Pengesanan Tahap Peningkatan Tetrahydrobiopterin dalam Sampel Serum Pesakit ME/CFS Dengan Intoleransi Ortostatik: Kajian Perintis

Abstrak:Myalgic encephalomyelitis atau sindrom keletihan kronik (ME/CFS) ialah penyakit kronik pelbagai sistem yang dicirikan oleh keletihan otot yang teruk, sakit, pening, dan kabus otak. Ramai pesakit dengan ME/CFS mengalami intoleransi ortostatik (OI), yang dicirikan oleh pening yang kerap, pening, dan rasa pengsan semasa mengekalkan postur tegak. Walaupun penyiasatan sengit, mekanisme molekul keadaan melemahkan ini masih tidak diketahui. OI sering dimanifestasikan oleh perubahan kardiovaskular, seperti pengurangan aliran darah serebrum, penurunan tekanan darah, dan penurunan kadar denyutan jantung. Ketersediaan bio tetrahydrobiopterin (BH4), kofaktor penting enzim endothelial nitric oxide synthase (eNOS), digandingkan rapat dengan kesihatan dan peredaran darah. Untuk meneroka peranan BH4 dalam ME/CFS, sampel serum pesakit CFS (n=32), pesakit CFS dengan OI sahaja (n=10; CFS + OI) dan pesakit CFS dengan kedua-dua OI dan polineuropati serat kecil (n=12; CFS + OI + SFN) telah tertakluk kepada BH4 ELISA. Menariknya, keputusan kami mendedahkan bahawa ungkapan BH4 adalah tinggi dengan ketara dalam pesakit CFS, CFS + OI, dan CFS + OI + SFN berbanding dengan kawalan padanan umur/jantina. Akhirnya, ujian pengeluaran ROS dalam sel mikroglial berbudaya diikuti oleh statistik korelasi Pearson menunjukkan bahawa peningkatan BH4 dalam sampel serum pesakit CFS + OI mungkin dikaitkan dengan tindak balas tekanan oksidatif. Penemuan ini menunjukkan bahawa peraturan metabolisme BH4 boleh menjadi sasaran yang menjanjikan untuk memahami mekanisme molekul CFS dan CFS dengan OI.

Cistanche boleh bertindak sebagai penambah anti-keletihan dan stamina, dan kajian eksperimen telah menunjukkan bahawa rebusan Cistanche tubulosa boleh melindungi hepatosit hati dan sel endothelial hati yang rosak dalam tikus berenang yang menanggung berat badan, mengimbangi ekspresi NOS3, dan menggalakkan glikogen hati. sintesis, dengan itu memberikan keberkesanan anti-keletihan. Ekstrak Cistanche tubulosa yang kaya dengan phenylethanoid glycoside boleh mengurangkan serum creatine kinase, laktat dehidrogenase, dan paras laktat, dan meningkatkan hemoglobin (HB) dan paras glukosa dalam tikus ICR, dan ini boleh memainkan peranan anti-keletihan dengan mengurangkan kerosakan otot. dan melambatkan pengayaan asid laktik untuk penyimpanan tenaga dalam tikus. Tablet Kompaun Cistanche Tubulosa memanjangkan masa berenang dengan ketara, meningkatkan rizab glikogen hepatik, dan menurunkan paras urea serum selepas bersenam pada tikus, menunjukkan kesan anti-keletihannya. Merebus Cistanchis boleh meningkatkan daya tahan dan mempercepatkan penghapusan keletihan dalam menjalankan tikus, dan juga boleh mengurangkan ketinggian serum creatine kinase selepas latihan beban dan mengekalkan ultrastruktur otot rangka tikus normal selepas senaman, yang menunjukkan bahawa ia mempunyai kesan. meningkatkan kekuatan fizikal dan anti-keletihan. Cistanchis juga memanjangkan masa hidup tikus beracun nitrit dengan ketara dan meningkatkan toleransi terhadap hipoksia dan keletihan.

Klik pada Over fatigue

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Kata kunci:ME/CFS; tetrahydrobiopterin; intoleransi ortostatik; polineuropati serat kecil; NOS endothelial; spesies oksigen reaktif

1. Pengenalan

Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) adalah penyakit multisistem kronik yang dicirikan oleh keletihan otot yang melemahkan, sakit, pening, dan kabus otak [1,2]. Subset pesakit ME/CFS menunjukkan hipotensi ortostatik yang teruk [3] yang dicirikan oleh penurunan tekanan darah yang ketara menyebabkan pening dan pengsan semasa berdiri dalam keadaan tegak [4]. Keadaan ini sering dipanggil intoleransi ortostatik (OI). Subset pesakit OI juga memenuhi kriteria diagnostik untuk polineuropati serat kecil [5,6] yang didiagnosis menggunakan pewarnaan merah Congo untuk amyloidosis dalam sampel biopsi kulit [7]. Walaupun penyiasatan sengit, mekanisme molekul OI tidak diketahui.

BH4 adalah kofaktor penting metabolisme asid amino [8]. Asid amino, seperti fenilalanin, tirosin, dan triptofan, ditukar kepada perantaraan selular yang penting melalui tindakan enzim hidroksilase. BH4 berfungsi sebagai kofaktor penting bagi semua enzim hidroksilase ini [9–11]. Oleh itu, bioavailabiliti BH4 adalah penting untuk sintesis neurotransmitter, seperti dopamin dan serotonin [10]. Selain daripada enzim hidroksilase ini, BH4 juga mengawal fungsi enzim sintase nitrik oksida dan mengawal penghasilan oksida nitrik (NO) dalam endothelium [12]. Pengeluaran endothelial NO meningkatkan tindak balas vasodilatasi, menurunkan tekanan darah, dan membantu kelonggaran otot [13,14]. Sebaliknya, dengan kehadiran tekanan oksidatif, BH4 melepaskan daripada pengeluaran NO yang disebabkan oleh eNOS [15] dan secara langsung menambah tindak balas tekanan mitokondria dalam tisu jantung [16] dan otot rangka [17]. Oleh itu, peraturan metabolisme BH4 adalah penting untuk fungsi kardiovaskular dan kesihatan peredaran darah. Memandangkan pesakit OI dilaporkan menunjukkan keabnormalan kardiovaskular, kami berminat untuk mengkaji jika pesakit OI telah mengubah metabolisme BH4. Sehingga kini, belum ada kajian yang meneroka peranan metabolisme BH4 dalam CFS. Selain itu, kajian kami juga meneroka sama ada pesakit CFS dengan OI telah mengubah biosintesis BH4.

Sampel serum 66 subjek telah dimasukkan dalam kajian dengan kawalan=32 CFS dan n=34. ELISA kuantitatif dua buta telah dilakukan untuk membandingkan tahap BH4 antara kawalan sihat dan pesakit CFS. Menariknya, kami mendapati bahawa terdapat peningkatan yang kuat BH4 dalam pesakit CFS berbanding kawalan yang sihat. Semasa membandingkan tahap BH4 antara pesakit CFS dengan OI (n=10) dan kawalan padanan umur/jantina (n=10), kami juga mendapati bahawa pesakit CFS dengan OI mempunyai tahap yang lebih tinggi BH4 dalam serum. Secara kolektif, manuskrip semasa kami menyerlahkan bahawa ketinggian serum BH4 dalam pesakit CFS boleh memainkan peranan penting dalam patogenesis OI.

2. Keputusan

Subjek yang termasuk dalam kajian: Untuk mengukur tahap BH4 dalam sampel serum, sejumlah 66 subjek manusia telah dimasukkan ke dalam kajian. Jadual 1 meringkaskan umur, jantina, etnik, dan keadaan sedia ada subjek ini. Empat subjek dari kumpulan kawalan mempunyai komplikasi berkaitan kanser dan oleh itu dikecualikan daripada analisis akhir. Umur minimum, median dan maksimum kumpulan kawalan ialah 18, 64.5, dan 82 tahun, masing-masing. Bagi kumpulan CFS, nilai ini ialah 26, 59, dan 76 tahun. Plot taburan kekerapan umur dalam kedua-dua kumpulan mempamerkan kecondongan yang sama dan ujian analisis Bland-Altman seterusnya mendedahkan bahawa purata perbezaan adalah hampir kepada sifar menunjukkan bahawa tiada berat sebelah mengenai umur. Kumpulan kawalan terdiri daripada 44% lelaki dan 56% perempuan, manakala kumpulan CFS terdiri daripada 41% lelaki dan 59% perempuan. Semua pesakit adalah orang kulit putih dan tinggal di kawasan geografi Nevada Utara dan California.

Populasi pesakit ME/CFS telah didaftarkan berdasarkan kriteria Kanada 2003 dan Fakuda untuk ME/CFS. Mereka juga memenuhi kriteria diagnostik untuk SCID (nama baharu ME/CFS yang ditubuhkan oleh Institut Perubatan). Kawalan adalah umur/jantina dipadankan dengan subjek CFS yang turut dijemput bersama pesakit di Klinik Perubatan Dalaman Dr. Peterson.

CFS + OI dan CFS + OI_Subset SFN telah ditubuhkan melalui rekod ujian diagnostik (semakan carta perubatan-lengkap) dan korelasi klinikal. Sebagai contoh, orang yang mempunyai OI membentangkan kepada pejabat ujian kurus NASA positif yang diubah suai (menunjukkan OI) dan semua menerima terapi pengembangan isipadu IV (salinan). Pesakit SFN mempunyai sampel biopsi. Untuk subjek CFS + OI + SFN yang disertakan, laporan Hospital Besar Massa telah direkodkan, di mana pewarnaan merah Congo untuk mengira ketumpatan neurit dilakukan dalam tisu otot buku lali sisi.

Tahap BH4 adalah tinggi dalam sampel serum pesakit ME/CFS: Secara keseluruhan, 32 CFS dan 34 subjek kawalan telah dimasukkan ke dalam kajian (Jadual 1) untuk mengukur tahap BH4 serum oleh ELISA yang kompetitif. Lengkung standard BH4 ELISA ialah lengkung eksponen cerun negatif yang diperoleh daripada enam kepekatan standard BH4 yang semakin meningkat (5, 10, 25, 50, 10{{52 }}, dan 150 ng/mL). Cerun dan pintasan lengkung piawai digunakan untuk mengukur tahap mutlak BH4 daripada nilai OD. Pencairan bersiri sampel serum diikuti oleh ujian BH4 ELISA mendedahkan bahawa pencairan 1:2 serum memberikan hasil yang paling kontras berbanding kosong atau latar belakang. Oleh itu, semua sampel serum tertakluk kepada pencairan 1:2. Menariknya, analisis ELISA dua buta diikuti dengan ujian Mann–Whitney U bukan parametrik [* p < 0.05 (=0.033); U=304.5] mendedahkan bahawa tahap BH4 adalah lebih tinggi dengan ketara dalam n=32 pesakit CFS berbanding n=28 subjek kawalan (Rajah 1A). Empat subjek (n=4) dalam kumpulan kawalan telah dikecualikan kerana kanser sedia ada mereka. Oleh kerana subjek dimasukkan secara rawak tanpa mengira umur dan jantina mereka, kami seterusnya ingin menganalisis korelasi tahap BH4 dengan umur dan jantina subjek. Sehubungan itu, analisis korelasi Spearman bukan parametrik (Rajah 1B) mendedahkan bahawa tiada korelasi antara tahap BH4 dan umur subjek' (Spearman r=−0.1657; p=0.1835). Seterusnya, kami membandingkan tahap BH4 antara subjek lelaki dan perempuan (Rajah 1C). Untuk menilai kepentingan antara lelaki dan perempuan (effector#1 ialah jantina), serta antara kawalan dan CFS (effector#2 ialah keadaan kesihatan), analisis ANOVA dua hala telah dilakukan. Sehubungan itu, subjek lelaki dan perempuan tidak menunjukkan sebarang perbezaan yang signifikan dalam tahap BH4 (p > 0.05; =0.3496). Walau bagaimanapun, terdapat perbezaan yang ketara dalam BH4 antara subjek kawalan dan CFS (p < 0.05; =0.0375) tanpa mengira perbezaan jantina.

Memandangkan kohort semasa dihadkan dengan ketat di bawah kawasan geografi, etnik dan daripada amalan doktor tunggal, analisis perbandingan berpasangan BH4 antara kes dan kawalan padanan umur dan jantina akan menjadi lebih konklusif. Sebanyak 15 pasangan telah dibandingkan (Rajah 1D). Ujian pangkat bertanda pasangan Wilcoxon bukan parametrik menunjukkan bahawa pesakit CFS mempunyai BH4 yang jauh lebih tinggi (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alfa ({{0}}.05)]. Memandangkan semua sampel CFS dan kawalan dipadankan dengan umur dan jantina, analisis perbandingan berpasangan telah dilakukan. Ujian-t berpasangan berikutnya (t1,9=3.834; ** p < 0.01=0.004) menunjukkan bahawa sampel serum CFS + OI mempunyai BH4 yang jauh lebih tinggi berbanding sampel serum kawalan (Rajah 2C ). Ujian statistik lajur kumulatif (Rajah 2D) seterusnya mendedahkan bahawa 7 daripada 10 pesakit CFS + OI mempunyai tahap BH4 yang jauh lebih tinggi daripada median (=99.63 ng/mL). Sebaliknya, hanya 2 daripada 10 subjek kawalan mempunyai BH4 lebih tinggi daripada nilai median. Secara kolektif, data ini menunjukkan bahawa pesakit CFS + OI mempunyai BH4 yang jauh lebih tinggi berbanding subjek kawalan.

Subset pesakit CFS (n=12) mempunyai kedua-dua OI dan SFN. Perbandingan tahap BH4 (Rajah 3A) antara kawalan sihat dan subjek CFS + OI + SFN mendedahkan bahawa pesakit CFS + OI + SFN mempunyai tahap BH4 [t1,22=2 yang jauh lebih tinggi.371; * hlm<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Semasa membandingkan tahap BH4 antara CFS sahaja dan pesakit CFS + OI, kami mendapati bahawa sampel serum pesakit CFS + OI (n=14) mempunyai tahap BH4 yang lebih tinggi (Rajah 4A) berbanding subjek kawalan (n {{ 6}}). Analisis plot QQ memaparkan bahawa taburan data adalah normal dalam kedua-dua kumpulan (Rajah 4B), mencadangkan ujian parametrik boleh diguna pakai untuk membandingkan min. Sehubungan itu, ujian-t tidak berpasangan untuk menganalisis kepentingan min antara kumpulan menunjukkan perbezaan yang kukuh [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Statistik lajur kohort yang dipilih (n=22) menunjukkan bahawa 9 daripada 14 pesakit CFS + OI mempunyai tahap BH4 serum yang lebih tinggi berbanding median 119.7 ng/mL (Rajah 4C). Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan bahawa pesakit CFS dengan OI mempunyai tahap BH4 yang tinggi dalam serum. Secara kolektif, manuskrip semasa kami mengenal pasti BH4 sebagai biomarker bawaan darah yang berpotensi untuk pesakit CFS + OI dan CFS + OI + SFN.

Tahap BH4 yang meningkat mungkin dikaitkan dengan tekanan oksidatif yang meningkat: Untuk memahami kepentingan fungsi BH4 yang tinggi dalam serum, kami meneroka keupayaan mendorong ROS bagi sampel serum pesakit CFS dengan OI (n=10). Sel mikroglial yang diselitkan DCFDA dirawat dengan sampel serum yang dicairkan 1:2 daripada 10 CFS + OI dan kawalan 10 umur/padanan gender selama 90 minit diikuti dengan mengukur pengeluaran ROS menggunakan pembaca plat pendarfluor (Cth: Em { {12}} nm/535 nm) seperti yang diterangkan dalam bahagian bahan dan kaedah. Seperti yang telah kami laporkan sebelum ini [18], analisis histogram menunjukkan bahawa kapasiti penghasil ROS bagi sampel serum CFS + OI adalah jauh lebih tinggi daripada sampel serum kawalan (Rajah 5A) [t1,18=2.541; p < 0.05 (=0.0205)]. Memandangkan semua titik data dalam kedua-dua kumpulan bertaburan secara normal (Rajah 5B), kami melakukan ujian parametrik untuk mengkaji kepentingan min antara kumpulan. Menariknya, analisis statistik korelasi Pearson dalam kohort ini mendedahkan bahawa korelasi yang sederhana positif wujud antara tahap BH4 dan pengeluaran ROS, menunjukkan bahawa tahap BH4 yang tinggi dalam sampel serum CFS + OI mungkin dikaitkan dengan peningkatan tindak balas oksidatif (Rajah 5C).

Diambil bersama, manuskrip semasa kami menyerlahkan bahawa pesakit CFS dikaitkan dengan tahap BH4 yang tinggi dalam serum dan pengawalseliaan lebih ketara diperhatikan dalam pesakit CFS dengan OI. Selain itu, BH4 yang tinggi mungkin dikaitkan dengan tindak balas tekanan oksidatif yang menonjolkan potensi peranan metabolisme BH4 dalam patogenesis CFS dan CFS dengan OI (Rajah 5D).

3. Perbincangan

Biosintesis Tetrahydrobiopterin (BH4) ialah proses metabolik yang dikawal ketat dalam kesihatan, dan ekspresi abnormalnya dikaitkan dengan siri penyakit. Kekurangannya membawa kepada defisit metabolik metabolisme asid amino [19,20], gangguan peraturan dopamin [21], dan gangguan aliran darah [22,23] dan dikaitkan dengan hipertensi, diabetes, aterosklerosis, penuaan, dan gangguan metabolik lain. Sebaliknya, biosintesis BH4 yang dikawal selia menjejaskan pengeluaran tenaga mitokondria [24], mendorong tekanan oksidatif [25], dan menambah kerosakan autophagy [26]. Peningkatan BH4 juga dikaitkan dengan pengurangan tekanan darah [27] dengan mendorong tindak balas vasodilasi melalui pengaktifan NOS endothelial [28]. Oleh itu, biosintesis terkawal BH4 mungkin secara langsung menggalakkan pengurangan tekanan darah atau hipotensi. Satu kajian menunjukkan bahawa kekurangan BH4 melemahkan hipotensi yang disebabkan oleh LPS pada tikus [23]. Sehingga kini, peranan metabolisme BH4 belum diterokai dalam pesakit CFS, khususnya pesakit CFS dengan OI. Oleh itu, matlamat kami adalah untuk menilai ekspresi serum BH4 dalam populasi pesakit ini. Yang menghairankan, analisis ELISA kami mendedahkan bahawa sampel serum daripada pesakit CFS mempunyai tahap BH4 yang jauh lebih tinggi berbanding subjek kawalan sihat yang dipadankan dengan umur dan jantina. Sehubungan itu, statistik korelasi Spearman menunjukkan bahawa tidak ada korelasi yang signifikan dalam regulasi BH4 mengenai sama ada umur dan jantina, membatalkan kemungkinan kemerosotan biosintesis BH4 yang berkaitan dengan umur atau jantina dalam pesakit ini.

Seterusnya, kami memerhatikan bahawa sampel serum pesakit CFS + OI juga menunjukkan ketinggian BH4 yang kuat berbanding dengan sampel serum kawalan yang dipadankan dengan umur dan jantina. Statistik lajur kumulatif kami mendedahkan bahawa 7 daripada 10 pesakit CFS + OI mempunyai tahap BH4 yang sangat tinggi, menunjukkan bahawa ketinggian serum BH4 mungkin dikaitkan dengan patogenesis OI. Hasilnya disokong lagi apabila subset pesakit CFS + OI dengan polineuropati gentian kecil (SFN) juga menunjukkan ekspresi tinggi BH4 dalam sampel serum mereka berbanding kawalan padanan umur dan jantina. Menariknya, perbandingan tahap BH4 serum antara CFS sahaja dan pesakit CFS dengan OI menunjukkan bahawa terdapat peningkatan tahap BH4 yang ketara dalam pesakit OI.

Bagaimanakah peningkatan BH4 menyumbang kepada patogenesis ME/CFS? Terdapat pelbagai laluan di mana BH4 yang tinggi boleh menyumbang secara langsung kepada patogenesis ME / CFS (Rajah 5D). Pertama, regulasi BH4 dilaporkan menyebabkan kerosakan mitokondria metabolisme tenaga melalui perencatan kompleks I dan IV rantai pengangkutan elektron, yang mengakibatkan pengurangan potensi membran mitokondria, pembebasan cytochrome C, dan apoptosis [24]. Pendedahan BH4 juga dilaporkan menyebabkan tekanan oksidatif [29]. Walaupun secara fisiologi BH4 menyokong pengeluaran NO endothelial melalui pengaktifan eNOS, pengoksidaan BH4 oleh superoksida memisahkannya daripada eNOS, yang menyebabkan tekanan oksidatif kepada tisu jantung dan menjejaskan kesihatan kardiovaskular (Rajah 5C). Sebagai sokongan, keputusan kami menunjukkan bahawa tahap tinggi BH4 dalam sampel serum CFS + OI mempunyai korelasi positif dengan kebolehan ROSinducing. Selain itu, BH4 juga mengaktifkan sasaran mamalia rapamycin complex1 (mTORC1) kinase untuk menjejaskan autophagy. Sebelum ini, kami melaporkan bahawa pengaktifan mTORC1 dan kemerosotan autophagy seterusnya mungkin dikaitkan dengan patogenesis ME / CFS. Kedua-dua mTORC1-kemerosotan autophagy bergantung [18] dan kekurangan mitokondria metabolisme tenaga [30] telah dilaporkan menyumbang kepada patogenesis ME/CFS. Oleh itu, peningkatan tahap BH4 dalam sampel serum pesakit ME / CFS boleh mendorong tekanan oksidatif dan menambah eNOS uncoupling, diikuti oleh tekanan kardiovaskular, hipotensi, ketoksikan mitokondria, dan gangguan autophagy dalam pesakit CFS.

4. Bahan dan Kaedah

Pemerolehan sampel: Pemerolehan sampel, penyahidentifikasian, dan pelan penyimpanan telah dibincangkan sebelum [18]. Secara ringkas, sampel darah dan data soal selidik telah dikumpul di bawah pengawasan Dr Daniel Peterson (Perubatan Dalaman Sierra, Incline Village, NV, Amerika Syarikat) (LHDN Barat) #20201812. Sampel darah telah disentrifugasi, dan sampel serum telah diasingkan dan kemudian segera dibekukan pada -80 ◦C. Setiap sampel diberi nombor pengenalan unik dan direkodkan dalam buku nota dan Microsoft Excel dengan tarikh dan tandatangan mengikut protokol yang diluluskan LHDN. Sampel kemudian dihantar ke kemudahan penyelidikan kami di Wisconsin pada ais kering semalaman. Setelah diterima, sampel telah diproses dan diuji serta-merta. Soal selidik dan data klinikal yang tidak dikenal pasti disimpan dalam pangkalan data sever Redcap akses yang selamat dan terhad yang diuruskan oleh Kakitangan Penyelidik dan Felo Klinikal di Sierra Internal Medicine. Rekod pesakit telah diselenggarakan oleh garis panduan dasar privasi yang ditetapkan oleh Perubatan Dalaman Sierra. Subset pesakit ME / CFS dalam kumpulan OI dan OI + SFN telah ditubuhkan menggunakan semakan carta buta, dan analisis pasca makmal telah disahkan oleh PI klinikal. Empat pesakit kanser telah dimasukkan secara membuta tuli dalam analisis ini dan berfungsi sebagai kawalan positif penyakit.

Kriteria diagnostik untuk OI termasuk penemuan yang berkaitan (hasil jadual kecondongan jantung) daripada semakan carta klinikal. Di samping itu, pada masa pengumpulan darah, rakan klinikal menyelesaikan analisis lean NASA. Diagnosis SFN telah ditubuhkan melalui semakan carta klinikal dan pemeriksaan histologi biopsi tumbukan kulit yang dikumpulkan dari kawasan pra-tibial. Biopsi kulit dinilai secara bebas di Hospital Besar Massachusetts untuk kuantiti morfometrik hujung saraf epidermis untuk mengkaji ketumpatan neurit kawasan permukaan kulit.

ELISA Kompetitif BH4: Tahap BH4 diukur dan dikira dalam sampel serum pesakit ME-CFS dan kawalan sihat yang dipadankan dengan umur mengikut arahan pengilang (kit ELISA kompetitif Human BH4; Vendor: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA; Cat # MBS733839). Kit telah disahkan dalam makmal kami (pembaca plat multimodal Perkin Elmer Victor X3, Perkin Elmer, Waltham, MA, Amerika Syarikat) dan mempunyai lengkung standard (R2=0.98) dan kepekaan serendah 1 ng/mL penumpuan mengenai kawalan positif. Secara ringkas, sampel serum dicairkan dengan pelarut ujian (atau 1× PBS) dan kemudian dipipet pada plat mikro yang telah disalut dengan antibodi anti-BH4 poliklonal. Selepas 30 minit pengeraman dengan sampel, konjugat BH{17}}HRP telah ditambahkan pada plat dan diinkubasi selama 1 jam tambahan pada suhu 37 ◦C. Sampel serum sisa didekan dan dibasuh di atas pinggan dengan penimbal pencuci 1× (sebagai alternatif, dengan 1× PBS-T) tiga kali selama lima minit setiap satu menggunakan pipet berbilang saluran. Selepas mencuci, setiap telaga telah bertindak balas dengan substrat TMB selama 10 minit dalam gelap. Perkembangan warna berlaku selepas 10 minit pengeraman substrat dalam keadaan goncang. Konjugat BH4-HRP akan bersaing dengan serum BH4 untuk mengikat antibodi primer bersalut. Oleh itu, lebih banyak BH4 serum dalam sampel, lebih sedikit pengikatan BH4-HRP akan berlaku dan dengan itu menghasilkan kurang warna. Sebanyak 66 sampel serum (34 kawalan + 32 pesakit ME-CFS) telah diperolehi (perincian dalam bahagian "pemerolehan sampel") dengan garis panduan kawal selia institusi yang betul dan dianalisis di bawah keadaan GLP. Pengedaran sampel adalah rawak, dan ujian adalah buta dua kali, seperti yang diterangkan di bawah bahagian "justifikasi saiz sampel".

Justifikasi saiz sampel dan analisis statistik: Saiz sampel dibenarkan menggunakan persamaan berikut. Saiz sampel {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z ialah skor z, iaitu 1.28 untuk kuasa 0.8. p ialah perkadaran penduduk; untuk selang keyakinan 95%, p ialah {{20}}.95. ε ialah margin ralat, iaitu 0.05. Oleh itu, untuk mencapai kepentingan dalam perbezaan min antara kumpulan pada p < 0.05, sejumlah n=32 sampel setiap kumpulan telah dimasukkan. Untuk perbandingan antara kawalan dan pesakit CFS + OI, n=10 sampel setiap kumpulan telah disertakan. Saiz sampel yang serupa disertakan semasa membandingkan kumpulan kawalan dan kawalan +OI + SFN. Pengiraan saiz sampel telah dilakukan berdasarkan ε=0.05 dan p=0.99. Ujian Mann–Whitney U bukan parametrik telah diterima pakai untuk menguji kepentingan min antara kedua-dua kumpulan apabila kedua-dua kumpulan memaparkan taburan data yang sama dan normal; jika tidak, ujian-t tidak berpasangan parametrik telah dilakukan. Untuk analisis berpasangan antara kumpulan, ujian-t berpasangan parametrik dilakukan jika titik data daripada kedua-dua kumpulan diedarkan secara normal; jika tidak, ujian pangkat Wilcoxon dilakukan untuk menilai kepentingan antara kumpulan. ANOVA dua hala dengan post hoc Bonferroni atau Tukey digunakan untuk menguji kepentingan min dalam lebih daripada dua kumpulan yang menganggap jantina (lelaki atau perempuan) dan kesihatan (sihat atau CFS) sebagai efektor. Semua analisis statistik telah dilakukan dalam perisian GraphPad Prism versi 9.5.1 (733) (Boston, MA 02110, USA).

Ujian ROS:Sel mikroglial embrio manusia HMC3 telah ditanam dan disalurkan dengan media DMEM yang lengkap. Secara ringkas, sel HMC3 disalut dalam 96 well-plate untuk kajian fluorometrik ROS. Sel telah ditanam kepada 75-80% pertemuan dan diinkubasi dengan probe DCFDA (Cat # ab113851; Abcam, Cambridge, UK) selama 45 minit pada 37 ◦C dalam gelap. Media standard digantikan dengan 100 µL (1:2 pencairan=50 µL serum + 50 µL media) media tambahan serum selama 90 minit untuk mencapai nilai pendarfluor optimum. Pada akhir tempoh inkubasi, media disedut dan kemudian diukur pada pelepasan pengujaan menggunakan set penapis 485 nm dan 535 nm dalam pembaca plat PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, Amerika Syarikat).

Sumbangan Pengarang:AR menyusun idea, mereka bentuk, melakukan penyelidikan, dan menulis manuskrip. CGG melakukan penyelidikan dan menulis manuskrip. RW membantu dengan pengumpulan sampel darah dan menyimpan rekod pesakit. DP ialah PI klinikal, yang bertanggungjawab mengumpul biospesimen, soal selidik, dan kelulusan LHDN. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:Kerja ini disokong oleh Simmaron Research Inc., organisasi penyelidikan 501C bukan untung, Incline Village, NV 89451, hasil dana daripada Ramsay Award 2023 kepada AR oleh inisiatif Solve ME dan Foundation Hesse Sibylla, Quebec, QC, Kanada.

Penyata Lembaga Semakan Institusi:Tiada bahagian artikel penyelidikan ini, termasuk imej dan teks, telah diterbitkan atau diterbitkan semula sebelum ini dalam mana-mana buku, artikel atau kesusasteraan lain yang diterbitkan. Imej adalah asli dan tidak ditiru daripada mana-mana sumber lain. Ini bukan percubaan klinikal tetapi kajian pemerhatian institusi. Pengumpulan biospesimen, garis panduan soal selidik, penyimpanan rekod, dan penjanaan nombor pengenalan unik telah dilakukan oleh LHDN Barat, protokol #20201812 (Tarikh pembaharuan semasa # 7/21/23).

Kenyataan Persetujuan Termaklum:Semua pengarang memberikan persetujuan mereka untuk menerbitkan artikel ulasan ini.

Penyata Ketersediaan Data:Tiada lembaran data elektronik yang dikaitkan dengan kertas ini. Tiada data dalam repositori elektronik.

Konflik Kepentingan:AR, CGG, RW dan DP ialah pekerja Simmaron Research INC, sebuah organisasi penyelidikan bukan untung 501C. Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Singkatan

ME/CFS=Myalgic encephalomyelitis atau sindrom keletihan kronik; OI=Intoleransi ortostatik; SFN=polineuropati gentian kecil; BH4=tetrahydrobiopterin; eNOS=endothelial nitric oxide synthase; TIADA=Nitrik oksida. ROS=Spesies oksigen reaktif. ME/CFS=Myalgic encephalomyelitis atau sindrom keletihan kronik; OI=Intoleransi ortostatik; SFN=polineuropati gentian kecil; BH{10}} tetrahydrobiopterin; eNOS=endothelial nitric oxide synthase; TIADA=Nitrik oksida; dan ROS=Spesies oksigen reaktif.

Rujukan

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, SW; Lee, SH; Son, CG Kajian sistematik dan meta-analisis kelaziman sindrom keletihan kronik/myalgic encephalomyelitis (CFS/ME). J. Terjemah. Med. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Anak lelaki, C.-G. Kajian tentang kelaziman keletihan kronik di seluruh dunia. J. Med Korea. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Penilaian fisiologi intoleransi ortostatik dalam sindrom keletihan kronik. J. Terjemah. Med. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Bateman, L.; Bested, AC; Bonila, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, SAYA; Dowell, TG; Felsenstein, D. Myalgic encephalomyelitis/sindrom keletihan kronik: Keperluan diagnosis dan pengurusan. Dalam Prosiding Klinik Mayo; Elsevier: Amsterdam, Belanda, 2021; ms 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Starshinova, AA; Dori, A.; Zinchenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Definisi neuropati serat kecil, diagnosis dan rawatan. Neurol. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Cawangan, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Sindrom kompleks kesakitan kronik, keletihan, dan gangguan kognitif yang dikaitkan dengan dysautonomia autoimun dan neuropati serat kecil. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Bukan, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et al. Deposit amiloid kulit dan kehilangan serat saraf sebagai penanda permulaan neuropati dan perkembangan dalam amyloidosis transthyretin keturunan. Eur. J. Neurol. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Metabolisme tetrahydrobiopterin: Kaitannya dalam neuron monoaminergic dan gangguan neurologi. Kimia. Rec. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Xia, T.; Kelabu, DW; Shiman, R. Peraturan fenilalanin hati tikus hidroksilase. III. Kawalan pemangkinan oleh (6R)- tetrahydrobiopterin dan fenilalanin. J. Biol. Kimia. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Tyrosine hydroxylase (TH), cofactor tetrahydrobiopterin (BH4), enzim berkaitan katekolamin lain, dan gen manusia mereka tentang terapi ubat dan gen penyakit Parkinson (PD): Gambaran keseluruhan sejarah dan prospek. J. Transm Neural. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahydrobiopterin meningkatkan aktiviti tryptophan hydroxylase dalam kepingan raphe tikus. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Shu, C.; Yang, T.; Zhou, S.; Yuan, H.; Chen, AF Tetrahydrobiopterin peraturan fungsi redoks eNOS. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahydrobiopterin memperbaiki kerosakan berkaitan penuaan vasodilasi yang bergantung kepada endothelium melalui peningkatan dalam pengeluaran nitrik oksida. Aterosklerosis 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Fang, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA Kesan suplemen BH4 selepas iskemia yang berpanjangan dalam otot rangka. Pembedahan Mikro 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Yang, Y.-M.; Huang, A.; Kaley, G.; Sun, D. eNOS uncoupling dan disfungsi endothelial dalam salur tua. Am. J. Physiol.-Lingkar Jantung. Fisiol. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Karbach, S.; Wenzel, P.; Waisman, A.; Munzel, T.; Daiber, A. eNOS uncoupling dalam penyakit kardiovaskular-peranan tekanan oksidatif dan keradangan. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Wu, G.; Muller-Delp, JM Kesan penuaan dan latihan senaman pada eNOS uncoupling dalam arteriol rintangan otot rangka. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. ATG13 yang dinaikkan dalam serum pesakit dengan ME/CFS merangsang tindak balas tekanan oksidatif dalam sel mikroglial melalui pengaktifan reseptor untuk produk akhir glikasi lanjutan (RAGE). Mol. sel. Neurosci. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahydrobiopterin dan hiperfenilalaniemia yang diwarisi. orang Turki. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hyperprolactinemia, alat dalam kawalan rawatan kekurangan tetrahydrobiopterin: Kajian endokrin pada gadis yang terjejas. Pediatr. Res. 1998, 43, 472–477. [CrossRef]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Jinnah, H. Tetrahydrobiopterin kekurangan dan kehilangan dopamin dalam model tetikus genetik penyakit Lesch-Nyhan. J. Mewarisi. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Li, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrison, DG Tetrahydrobiopterin kekurangan dan nitric oxide synthase uncoupling menyumbang kepada aterosklerosis yang disebabkan oleh aliran terganggu. Arterioskler. debaran. Vasc. biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Kekurangan tetrahydrobiopterin sel endothelial melemahkan disfungsi vaskular dan hipotensi yang disebabkan oleh LPS. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Tidak, H.; Kim, SW; Hwang, O. Tetrahydrobiopterin menyebabkan disfungsi mitokondria dalam sel dopaminergik: Implikasi untuk penyakit Parkinson. Neurokim. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Bulan, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Kerentanan khusus neuron dopaminergik mesencephalic tikus kepada tetrahydrobiopterin: Kaitan dengan penyakit Parkinson. Neurobiol. Dis. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Yang, S.; Kim, JW; Sohn, S.; Chung, JH; Hong, YH; Lee, DH; Ahn, JK; et al. Induksi autophagy oleh kekurangan tetrahydrobiopterin. Autophagy 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et al. Tetrahydrobiopterin: Terapi antihipertensi novel. J. Hum. Hipertensi. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahydrobiopterin: Pengawal Selia Endothelial Nitric Oxide Synthase dalam Penyakit Vaskular. Trend Cardiovasc. Med. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Feng, Y.; Feng, Y.; Gu, L.; Liu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Peranan Kritikal Metabolisme Tetrahydrobiopterin (BH4) dalam Memodulasi Radiosensitiviti: Paksi BH4/NOS sebagai Malaikat atau Syaitan. Depan. Oncol. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Mandarano, AH; Maya, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Myalgic encephalomyelitis/pesakit sindrom keletihan kronik menunjukkan metabolisme sel T yang diubah dan persatuan sitokin. J. Clin. Menyiasat. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Penafian/Nota Penerbit:Kenyataan, pendapat dan data yang terkandung dalam semua penerbitan adalah semata-mata dari pengarang dan penyumbang individu dan bukan MDPI dan/atau editor. MDPI dan/atau editor(s) menafikan tanggungjawab untuk sebarang kecederaan kepada orang atau harta benda akibat daripada sebarang idea, kaedah, arahan atau produk yang dirujuk dalam kandungan.

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】