, SK mungkin melambatkan perkembanganbuah pinggangdisfungsi dalam CKD. Dalam percubaan klinikal 2200 orang, keberkesanan SK dalam melindungi daripada kronikbuah pinggangkegagalan dan simptom yang dikaitkan dengan CKD berikutan rawatan dengan perubatan Cina tradisional ialah 73.05 dan 98.00 peratus , masing-masing. Selain itu, kadar pelepasan kreatinin dan tahap kreatinin serum (SCr) kekal stabil, menunjukkan bahawa SK mempunyai keberkesanan yang baik dan selamat untuk rawatan CKD [14]. Telah disahkan bahawa SK mampu mengurangkan CKD danbuah pinggangfibrosis dengan mengurangkan fibrosis, keradangan [15] dan apoptosis [16]. Walau bagaimanapun, kebanyakan kajian sedia ada mengenai subjek ini tidak cukup komprehensif dan tertumpu terutamanya pada TGF- dan laluan berkaitan. Model UUO diakui sebagai model eksperimen untuk menyiasat fibrosis buah pinggang. Dalam kajian ini, kami mengkaji kesan SK pada pengaktifan sel fibroblast NRK-49F dan fibrosis buah pinggang dalam tikus UUO. Kami selanjutnya menunjukkan bahawa kesan kuratif SK ini mungkin telah dicapai dengan menyasarkan laluan JAK2/STAT3 dalam sel NRK-49F kultur dan model tetikus UUO.
Kata kunci:Shenkang, Penyakit buah pinggang kronik, Fibrosis buah pinggang, UUO, Pengaktifan fibroblas buah pinggang, laluan JAK2/STAT3
Kaedah
Bahan kimia dan reagen SK telah dibeli daripada Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (Xi'an, China). Tablet kalium losartan dibeli daripada Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, China).
Kultur sel
Barisan sel fibroblast buah pinggang tikus (NRK-49F) diperoleh daripada Koleksi Sel Jenis Amerika (ATCC, Manassas, VA, Amerika Syarikat). NRK-49Sel F telah dibiakkan dalam medium lengkap, iaitu, medium Eagle's Modified Dulbecco (Invitrogen, CA, USA) yang mengandungi 5 peratus serum lembu janin, 1 peratus penisilin dan streptomycin dalam suasana 5 peratus CO 2 dan 95 peratus udara pada 37 darjah . Kemudian, sel telah dirawat dengan atau tanpa TGF- 1 (10ng/mL) (Novoprotein, Shanghai, China), penyekat reseptor angiotensin (ARB) (1 mg/mL) dan kepekatan kecerunan SK berikutan pematuhan, dan daya maju sel telah dinilai.
Ujian daya maju sel
Daya maju sel NRK-49F ditentukan menggunakan Kit Pengiraan Sel-8 (Dojindo, Kyushu, Jepun) mengikut arahan kit. Sel NRK-49F disalut pada ketumpatan 5 ×10 4 sel setiap telaga dalam 96-plat perigi. Terdapat 5 ulangan untuk setiap rawatan. Selepas 24j atau 48j kultur, medium dalam setiap telaga digantikan dengan 100 μL medium bebas serum yang mengandungi CCK-8 (10:1), dan sel-sel tersebut diinkubasi dalam inkubator selama 2 jam lagi. Penyerapan diukur pada panjang gelombang 450 nm. Kesan rawatan dikira sebagai peratusan sel hidup berbanding sel kawalan hidup yang dirawat dengan kenderaan sahaja.
Haiwan
Prosedur percubaan yang digunakan dalam kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Etika Haiwan Universiti Perubatan Tradisional Cina Beijing (No. BUCM{{{{30}}}},018,{ {39}}60,419-2023) dan mematuhi prinsip penggunaan dan penjagaan haiwan makmal yang diiktiraf di peringkat antarabangsa. Tikus jantan C57BL/6 berusia tiga puluh enam 8-minggu telah dibeli daripada Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). Tikus diletakkan di makmal haiwan bebas patogen khas di dalam bilik berhawa dingin (cahaya: 12-kitaran cahaya/gelap jam; suhu bilik: 25±1 darjah ; kelembapan relatif: 50± 10 peratus ) dan dibahagikan secara rawak kepada enam kumpulan berikut: kumpulan palsu, kumpulan UUO, kumpulan ARB dan kumpulan SK berdos tinggi, sederhana dan rendah. UUO diinduksi pada tikus dalam kumpulan UUO, kumpulan ARB dan kumpulan SK dos tinggi, sederhana dan rendah mengikut prosedur yang telah ditetapkan sebelum ini. Anestesia diinduksi dengan 2 peratus isoflurana dan dikekalkan dengan 1.5 peratus isoflurana. Senggatan membujur 1- hingga 2-sm dibuat di bahagian tengah abdomen kiri, dan ureter kiri dipisahkan secara terus-terang, diikat pada dua tempat dan kemudian dipotong di antara dua pengikatan. Kemudian, rongga perut ditutup, selepas itu analgesia diberikan selama 3 hari. Tikus dalam kumpulan palsu menjalani prosedur pembedahan yang serupa, termasuk anestesia sebelum dan selepas operasi, laparotomi, dan pemisahan tumpul ureter, tanpa pengikatan dan pemotongan ureter. Dari hari kedua selepas halangan, losartan diberikan secara intragastrik kepada tikus dalam kumpulan ARB pada dos 0.13mg/10g (0.15mL/10g). SK pada dos tinggi 0.08g/ 10g (0.13mL/10g), dos sederhana 0.04g/10g (0.13 mL/10g), atau dos rendah 0.02g/10g (0.13mL/10g) diberikan kepada tikus dalam kumpulan SK melalui urat ekor selama 14 hari selepas pengikatan ureter. Saline (0.13mL/10g) diberikan melalui urat ekor kepada tikus dalam kumpulan sham, UUO dan ARB, dan saline (0.15mL/10g) diberikan melalui gavage kepada tikus dalam kumpulan sham, UUO dan SK untuk mengurangkan berat sebelah. Selepas MRI, darah dikumpulkan daripada tikus melalui tusukan jantung selepas pengorbanan di bawah bius dalam (diinduksi dan dikekalkan dengan 2 peratus isoflurane) pada hari ke-14, dan tisu buah pinggang telah dikumpulkan. Serum diperoleh daripada darah keseluruhan dengan sentrifugasi pada 1000 (× g) (4 darjah ) selama 10 minit. Tahap serum urea nitrogen (BUN), SCr dan cystatin C (Cys-C) diukur dengan kaedah kolorimetrik. Pewarnaan hematoxylin dan eosin (HE) dan pewarnaan merah Sirius dilakukan untuk pengesanan histopatologi dan kolagen dalam struktur stromal buah pinggang yang terjejas, masing-masing. Untuk pewarnaan HE, kepingan direndam dalam air suling selepas dewaxing, direndam dalam larutan pewarna hematoxylin (Solarbio Science & Technology, China) diikuti dengan 1 peratus larutan alkohol asid hidroklorik untuk pemisahan warna, dibasuh dengan air paip, bertukar menjadi biru, dan diwarnakan dengan pewarna eosin. Potongan bernoda telah dibasuh dengan air suling, dehidrasi, dibersihkan, dan ditutup dengan getah neutral. Untuk pewarnaan merah Sirius, hirisan telah didewax, diwarnakan dengan Harris hematoxylin, dicuci, diwarnakan dengan Sirius red (Solarbio Science & Technology, China), diasingkan secara langsung dan dehidrasi dengan etanol mutlak, dibersihkan dengan xilena dan dimeteraikan. Lima bidang visualbuah pinggangkorteks dan kawasan tubul proksimal telah dipilih secara rawak untuk setiap tetikus. Perisian ImageJ digunakan untuk mengira kawasan merah, dan kawasan merah purata dikira untuk menentukan kawasan bernoda merah Sirius.
In vivo MRI untuk menilai tahap fibrosis buah pinggangTikus menjalani MRI pada hari ke-13 selepas pentadbiran SK dengan sistem MRI haiwan kecil 7T (sistem MRI Agilent 7T) dan gegelung badan. Anestesia diinduksi dengan 2 peratus isoflurana dan dikekalkan dengan 1.5 peratus isoflurana. Tikus diletakkan dalam kedudukan meniarap dengan perut mereka berpusat berbanding pusat gegelung frekuensi radio dan disambungkan kepada sensor pernafasan untuk memantau pernafasan. Sistem Kepala Tikus RAPID telah digunakan untuk pengujaan frekuensi radio dan pengesanan isyarat. Semua imbasan dilakukan di bawah pernafasan bebas. Imej diperoleh menggunakan jujukan pengimejan tensor resapan (DTI) dan parameternya adalah seperti berikut: arah=30 (b=1004.7s/mm 2 ) campur nol (b=0s/mm 2 ), Δ=4ms dan δ=16ms. Parameter pemerolehan imej adalah seperti berikut: TR/TE=3000ms/50.73ms, =60 darjah , matriks=128×128, FOV=2×2cm dan ketebalan kepingan pengimejan =1mm. Jumlah tempoh untuk penyediaan resapan ialah 4ms. Kelewatan imbasan 16ms telah digunakan antara imbasan dan dua b=0s/mm 2 imbasan telah digabungkan untuk mengehadkan kesan kelonggaran T1. Jumlah masa imbasan adalah lebih kurang 1j. Akibat hidronefrosisbuah pinggang skeabnormalan struktur yang disebabkan oleh halangan ureter, hanya korteks luar dan medula luar tisu buah pinggang tikus telah dinilai untuk analisis pengimejan. Peta anisotropi pecahan (FA) telah diperoleh dan dikira menggunakan perisian VNMRJ4.0. Untuk mengukur keamatan isyarat MRI dengan tepat dan menentukan tahap fibrosis antara kumpulan yang berbeza, lima satah pengimbasan telah dipilih untuk setiap sampel buah pinggang, dan tiga kawasan kecil yang menarik telah dipilih secara rawak untuk setiap satah pengimbasan.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Analisis Western blotJumlah protein diekstrak daripada sel menggunakan 500μL penimbal lisis protein RIPA (Solarbio, Beijing, China). Selepas sentrifugasi pada 10000 (× g) selama 10 minit, kit ujian protein Bradford (Applygen, Beijing, China) digunakan untuk kuantifikasi protein. Jumlah protein yang setara (40ug) telah dinyahtutur pada 100 darjah selama 10 minit dalam penimbal pemuatan (Applygen, Beijing, China), dipisahkan oleh elektroforesis pada 8–10 peratus gel SDS-PAGE mengikut berat molekul relatif, dan dipindahkan secara elektro ke 0.{{ Membran polivinilidena difluorida 10}}μm (Millipore, Bedford, MA, Amerika Syarikat). Kemudian, membran telah disekat dalam penampan menyekat (Nacalai Tesque, Jepun) pada 25±5 darjah dan diinkubasi dengan antibodi utama, termasuk -actin (Proteintech Group, USA, 1:5000), -SMA (Proteintech Group, USA, 1: 1000), kolagen III (col I) (Abcam, UK, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, USA, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, USA, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, Tyr1007) (1:1000), dan Peroxiredoxin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, USA, 1:800), at 4 darjah semalaman. Selepas dibasuh dalam TBST, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder (Cell Signaling Technology, USA, 1:10000) selama 1j pada suhu bilik dan kemudian dibasuh semula dengan TBST. Selepas itu, kit pengesanan ECL digunakan untuk pendedahan. Kemudian, ketumpatan optik jalur protein dibaca dan dianalisis oleh perisian Image Lab™ untuk analisis kuantitatif. Nilai densitometri telah dinormalkan kepada ketumpatan jalur -aktin.
PCR masa nyata kuantitatifJumlah RNA diekstrak daripada sel ataubuah pinggangtisu menggunakan Kit Miniprep RNA Total Monarch® mengikut arahan pengilang. Kemudian, Sistem Transkripsi Terbalik GoScript digunakan untuk mensintesis cDNA untaian pertama mengikut manual. PCR transkripsi terbalik kuantitatif masa nyata telah dilakukan dalam tindak balas 20-μL. Primer penargetan gen direka bentuk berdasarkan jujukan mRNA yang diterbitkan oleh NCBI dan disenaraikan dalam Jadual 1. Kelimpahan mRNA relatif ditentukan berdasarkan nisbah ekspresi mRNA spesifik kepada -aktin mRNA ekspresi dalam sampel yang sama, dan lipatan berubah berbanding dengan itu. dalam tikus dalam kumpulan palsu atau sel dalam kumpulan 0ng/mL TGF- 1 dikira dengan kaedah 2 -ΔΔCt.
Analisis statistikSemua data daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas dinyatakan sebagai min ± ralat piawai min (SEM). Analisis statistik telah dilakukan menggunakan pakej perisian SPSS 20.0. Ujian normaliti dan ujian homogeniti untuk varians telah dilakukan. Jika data bertaburan normal, ujian-t Pelajar digunakan untuk membandingkan perbezaan antara dua kumpulan, dan analisis varians sehala (ANOVA) (ujian LSD untuk varians genap dan ujian Dunnett untuk varians tidak sekata) digunakan untuk membandingkan perbezaan antara kumpulan. Jika data tidak diedarkan secara normal, ujian Mann-Whitney U bukan parametrik digunakan untuk membandingkan perbezaan antara dua kumpulan, dan ujian Kruskal-Wallis bukan parametrik digunakan untuk membandingkan perbezaan antara lebih daripada dua kumpulan. P<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">
Keputusan
Kesan SK pada NRK-49daya maju sel F selepas rawatan TGF- 1.
TGF- ialah sitokin fibrogenetik utama yang terlibat dalam fibrosis buah pinggang. Kami mula-mula menggunakan dos TGF- 1 yang berbeza (0, 10,20, 40 dan 80ng/mL) untuk merangsang pertumbuhan sel NRK- 49F. Rawatan dengan TGF- 1 selama 24 jam meningkatkan daya maju sel dalam cara bergantung kepada dos (Rajah 1a), yang konsisten dengan penemuan sebelumnya yang diperoleh melalui ujian MTT [17]. Kepekatan kecerunan SK (1, 2, 4, dan 8 mg/mL) dengan ketara mengurangkan peningkatan daya maju yang disebabkan oleh 10ng/mL TGF- 1 (Rajah 1b), dan kesan rawatan selama 48 jam adalah lebih jelas daripada rawatan selama 24 jam. Keputusan ini menunjukkan bahawa SK boleh menyekat pertumbuhan fibroblas buah pinggang yang disebabkan oleh TGF- 1-dan meningkatkan daya maju secara in vitro.
SK menghalang TGF- -ungkapan teraruh -SMA dan pemendapan komponen ECM dalam sel NRK-49FMyofibroblas ialah fibroblas aktif yang dicirikan oleh ekspresi pemendapan -SMA dan ECM. TGF- 1 ialah sitokin penting yang terlibat dalam pengeluaran ECM oleh myofibroblas dan fibrosis [18]. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a dan b, kedua-dua -SMA dan kol. III sangat diekspresikan dalam sel NRK-49F selepas rawatan TGF- 1, menunjukkan bahawa sel kultur telah ditukar kepada myofibroblas diaktifkan apabila diberikan TGF- 1. Untuk menyiasat lanjut sama ada SK boleh menyekat pengaktifan fibroblas interstisial buah pinggang, kami mengkaji kesan SK pada -SMA dan ekspresi kolagen III dalam sel NRK-49F. Pentadbiran SK telah menurunkan ekspresi -SMA dengan ketara (dalam cara yang bergantung kepada dos) (Rajah 2 dan 3a) dan kol. III (Gamb. 2), mencadangkan bahawa SK boleh secara langsung menyekat pengaktifan TGF- 1-teraruh sel NRK-49F. Terdapat kecenderungan untuk kesan 4ng/mL SK dalam mengurangkan ekspresi teraruh TGF- 1--SMA dan pemendapan komponen ECM menjadi lebih baik daripada losartan (1 mg/L).
SK menghalang TGF- 1-STAT3 teraruh, pengaktifan JAK2 dan ekspresi Prdx5 dalam sel NRK-49FUntuk meneroka kemungkinan mekanisme yang mana SK menghalang pengaktifan fibroblast, kami selanjutnya mengesan ekspresi gen STAT3 dan JAK2 dan tahap protein dalam sel NRK-49F menggunakan RT-qPCR dan Western blotting, masing-masing. Sel NRK-49F menyatakan tahap mRNA STAT3 dan JAK2 yang lebih tinggi selepas rangsangan TGF- 1 berbanding sebelum rawatan. SK secara mendadak menghalang ekspresi mRNA STAT3 dan JAK2 TGF- 1-pada 24j (Rajah 3b dan c). Fosforilasi STAT3 pada Tyr705 dan JAK2 pada Tyr1007 telah meningkat dengan kehadiran TGF- 1. SK juga menindas fosforilasi kedua-dua molekul ini (Rajah 2). Prdx5, pengawal selia laluan JAK2/STAT3, telah dikawal selia dengan kehadiran TGF- 1, dan kawal selia ini turut diterbalikkan oleh rawatan SK (Rajah 2). Hampir semua kesan, kecuali itu pada fosforilasi JAK2 dan ungkapan col. III, adalah lebih teguh dalam kumpulan SK dos tinggi daripada kumpulan SK dos rendah. Oleh itu, nampaknya jelas bahawa SK mungkin menghalang pengaktifan TGF- 1-terdorong fibroblas NRK-49F melalui mengawal selia pengaktifan JAK2/STAT3. Pada 2ng/mL atau 4 ng/mL, SK mempunyai kesan yang lebih baik dalam memperbaiki TGF- 1-pengaktifan STAT3 dan JAK2 serta ekspresi Prdx5 berbanding losartan.
SK mengurangkan disfungsi buah pinggang yang disebabkan oleh UUO dan perubahan morfologi buah pinggangModel tikus fibrosis buah pinggang telah ditubuhkan dengan mendorong UUO. Rajah 4 a, b, c menunjukkan indeks disfungsi buah pinggang kumpulan palsu, kumpulan UUO, kumpulan ARB, dan kumpulan SK berdos tinggi, sederhana dan rendah selepas 14 hari rawatan. Dos tinggi SK mengurangkan tahap Cys-C dengan ketara (P Kurang daripada atau sama dengan 0.05; Rajah 4a) dan tahap SCr (P Kurang daripada atau sama dengan {{12} }.01; Rajah 4c), dan SK menurunkan tahap BUN dengan ketara pada semua dos (P Kurang daripada atau sama dengan 0.05 atau P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; Rajah 4b). Keputusan di atas mencadangkan bahawa SK memperbaiki kemerosotan fungsi buah pinggang dan fibrosis buah pinggang dan bahawa kesan SK adalah serupa dengan losartan. Pewarnaan HE buah pinggang mendedahkan bahawa pengumpulan ECM, penyusupan sel radang, pelebaran dan/atau atrofi tubul renal, degenerasi dan nekrosis sel epitelium tubule renal tanpa perubahan jelas dalam struktur glomerular dalam kumpulan UUO (Rajah 4d). Kerosakan fungsi buah pinggang telah dikurangkan kepada tahap yang berbeza-beza dalam kumpulan rawatan yang berbeza berbanding dengan kumpulan UUO; dos sederhana dan dos tinggi SK mencapai kesan terbaik, walaupun tahap fungsi buah pinggang dalam kumpulan operasi palsu tidak dicapai dalam mana-mana kumpulan rawatan.
SK menurunkan nilai FA berkaitan fibrosis yang dikesan menggunakan DTISeperti yang digambarkan oleh Rajah 5, nilai FA yang mempunyai hubungan linear dengan tahap fibrosis dalam tisu sebenar ditentukan oleh in vivo DTI. Berbanding dengan kumpulan palsu, nilai FA dalam kumpulan UUO telah meningkat dengan ketara (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>
SK menghalang pengaktifan fibroblast dan pemendapan komponen ECM dalam tikus UUOSelain itu, kami menilai ungkapan penanda pengaktifan fibroblast -SMA, protein khusus fibroblast-1 (FSP-1), dan komponen ECM klasik fibronektin (FN), col. III dan kolagen I (kol I) dalam kumpulan SK palsu, UUO dan dos sederhana menggunakan PCR masa nyata. Oleh kerana dos sederhana SK adalah sama dengan dos yang disyorkan secara klinikal dan kerana peningkatan keseluruhan dalam kumpulan dos sederhana adalah lebih tinggi daripada kumpulan dos tinggi dan rendah, dos sederhana SK digunakan untuk menilai ekspresi mRNA. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7a dan b, SK dos sederhana telah mengurangkan peningkatan dalam -SMA, FSP, FN, col. III dan kol. saya tingkatkan. Keputusan ini konsisten dengan keputusan pewarnaan Siriusred, yang menunjukkan bahawa kawasan merah fibrosis dalam buah pinggang yang terjejas dalam kumpulan ARB dan kumpulan sederhana dan rendah SK adalah jauh lebih kecil daripada kumpulan yang tidak dirawat (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">
Kesan SK pada tahap STAT3, JAK2 dan TGF-mRNA dan ekspresi molekul pengawalseliaan dan penindas protein isyarat sitokin (SOCS) SOCS1 dan SOCS3 dalam tikus UUOSeperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7c, tahap mRNA TGF-, JAK2 dan STAT3 telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan UUO berbanding dengan kumpulan palsu pada hari ke-14. Berbanding dengan tikus palsu, tikus UUO yang dirawat SK dos sederhana menunjukkan penurunan ketara dalam tahap JAK2 dan TGF-mRNA pada hari ke-14 selepas halangan, tetapi SK tidak menurunkan tahap mRNA STAT3 dengan ketara selepas UUO. Keputusan ini mencadangkan bahawa kesan SK pada fibrosis buah pinggang dan pengaktifan fibroblast dalam tikus UUO mungkin berlaku melalui peraturan pengaktifan JAK2 dan STAT3 tanpa perubahan dalam jumlah ekspresi mRNA STAT3. Tahap TGF-, molekul hiliran STAT3, juga dikurangkan oleh SK dalam konteks ligation ureter. Protein SOCS dianggap penting untuk peraturan negatif isyarat JAK / STAT [19]. Sebagai tindak balas kepada UUO, tahap SOCS1 dan SOCS3 meningkat dengan ketara dan menurun dengan ketara dalam kumpulan SK berbanding kumpulan model (Rajah 7d). Keputusan ini mencadangkan bahawa SK boleh menekan laluan JAK/STAT untuk mengurangkan ekspresi molekul pengawalseliaan negatifnya sebagai maklum balas.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Perbincangan
Fibrosis tubulointerstitial renal adalah laluan umum utama penyakit buah pinggang peringkat akhir. Myofibroblas, yang berasal daripada pelbagai sel, termasuk sel epitelium, sel endothelial, dan pericytes, melalui transdifferentiation epithelial-mesenchymal (EMT) atau endothelial-mesenchymal transdifferentiation (EndoMT), boleh membantu membaiki tisu yang rosak dengan menghasilkan ECM dan -SMA kepada menjana ketegangan kontraktil [20]. Di antara jenis sel yang berbeza ini, fibroblas interstisial yang diaktifkan adalah sumber utama myofibroblas, menyumbang 50 peratus daripada sel-sel ini [21]. Selain -SMA, fibroblas yang diaktifkan juga secara khusus menyatakan FSP-1. TGF- ditakrifkan sebagai pemacu utama fibrosis buah pinggang dan telah didapati diaktifkan dalam pelbagai model penyakit buah pinggang dan sel buah pinggang. TGF- yang diaktifkan mengikat kepada reseptor TGF- dan mendorong molekul isyarat hiliran, termasuk molekul dan faktor transkripsi yang berkaitan dengan EMT, EndoMT, pengaktifan fibroblast, pengeluaran ECM dan perencatan degradasi ECM, melalui Smad-termasuk TGF- [23], STAT3 diaktifkan oleh fosforilasi Tyr pada Tyr705 melalui kinase Janus. Protein STAT3 yang diaktifkan memasuki nukleus dalam bentuk dimer dan mengikat gen sasaran. Selain itu, STAT3 mendorong transduksi isyarat laluan TGF [24]. Malah, dalam model UUO, pengaktifan STAT3 pada Tyr705 dalam fibroblas interstisial buah pinggang, bersama-sama dengan lesi histopatologi dan pengaktifan fibroblas, meningkat dari hari pertama, memuncak pada 7 hari dan meningkat sehingga 14 hari [25]. STAT3 berkemungkinan terlibat dalam pelbagai jenis penyakit buah pinggang melalui pengawalan ekspresi gen sasaran, terutamanya faktor transkripsi yang terlibat dalam pembangunan CKD. Dalam kajian ini, pada hari ke-14 selepas halangan, tahap mRNA -SMA, JAK2 dan STAT3 meningkat dengan ketara dengan peningkatan tahap fibrosis buah pinggang.
Menurut penyelidikan terdahulu, SK dan komponennya didapati dapat mengurangkan kerosakan patologi, menghalang percambahan sel endothelial, mengurangkan proteinuria dan glomerulosklerosis, melindungi sisa fungsi buah pinggang dan melambatkan perkembangan penyakit, sekali gus campur tangan dalam CKD dan perkembangan fibrosis buah pinggang; walau bagaimanapun, tiada laporan mengenai pengaktifan fibroblast. Menurut kajian terdahulu dan keputusan CCK-8 kami, 10 ng/mL TGF- 1 telah digunakan untuk mengaktifkan fibroblas; 1, 2, dan 4 mg/mL dipilih sebagai dos rendah, sederhana dan tinggi SK; dan 48 jam telah dipilih sebagai masa intervensi dalam kajian ini. Penyelarasan -SMA dan perubahan morfologi disertai dengan percambahan dan pengaktifan sel, yang ditunjukkan sebagai peningkatan daya maju sel dan pengeluaran ECM, berlaku dalam sel NRK-49F selepas rangsangan TGF- 1 [26, 27]. Dalam kajian ini, telah disahkan bahawa TGF{15}} mengawal selia ekspresi gen -SMA dan ECM dengan mengaktifkan laluan JAK2/STAT3 huluan. Data kami menunjukkan bahawa SK secara langsung menghalang TGF- 1-pengaktifan sel NRK-49F dan pengeluaran ECM secara in vitro. Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa SK boleh melemahkan fibrosis buah pinggang dalam tikus UUO in vivo, mengurangkan pengumpulan ECM interstisial pada hari ke-14 selepas halangan. Keputusan ini menunjukkan bahawa SK boleh melemahkan fibrosis buah pinggang dengan ketara dengan menghalang pengaktifan fibroblast interstisial dan mengurangkan ekspresi -SMA. Mekanisme potensi kesan antifibrotik SK adalah perencatan pengaktifan fibroblas melalui peraturan laluan isyarat JAK2/STAT3 kedua-dua in vitro dan in vivo. SK dos sederhana juga membalikkan dengan ketara pengawalseliaan TGF- 1 yang disebabkan oleh UUO, menunjukkan bahawa kesan SK berkaitan dengan TGF- . Oleh kerana TGF- dan STAT3 berinteraksi antara satu sama lain, SK mungkin menghalang STAT3 dengan menyasarkan TGF- , mengecilkan TGF- dengan menyasarkan STAT3 atau menghalang kedua-duanya. Kajian farmakologi sistem kami sebelum ini meramalkan STAT3 sebagai salah satu molekul sasaran yang mungkin SK [28], dan penemuan ini telah disahkan dalam kajian ini. Kami menggunakan losartan, ARB
boleh melemahkan fibrosis buah pinggang dan apoptosis sel tubular renal dengan ketara dengan menghalang fosforilasi protein isyarat STAT3 dalam model tikus UUO [29], sebagai ubat kawalan positif. Penemuan sebelumnya adalah konsisten dengan data kami. Peroxiredoxins ialah keluarga peroksidase yang bergantung kepada merkaptan yang boleh mengurangkan tekanan oksidatif dengan memangkinkan pengurangan hidrogen peroksida. Tahap Prdx5 dalam buah pinggang tikus menurun pada hari pertama selepas UUO. Telah diperhatikan bahawa ekspresi Prdx5 secara beransur-ansur meningkat sehingga 5 hari selepas rawatan TGF-. Ekspresi berlebihan Prdx5 ditunjukkan untuk menghalang pemfosforilasi teraruh TGF- -STAT3 dan mengurangkan ekspresi -SMA dan FN akibat TGF dalam sel NRK-49F, menunjukkan bahawa Prdx5 mengawal selia TGF secara negatif- - pengaktifan STAT3 teraruh dan fibrosis dalam sel NRK-49F [12]. Mekanisme pengawalseliaan utama yang mendasari isyarat STAT3 endogen melibatkan keluarga protein SOCS. Selepas STAT3 diaktifkan oleh sitokin, dimer STAT3 diangkut ke gen sasaran hiliran aruhan nuklear, termasuk SOCS [30]. Khususnya, kawasan perencatan kinase SOCS1 boleh mengikat secara langsung boleh melemahkan fibrosis buah pinggang dan apoptosis sel tubular renal dengan menghalang fosforilasi protein isyarat STAT3 dalam model tikus UUO [29], sebagai ubat kawalan positif. Penemuan sebelumnya adalah konsisten dengan data kami. Peroxiredoxins ialah keluarga peroksidase yang bergantung kepada merkaptan yang boleh mengurangkan tekanan oksidatif dengan memangkinkan pengurangan hidrogen peroksida. Tahap Prdx5 dalam buah pinggang tikus menurun pada hari pertama selepas UUO. Telah diperhatikan bahawa ekspresi Prdx5 secara beransur-ansur meningkat sehingga 5 hari selepas rawatan TGF-. Ekspresi berlebihan Prdx5 ditunjukkan untuk menghalang pemfosforilasi teraruh TGF- -STAT3 dan mengurangkan ekspresi TGF- -teraruh -SMA dan FN dalam sel NRK-49F, menunjukkan bahawa Prdx5 mengawal selia TGF secara negatif{{ 38}}pengaktifan STAT3 teraruh dan fibrosis dalam sel NRK-49F [12]. Mekanisme pengawalseliaan utama yang mendasari isyarat STAT3 endogen melibatkan keluarga protein SOCS. Selepas STAT3 diaktifkan oleh sitokin, dimer STAT3 diangkut ke gen sasaran hiliran aruhan nuklear, termasuk SOCS [30]. Khususnya, kawasan perencatan kinase SOCS1 boleh mengikat secara langsung
kepada JAK2 dan menghalang fosforilasi STAT3 [31]. Pengaktifan JAK/STAT yang disebabkan oleh UUO menyebabkan ketinggian ekspresi SOCS [32]. Selepas rangsangan dengan 10 ng/mL TGF- 1 selama 48j, ekspresi protein Prdx5 dalam sel NRK-49F meningkat dengan ketara, yang konsisten dengan keputusan sebelumnya. SK (4 mg/ml) mengurangkan tahap protein Prdx5 dengan ketara selepas 48 jam intervensi. Pada hari ke-14 selepas UUO, tahap mRNA SOCS1 dan SOCS3 dalam buah pinggang yang terjejas telah dikawal dengan ketara dalam kumpulan UUO berbanding dengan kumpulan kawalan, menunjukkan bahawa pengaktifan isyarat STAT3 selepas UUO mendorong ekspresi SOCS1 dan SOCS3 kepada mengawal selia isyarat STAT3 yang terlalu aktif secara negatif. Selepas 14 hari campur tangan SK, tahap mRNA SOCS1 dan SOCS3 menurun dengan ketara. Keputusan ini menunjukkan bahawa bukannya meningkatkan pengawal selia negatif secara langsung untuk menghalang isyarat JAK2/ STAT3, SK menghalang JAK2/STAT3, menyebabkan pengawalseliaan menurun Prdx5, SOCS1 dan SOCS3. Oleh itu, JAK2 / STAT3 boleh menjadi sasaran terapeutik langsung SK untuk fibrosis buah pinggang.
MRI adalah kaedah yang sangat selamat untuk menilai perubahan struktur dan fisiologi dalam buah pinggang tanpa menggunakan agen kontras intravena [33, 34]. Pengimejan berwajaran penyebaran (DWI) ialah kaedah MRI yang terkenal yang digunakan untuk imej pergerakan molekul atau resapan yang mencerminkan perubahan dalam struktur mikro tisu biologi [35]. DTI ialah teknologi pengimejan baharu yang dibangunkan berdasarkan pengimejan berwajaran penyebaran (DWI) yang boleh menggambarkan bukan sahaja kelajuan molekul air tetapi juga arah pergerakannya, iaitu anisotropi. Berbanding dengan DWI, DTI lebih sensitif dan tepat dalam mencerminkan perubahan dalam penyebaran air. DTI juga boleh memberikan maklumat tambahan tentang arah dan jumlah resapan yang diukur berdasarkan FA. Hueper et al. [36] menunjukkan bahawa dalam tikus DN, FA berkaitan dengan glomerulosklerosis, fibrosis interstisial dan kecederaan tiub buah pinggang. Yan et al. [37] mendapati bahawa FA mungkin merupakan biomarker DN awal. Kaimori et al. [38] memerhatikan hubungan linear antara nilai FA dan tahap fibrosis tisu sebenar dalam model tikus UUO. Dalam kajian ini, kami mengoptimumkan parameter untuk mengurangkan masa pengimbasan, masa anestesia dan penggunaan sumber eksperimen. Keputusan DTI adalah konsisten dengan pewarnaan merah Sirius dari segi tahap fibrosis buah pinggang yang disebabkan oleh UUO dan keupayaan SK untuk mengurangkan fibrosis buah pinggang. Pada tahap tertentu, penemuan ini mendedahkan bahawa SK mempunyai kesan nyata terhadap fibrosis buah pinggang dalam vivo. Dalam kajian ini, kami menunjukkan mekanisme yang mana SK mengawal fibrosis interstisial buah pinggang dalam vivo dan in vitro. Dalam kajian masa depan, penggunaan perencat atau siRNA untuk menghalang JAK2/STAT3 diperlukan untuk mengesahkan lagi mekanisme ini.
Kesimpulan
Kesimpulannya, data kami mencadangkan bahawa SK boleh menghalang pengaktifan fibroblast buah pinggang dan fibrosis buah pinggang secara berkesan dalam tikus UUO dengan mengawal selia laluan isyarat JAK2 / STAT3. Keputusan kami memberikan pemahaman yang baik tentang mekanisme SK dalam merawat penyakit buah pinggang. Walau bagaimanapun, mekanisme molekul terperinci rawatan SK dalam fibrosis buah pinggang memerlukan penerokaan lanjut.
