Kesan Phenylethanol Glycosides Pada Faktor Pertumbuhan Mengubah – Laluan Isyarat P1/Smads dalam Fibroblas Parut Hipertrofik Manusia

Kesan glikosida phenylethanoid pada faktor pertumbuhan yang berubah - laluan isyarat p1/Smads dalam fibroblas parut hipertrofik manusia

Untuk maklumat lanjut:Ali.ma@wecistanche.com

[Abstrak]Objektif Berdasarkan kepada faktor pertumbuhan berubah - pl (TGF - pl)/ laluan isyarat Smads untuk menyiasat kesanglikosida fenilethanoiddaripadacistanche tubulosa(CPhGs) pada fibroblas parut hipertropik manusia (HSFbs) dan mekanisme yang mungkin. Kaedah Dari Mac hingga Jun 2019, 9 pesakit dengan parut hipertropik selepas bum telah dimasukkan. Fibroblas telah diasingkan daripada parut hipertropik dan dikultur. Parut hipertropik manusia telah dikeluarkan dan fibroblas dibiakkan secara in vitro. Kumpulan kosong, kumpulan model, kumpulan kawalan positif (TGF - pl tambah 5 - fluorouracil) dan kumpulan eksperimen (TGF - pl tambah CPhGs) telah disediakan. Kesan daripadaglikosida fenilethanoiddaripadacistanche tubulosapada kepekatan yang berbeza pada percambahan HSFbs telah dikesan oleh kit pengiraan sel {{0}} (CCK - 8) assay. Ungkapan Smad2, Smad3, Smad7, kolagen I (COL -1) dan kolagen HI (COL -3) mRNA telah dikesan oleh transkripase terbalik kuantitatif masa nyata - tindak balas rantai polimerase (RT - qPCR) dalam setiap kumpulan. Ungkapan protein Smad2, Smad3, Smad2 terfosforilasi (p - Smad2), Smad3 terfosforilasi (p - Smad3), Smad7, COL -1 dan COL {{20}} telah dikesan oleh Western blotting. Data ukuran dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (Min ± SD). Beberapa kumpulan telah dibandingkan menggunakan ANOVA sehala. Keputusan Kadar perencatan fibroblas selepas rawatan dengan CPhG pada 60 , 90 dan 120 mg/L selama 48 jam ialah (36.87 ±0.06) peratus berbanding (43.52 ±0.04) peratus berbanding (78.11 ±0.03) peratus , nilai F =45.070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="" <="" 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

{{0}}.04 ± 0.04, nilai F=14.780, P < {{21="" }}.05)="" ;="" keputusan="" western="" blotting="" menunjukkan="" bahawa="" ekspresi="" protein="" p-smad2="" dan="" p="" -smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3,="" dalam="" kumpulan="" eksperimen="" dan="" kumpulan="" kawalan="" positif="" adalah="" jauh="" lebih="" rendah="" daripada="" kumpulan="" model,="" dan="" ungkapan="" protein="" smad7="" adalah="" jauh="" lebih="" tinggi="" daripada="" yang="" terdapat="" dalam="" kumpulan="" model="" (0.="" 16="" ±="" 0.03="" lwn.="" 0.="" 11="" ±="" 0.02="" lwn.="" 0.06="" ±="" 0.{{="" 26}}),="" (0.="" 12="" ±="" 0.02="">

{{0}}.07 ± 0.{{10}}1 lwn. 0.04 ±{ {18}}.{{20}}1, nilai F =7.670, P < 0.05), (0.12 ±0.03 lwn. 0.15 ±0.06 lwn. 0.23 土 0.05, nilai F { {24}}.936, P<0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="" <="" 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[Kata kunci] Glikosida phenylethanoiddaripadacistanche tubulosa; Fibroblas parut hipertropik; Mengubah faktor pertumbuhan - laluan isyarat pl/Smads

Klik untuk produk cistanche deserticola ma dan Cistanche

Parut hipertropik (HS) ialah penyakit fibrotik pada kulit yang dicirikan oleh percambahan fibroblas (FBS) yang berlebihan, serta pemendapan matriks ekstraselular (ECM), yang merupakan sel pemboleh utama untuk pembentukan parut, boleh merembeskan sejumlah besar kolagen, dan faktor pertumbuhan berubah (TGF) - laluan isyarat P / Smads berkait rapat dengan pembentukan HS.Cistancheadalah ubat tradisional Cina tonik, ekstrak yang mana jumlah asid asetik phenylethanoid (cphgs) merupakan salah satu bahan utama yang memberi kesan perubatan dan mempunyai pelbagai fungsi biologi seperti anti-keradangan, anti-tumor, anti-radiasi, penghapusan radikal bebas. , dsb. kajian telah menunjukkan bahawa cphgs boleh menghalang percambahan sel stellate hepatik, dan ia boleh melakukannya dengan mengurangkan ungkapan Smad2, Smad3, Meningkatkan ungkapan Smad7 dengan itu menyekat transduksi laluan isyarat tgf-p / Smads dan kemudian melambatkan perkembangan daripada fibrosis hati. Matlamat kajian ini adalah untuk melihat kesan ke atas ekspresi gen dan protein yang berkaitan dengan fibroblas parut hipertrofik manusia (hsfbs) berdasarkan laluan isyarat TGF PL / Smad.

Bahan dan kaedah

1. Bahan:Cistanchecphgs telah dibeli daripada hechen pharmaceutical biotech Co., Ltd., Hetian, China; Serum lembu janin dibeli dari Clark Bioscience, Amerika Syarikat; Kit pengiraan sel TGF PL telah dibeli daripada pepro tech, Amerika Syarikat; Kit PCR kuantitatif pendarfluor telah dibeli daripada Takara Corporation, Jepun; Kit transkripsi terbalik semuanya dibeli daripada Thermo Fisher Scientific, Amerika Syarikat; Antibodi Smad2 / 3, p-Smad2 / 3 telah dibeli daripada teknologi isyarat sel, Amerika Syarikat; Antibodi kepada Smad7, COL-1, COL-3, gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (gap-dh) telah dibeli daripada abeam (UK); Membran polyvinylidene fluoride (PVDF) telah dibeli dari millipore, Amerika Syarikat.

2. Semua kes telah dipilih daripada Jabatan ortopedik, Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Xinjiang, dan tiga spesimen (semuanya pasti didiagnosis sebagai parut hipertrofik oleh patologi) dipilih secara rawak untuk kultur utama FBS; Percubaan ini telah diluluskan oleh jawatankuasa etika perubatan Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Xinjiang (nombor kelulusan 20170214-71), dan persetujuan termaklum diperoleh daripada pesakit dan keluarga mereka.

3. Cell grouping: randomly divided into blank group; Model group: 5 |ug / L TGF - & 1; Positive control: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Experimental group: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >, 120 mg / L) cphgso.

4. Pembiakan sel ditentukan oleh Kit pengiraan sel (CCK-8): hsfbs dalam fasa pertumbuhan logaritma telah diambil, sel daripada setiap kumpulan dianggap seperti yang direka bentuk dan nilai penyerapan setiap telaga setiap kumpulan dipantau secara berurutan pada Panjang gelombang 450 nm menggunakan pembaca plat mikro pada 24, 48 dan 72 jam.

5. Pengesanan ekspresi mRNA oleh RT qPCR: hsfbs dari setiap kumpulan selepas 48 jam intervensi dikumpulkan, RNA diekstrak dan jumlah ekspresi mRNA ditentukan.

6. Ekspresi protein ditentukan oleh analisis Western blot. Jumlah protein selular diekstrak 48 jam selepas rawatan daripada setiap kumpulan untuk mengesan ekspresi setiap protein.

7. Kaedah statistik: perisian statistik SPSS 22.0 digunakan untuk menganalisis dan data pengukuran dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (min ± SD), dan analisis varians sehala digunakan untuk perbandingan antara berbilang kumpulan, dan P < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Keputusan

Keputusan percambahan sel menunjukkan bahawa 60, 9{{10}}, dan 120 mg / L cphg selama 48 jam pada fibroblas, kadar perencatan ialah [(36.87 ±0.06) peratus : (43.52 ±0.04) peratus :(78.11 ±0.03) peratus ,F=45.073,P< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

Perbandingan ekspresi mRNA CoL-I, COL-3, Smad2 dan Smad3 dalam setiap kumpulan: berbanding dengan kumpulan model, kedua-dua kumpulan kawalan positif dan eksperimen boleh mengurangkan faktor pertumbuhan berubah - CoL-I, COL{{ 6}}, ekspresi mRNA Smad2, dan Smad3, dan mempromosikan ekspresi mRNA Smad7, dengan perbezaan yang ketara secara statistik. (1.56 ±0.01:0. 30 ± 0.25 : 0.21 ±0.04,F=39. 755, P<0.01; 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01;="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ;2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ;0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

Perbandingan p-Smad2, p-smad3, col-l, COL-3 dalam setiap kumpulan: berbanding dengan kumpulan kosong, ungkapan protein p-Smad2, col-l dalam kumpulan model meningkat, manakala Smad7 menurun; Berbanding dengan kumpulan model, kumpulan kawalan positif boleh mengecilkan ekspresi protein p-smad3, COL-1, COL-3 dan kumpulan eksperimen menunjukkan kesan perencatan pada ekspresi protein tinggi p- Smad2, p-smad3, col - 3. Ungkapan COL-3 telah dihalang kepada pelbagai darjah, manakala ungkapan Smad7 secara relatifnya meningkat dalam dua kumpulan, dan nilai ekspresi protein p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL{{27 }} dalam kumpulan kosong, kumpulan kawalan positif dan kumpulan percubaan ialah (0.{{30}}9 ±0.04,{ {38}}.16 ±{{40}}.03,0.11 ± 0.{{50}}2 ,0.06 ± 0.00),(0.07 ±0.03,0.12 ± 0.02,0.07 ± 0.01,0. 04 ±0. 01,F { {60}}. 670,P<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05,="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01),(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02,="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

Perbincangan

HS adalah hasil pembaikan tisu yang tidak dapat dielakkan, dan mekanisme kejadiannya terutamanya hiperproliferasi FBS, degradasi yang tidak mencukupi dan sebagainya membawa kepada pembentukan dan perkembangan HS. Tgf-p1 terlibat secara meluas dalam sel, tisu percambahan abnormal dan penyakit pembezaan dan berterusan sepanjang penyembuhan luka; Ia memberikan kesannya terutamanya melalui laluan isyarat tgf-p / Smads, di mana fosforilasi protein Smad2 / 3 membawa kepada peningkatan ekspresi protein fibrogenik intrasel dan ekstraselular, menggalakkan pengeluaran kolagen dan mempercepatkan perkembangan fibrosis; Smad7, sebagai pengawal selia negatif, boleh menghalang laluan ini melalui interaksi dengan reseptor tgf-p1 yang diaktifkan, dengan itu mengurangkan sintesis serat kolagen; Oleh itu, sama ada meningkatkan ekspresi Smad7 atau menghalang ekspresi Smad2 / 3 boleh menghalang perkembangan parut hipertropik.

Kajian ini menggunakan Cistanche cphgs kepada HS, penyakit fibrotik kulit, dan mendapati bahawa pelbagai dos cphgs menghalang pembiakan hsfbs yang disebabkan oleh tgf-p1; Selain itu, 90m & / L cphgs menghalang isyarat laluan dengan mempromosikan ekspresi Smad7 dan mengurangkan ekspresi Smad2 / 3 pada kedua-dua tahap ekspresi gen dan protein, dan mengurangkan pengeluaran CoL-I, COL-3, yang seterusnya menghalang perkembangan HS. Keputusan kami mengesahkan bahawa cphgs menghalang pengeluaran kolagen dengan campur tangan dalam ekspresi protein yang berkaitan dengan laluan isyarat tgf-p / Smads di bawah rangsangan tgf-p1. Keputusan kajian ini menunjukkan bahawa Cistanche cphgs menghalang percambahan dan berkesan mengurangkan rembesan kolagen fibroblas parut hipertropik melalui laluan isyarat tgf-p / Smads.