Kesan Ekstrak Cistanches Deserticola Pada Kecederaan Arnab RTEC Oleh H2O2

Abstrak: Sel epitelium tiub renal arnab telah dikultur secara in vitro untuk mengkaji kesan H2O2 ke atas pembiakan sel dan ekstrak Cistanche deserticola pada sel epitelium tiub yang dicederakan oleh H2O2 ． Morfologi sel digunakan untuk memerhatikan kesan H2O2 pada pembiakan sel epitelium tiub renal arnab dengan kaedah MTT dan kesan perlindungan 2,20 dan 200 mg·L － 1 C． ekstrak air deserticola dan ekstrak alkohol telah dikaji oleh pelepasan LDH． Keputusan menunjukkan bahawa bilangan perubahan morfologi sel secara beransur-ansur meningkat． Bilangan sel yang melekat dikurangkan secara beransur-ansur. Kadar perencatan percambahan sel dan pembebasan LDH telah meningkat bersama dengan peningkatan kepekatan H2O2 ． Dos tinggi C. ekstrak deserticola boleh mengurangkan dengan ketara kesan menghalang percambahan ＲTECs oleh H2O2 ( P ＜ 0． 01) ． Pengekstrakan air dan ekstrak alkohol C． deserticola boleh mengurangkan pelepasan LDH dengan ketara ( P ＜ 0． 01) ． H2O2 mempunyai beberapa kesan ke atas tindak balas percambahan ＲTECs arnab, manakala C． ekstrak deserticola mempunyai kesan perlindungan terhadap kecederaan ＲTECs oleh H2O2 ．

Kata kunci: Cistanches deserticola; sel epitelium tiub buah pinggang; mukadimah kerosakan sel

Cistanche deserticola, juga dikenali sebagai ginseng padang pasir ialah batang mesofil yang kering, bersisik, bagi Cistanche deserticola YC Ma atau Cistanche tubulosa (Schenk) Wish dalam keluarga Orobaceae. Ia mempunyai kesan mengencangkan buah pinggang, memberi manfaat kepada pati dan darah, melembapkan usus, dan melegakan sembelit. Digunakan secara tradisional untuk kekurangan yang buah pinggang, intipati dan kekurangan darah, mati pucuk dan kemandulan, sakit pinggang dan lutut, kelemahan otot dan tulang, dan kekeringan usus dan sembelit, ia adalah ubat tonifying buah pinggang yang paling kerap digunakan dalam sejarah.. 

Cistanche deserticola

H2O2, sebagai satu bentuk spesies oksigen reaktif, mempunyai kesan yang kuat terhadap mendorong peroksidasi lipid dan boleh bertindak balas dengan hampir mana-mana komponen selular, menyebabkan peroksidasi lipid rantai, dan membawa kepada apoptosis dan disfungsi sel [2,3]. Percubaan ini terutamanya menyiasat kesan ekstrak Cistanche deserticola pada perencatan percambahan akibat H2O2-dan kecederaan sel epitelium tiub renal arnab dan terlebih dahulu meneroka kesan perlindungannya pada sel epitelium tiub renal.

1 Bahan dan Kaedah

1.1 Ubat eksperimen

Cistanche deserticola ma telah dibeli daripada Sichuan Chuannan Pharmaceutical Co., Ltd. (nombor kelompok 151201).

cistanche hidup padang pasir

1.2 Haiwan

Arnab putih New Zealand, jantan, berumur 20 hari, dibeli dari pangkalan percubaan Institut Penyelidikan Ternakan Guizhou, dengan nombor lesen haiwan SCXK (Guizhou) 2012-001.

1.3 Reagen

DMEM/F-12 (1:1), Gbico Corporation; Serum lembu janin, Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd; Dimetil sulfoksida (DMSO), Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd; H2O2, Sichuan Jinshan Pharmaceutical Co., Ltd; Trypsin, Syarikat Amresco; Thiazole blue (MTT), Genview; Kit ujian sitotoksisiti bukan radioaktif, Promega Corporation; Etanol kontang, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 Instrumen

Inkubator CO2, Jenis 3111, Thermo Fisher Scientific; Penanda enzim, jenis 1510, Thermo Fisher Scientific; Meja kerja ultra bersih, SW-CJ-1FD, Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; Mikroskop pendarfluor terbalik, Ningbo Shunyu; Penyejat berputar, RE-52AA, Kilang Alat Biokimia Yarong Shanghai; Pengering beku, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 Kaedah

1. 5.1 Penyediaan ekstrak Cistanche deserticola

Ambil herba ubatan kering Cistanche deserticola dan kisar menjadi kepingan kecil. Timbang dengan tepat 100 g setiap serbuk dan tambah 10 kali ganda jumlah air suling dan 75 peratus etanol untuk memanaskan dan refluks untuk pengekstrakan 3 kali. Kali pertama ialah 3 jam, dan kali kedua ialah 1 5 jam, kali ketiga selama 1 jam, cantumkan 3 turasan, kurangkan tekanan dan pekat kepada ekstrak, kirakan hasil ekstrak sebagai 22 30 peratus , ekstrak etanol 21 70 peratus , sisa alkohol yang meruap, mekanisme pengeringan beku untuk mendapatkan air dan ekstrak alkohol daripada Cistanche deserticola, dimeterai, dikeringkan dan disimpan di tempat yang gelap untuk kegunaan masa hadapan.

1. 5. 2 Kultur Sel

Bina model sel epitelium tiub renal menggunakan kaedah yang diterangkan oleh Zhao Dan et al. [4], asingkan dan kultur sel epitelium tiub renal primer daripada 20-arnab berumur sehari, dan tunggu sehingga sel itu membesar kepada lebih 90 peratus hidangan kultur, dan kemudian mencernanya dengan trypsin. Menggunakan medium kultur lengkap DMEM/F-12 yang mengandungi 1 peratus serum lembu janin pada kadar 1 dua × 104 sel telah diinokulasi pada plat 96 telaga dan dikultur pada 37 darjah dan 5 peratus CO2.

1. 5. 3 Penubuhan model kecederaan sel epitelium tiub renal arnab yang disebabkan oleh 3 H2O2

Rujuk 1 5. 2 Inokulasi sel, dan selepas 48 jam kultur sel yang stabil, gunakan H2O2 untuk kerosakan. Sediakan kumpulan eksperimen dan kumpulan kawalan kosong, dengan 4 ulangan dalam setiap kumpulan, diulang tiga kali. Kumpulan eksperimen: Gantikan medium kultur lengkap dengan kepekatan H2O2 yang berbeza, dengan kepekatan H2O2 550, 500, 450, 400, dan 350, masing-masing μ Mol · L-1, kumpulan kawalan kosong: Gantikan medium kultur lengkap, teruskan menanam selama 24 jam dalam keadaan 37 darjah dan 5 peratus CO2, lakukan pemeriksaan mikroskopik, dan kumpulkan gambar. Kaedah MTT [5] digunakan untuk mengukur pembiakan sel selepas tindakan H2O2, dan nilai penyerapan (nilai OD) diukur pada 490 nm. Menggunakan kit pengesanan sitotoksisiti bukan radioaktif untuk menentukan perubahan dalam pelepasan LDH sel selepas rawatan H2O2, pelepasan LDH ( peratus )=jumlah LDH supernatan/(jumlah LDH supernatan ditambah jumlah LDH lisat) × 100 peratus . Pewarnaan pendarfluor AO/EB [6]: Ambil masing-masing 100 μ G/mL larutan AO dan 100 μ 100 g/mL larutan EB setiap μ L. Gaul rata dan tambah 10 pada setiap perigi μ L. Segera letakkannya pada kontras fasa terbalik mikroskop pendarfluor untuk pemerhatian, mengekalkan medan pandangan pemerhatian tidak berubah dalam masa 5 minit, dan kumpulkan imej di bawah cahaya biru pada 450 ± 10 nm dan cahaya hijau pada 532 ± 10 nm, masing-masing. Gunakan sistem pengumpulan pendarfluor untuk sintesis pendarfluor untuk mendapatkan imej pewarnaan pendarfluor.

1. 5. 4 Kesan 4 serbuk ekstrak Cistanche pada H2O2-kerosakan yang disebabkan oleh sel epitelium tubular renal arnab

Serbuk cistanche

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche untuk penyakit buah pinggang

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Menurut 1 5. 2 Inokulasi sel, dan selepas 24 jam kultur sel yang stabil, tambahkan 200 ul medium kultur lengkap yang mengandungi ekstrak Cistanche deserticola ke setiap telaga untuk pra-melindungi sel selama 24 jam. Sediakan kumpulan eksperimen, kumpulan model dan kumpulan kawalan kosong, dengan tiga ulangan setiap kumpulan. Kumpulan eksperimen dan kumpulan model: gantikan dengan 400 μ Medium kultur lengkap dengan mol · L-1 H2O2; Kumpulan kawalan kosong: medium kultur lengkap. Teruskan bercucuk tanam selama 24 jam. Proliferasi sel diukur menggunakan kaedah MTT, dan perubahan dalam pelepasan LDH sel diukur menggunakan kit ujian sitotoksisiti bukan radioaktif.

1.6 Pemprosesan statistik

Keputusan data dinyatakan dalam x ± s menggunakan perisian statistik SPSS 19 0 telah digunakan untuk analisis statistik. Analisis varians faktor tunggal digunakan untuk perbandingan antara kumpulan, dan kaedah LSD digunakan untuk perbandingan berbilang antara kumpulan, dengan P<0 05 indicating statistical significance.

2 Keputusan dan Analisis

2.1 Perubahan morfologi sel epitelium tiub renal arnab yang disebabkan oleh H2O2

Selepas sel epitelium tubular renal arnab dirawat dengan kepekatan H2O2 yang berbeza selama 24 jam, morfologi sel epitelium tubular renal arnab diperhatikan di bawah mikroskop, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1. Dengan peningkatan kepekatan H2O2, bilangan sel dengan perubahan morfologi secara beransur-ansur meningkat, bilangan sel yang melekat pada sel parietal secara beransur-ansur berkurangan, beberapa sel menjadi lebih panjang, gloss sel berkurangan, dan saiznya berkurangan. Kepekatan H2O2 mencapai 550 μ Mol · L-1, akson hilang, membran sel pecah, pengecutan sel, jurang sel meningkat, dan jurang muncul antara tompok sel.

Rajah 1 Kesan kepekatan H2O2 ke atas morfologi arnabRTEC ( 100 × )

2.2 Kesan 2.2 H2O2 pada pembiakan sel epitelium tiub renal arnab

Gunakan 350, 400, 450, 500, dan 550 masing-masing μ Mol · L-1 H2O2 merawat sel epitelium tubular renal arnab selama 24 jam, dan penyerapan diukur menggunakan kaedah MTT. Keputusan menunjukkan bahawa kepekatan H2O2 yang berbeza mempunyai kesan perencatan ke atas percambahan sel epitelium tiub renal arnab, dengan nilai IC50 439 07 μ mol·L － 1, 500 μ Kesan perencatan H2O2 dengan mol · L -1 pada percambahan sel boleh mencapai lebih 50 peratus selepas 24 jam, jadi kepekatan ini dipilih untuk penyelidikan seterusnya.

2.3 Kesan 2.3 H2O2 pada pembebasan LDH dalam sel epitelium tubular renal arnab

Selepas 24 jam rawatan H2O2 pada sel epitelium tiub renal arnab, nilai OD tindak balas LDH dalam supernatan sel dan lisat sel diukur menggunakan kaedah pengesanan sitotoksisiti bukan radioaktif, dan pembebasan LDH daripada sel telah dikira. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 1. Kepekatan H2O2 yang berbeza boleh menyebabkan peningkatan pelepasan LDH daripada sel epitelium tiub renal arnab, dan semakin tinggi kepekatan H2O2, semakin besar pelepasan LDH dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. H2O2 pada kepekatan 400 mmol · L-1 menyebabkan pelepasan LDH sel melebihi kumpulan kosong lebih daripada 50 peratus , mengakibatkan kerosakan sel yang teruk.

Tab. 1 Kesan H2O2 pada pelepasan LDH daripada RTEC arnab

Nota: Berbanding dengan kumpulan kawalan kosong, * P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2.4 Hasil pewarnaan pendarfluor AO/EB sel epitelium tiub renal arnab yang dirawat dengan 2.4 H2O2

Selepas sel epitelium tiub renal arnab dirawat dengan H2O2 selama 24 jam, sel-sel tersebut telah diwarnai dengan pendarfluor AO/EB, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Ia telah dinilai awal bahawa mekanisme H2O2 pada sel epitelium tiub renal arnab adalah terutamanya untuk menyebabkan nekrosis. Kepekatan H2O2 yang berbeza boleh menyebabkan pelbagai peringkat nekrosis dalam sel epitelium tiub renal arnab, dengan kepekatan H2O2 kurang daripada 400 μ Pada mol · L-1, kromatin nuklear mengecut menjadi bulatan dengan warna hijau, yang kebanyakannya dinilai sebagai apoptosis awal. Dengan peningkatan kepekatan H2O2, ia adalah lebih daripada 450 μ Pada mol · L-1, sel menunjukkan bentuk manik bukan bulat jingga-merah, dan bilangan sel nekrotik meningkat mengikut cara yang bergantung kepada kepekatan.

2.5 Kesan 2.5 Cistanche deserticola pada H2O2-percambahan akibat sel epitelium tiub renal arnab

Kajian Eksperimen mengenai Cistanche deserticola

Kadar kemandirian sel epitelium tiub renal arnab di bawah kepekatan berbeza (2, 20, 200 mg! L-1) air dan ekstrak alkohol daripada Cistanche deserticola tidak menunjukkan perbezaan yang ketara berbanding sel yang dibiakkan dalam keadaan normal tanpa campur tangan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, berbanding dengan kumpulan model, kumpulan alkohol dan ekstrak air berkepekatan tinggi daripada Cistanche deserticola dengan ketara mengurangkan kesan perencatan H2O2 pada percambahan sel epitelium tubular renal arnab (P<0 01).

Rajah 2 pewarnaan AO/EB arnabRTEC dirawat dengan kepekatan berbeza H2O2 ( 100 × )

Nota: Berbanding dengan kumpulan model, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Rajah 3 Kesan C． deserticola pada perencatan H2O2 － arnab teraruhRPercambahan TEC

2.6 Kesan 2.6 Cistanche deserticola ke atas kerosakan akibat H2O2 kepada sel epitelium tiub renal arnab

Keputusan kesan ke atas pembebasan LDH dalam sel ditunjukkan dalam Rajah 4. Kumpulan ekstrak etanol dan ekstrak etanol berkepekatan tinggi, sederhana dan rendah dan ekstrak air Cistanche deserticola menghasilkan pelepasan LDH yang jauh lebih rendah dalam sel epitelium tiub renal arnab selepas H2O2 rawatan daripada dalam kumpulan model (P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

Nota: Berbanding dengan kumpulan model, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Rajah 4 Kesan C． deserticola pada H2O2 － disebabkan pelepasan LDH daripada arnabRTEC

3 Perbincangan

Cistanche deserticola, dikenali sebagai "ginseng gurun", mempunyai nilai perubatan yang sangat tinggi dan merupakan ubat tonik Cina yang terkenal. "Shennong Materia Medica Classic" [7] menerangkan perubatan gred tinggi sebagai: "Shangyao... terutamanya menyuburkan kehidupan untuk bertindak balas kepada langit, tidak toksik, dan harus diambil dengan kerap tanpa membahayakan orang..." Cistanche deserticola disenaraikan sebagai ubat kelas atas, dengan rasa manis dan suhu yang sederhana. "Senarai Doktor Terkenal" [8] menunjukkan bahawa Cistanche deserticola adalah "masam, masin, dan tidak toksik". Selepas itu, rekod sifat, rasa dan meridian Cistanche deserticola dalam pelbagai dinasti perubatan herba Cina adalah konsisten. Sifatnya sedikit hangat, dan rasanya manis, masam, dan masin, yang tergolong dalam meridian buah pinggang dan usus besar. Digunakan secara tradisional untuk kekurangan buah pinggang, sakit pinggang dan lutut, serta kelemahan otot dan tulang, kesan dan mekanisme farmakologinya sentiasa menjadi tumpuan penyelidikan. Kajian farmakologi moden telah menunjukkan bahawa Cistanche deserticola boleh menahan penuaan, meningkatkan kebolehan pembelajaran dan ingatan, dan mengawal fungsi imun. Ia digunakan secara meluas dalam preskripsi klinikal perubatan tradisional Cina, ubat paten tradisional Cina, dan persediaan mudah dan produk penjagaan kesihatan.

Supplement cistanche dekat saya

Tekanan oksidatif adalah dorongan utama beberapa penyakit utama, yang disebabkan oleh ketidakseimbangan antara pembentukan dan penyingkiran spesies oksigen reaktif dalam badan, mengakibatkan tahap kerosakan oksidatif tertentu kepada histiosit. Oleh itu, penyelidikan mendalam mengenai mekanisme tindak balas tekanan boleh mencari cara yang munasabah untuk mencegah, memperbaiki atau menghapuskan penyakit kerengsaan secara berkesan. Tekanan oksidatif boleh menyebabkan pelbagai peroksidasi sel dan protein dalam badan [9], dan H2O2 dipilih sebagai salah satu bahan eksogen untuk kerosakan dalam penyelidikan. Ia mempunyai kesan yang kuat untuk mendorong peroksidasi lipid, menyebabkan tindak balas peroksidasi lipid rantai, dan membawa kepada apoptosis dan disfungsi sel. Pada masa ini, penyelidikan mengenai nefrotoksisiti bahan eksogen ini dan kesan antagonisnya bergantung terutamanya pada pembentukan model haiwan, dan terdapat sedikit laporan literatur mengenai penubuhan model in vitro untuk penyelidikan berkaitan. Berbanding dengan model haiwan nefrotoksisiti, model sel nefrotoksik in vitro mempunyai kelebihan seperti sasaran tindakan yang jelas, kitaran ubat yang singkat dan dos yang rendah.

cistanche herba cina

Kaji model sel nefrotoksik in vitro yang disebabkan oleh bahan eksogen melalui perubahan dalam morfologi sel, kesan perencatan bahan eksogen pada percambahan sel, dan perubahan dalam pelepasan LDH sel. Kepekatan H2 O2 yang berbeza mempunyai kesan yang ketara terhadap perubahan morfologi sel. Apabila kepekatan bahan eksogen meningkat, didapati bilangan ubah bentuk sel meningkat. Ujian MTT ialah kaedah yang biasa digunakan untuk mengesan bilangan sel hidup. Dalam eksperimen di mana kepekatan berbeza Cistanche deserticola melindungi sel epitelium tiub renal arnab daripada kerosakan H2O2, kepekatan Cistanche deserticola yang berbeza secara signifikan mengurangkan kadar perencatan H2O2 pada sel epitelium tiub renal arnab, dan ia bergantung kepada kepekatan. Apabila membran sel rosak, LDH intraselular akan dilepaskan ke dalam medium kultur, Kandungan LDH dalam medium kultur sel adalah penunjuk penting untuk mengesan kematian sel. Kajian ini mendapati bahawa tahap LDH dalam medium kultur sel kumpulan model dengan H2O2-mengakibatkan kerosakan pada sel epitelium tiub renal arnab meningkat dengan ketara, manakala tahap LDH dalam kumpulan eksperimen dirawat dengan kepekatan Cistanche deserticola yang berbeza dengan ketara. menurun dalam cara yang bergantung kepada kepekatan.Hasil penyelidikan mencadangkan bahawa mewujudkan model H2O2-mengakibatkan kerosakan pada sel epitelium tubular renal arnab dan meneroka kesan perlindungan ekstrak Cistanche deserticola pada sel epitelium tubular renal, bukan sahaja meletakkan asas untuk penyelidikan tentang kerosakan sel yang disebabkan oleh tekanan oksidatif tetapi juga menyediakan data asas untuk pembangunan dan penggunaan Cistanche deserticola.

rujukan:

［1］ Ch. P( 2015) Jilid Ⅰ［S］． 2015: 135.

［2］ Kim JH,Choi W,Lee JH,et al. Astaxanthin menghalang kematian sel apoptosis pengantara H2O2 dalam sel progenitor saraf tetikus melalui modulasi laluan isyarat p38 dan MEK［J］． Bioteknol Mikrobiol,2009,19( 11) : 1355 － 1363.

［3］ Siu PM,Wang Y,Alway SE. Isyarat apoptosis yang disebabkan oleh H2 O2 － tegasan oksidatif pengantara dalam tiub myo C2 Cl2 yang dibezakan［J］． Life Sci,2009,84( 13) : 468 － 481. ［4］ Zhao Dan, Zhang Xue, Guan Jing, dsb. Kajian tentang kesan beberapa herba perubatan Cina terhadap percambahan sel epitelium tiub renal primer dalam arnab ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei, et al Kajian tentang kesan ipriflavon terhadap aktiviti osteoklas dan percambahan dan pembezaan osteoblas ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2015, 34 (3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang, et al Pengesanan apoptosis yang disebabkan oleh paclitaxel dalam sel tumor payudara anjing secara in vitro menggunakan kaedah pewarnaan dua AO/EB [J]. Sains dan Teknologi Ternakan dan Veterinar Guangdong, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG,Yang P J. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． Beijing: Xueyuan Press,2013: 73.

［8］ Tao HJ,Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． Beijing: People's Medical Publishing House,1986: 51.

［9］ Tunai TP, Pan Y, Simon M C. Ｒspesies oksigen aktif dan penderiaan oksigen selular［J］． Percuma Ｒadic Biol Med,2007,43( 9) : 1219 － 1225．