ABSTRAK

Melanin adalah pigmen utama kulit manusia, memainkan peranan utama perlindungan daripada sinaran ultraungu. Pengubahan pengeluaran melanin boleh menyebabkan penyakit hiperpigmentasi, dengan kesan estetik dan kesihatan. Oleh itu, penindas melanogenesis dianggap sebagai alat yang berguna untuk rawatan perubatan dan kosmetik. Minat yang besar tertumpu pada sumber semula jadi, bertujuan untuk mencari bahan penyahpigmen yang selamat dan tersedia secara kuantitatif. Lichens dianggap sebagai sumber yang mungkin bagi jenis sebatian ini, kerana kejadian banyak molekul fenolik mencadangkan kemungkinan kesan pada enzim fenolase yang terlibat dalam sintesis melanin, seperti tyrosinase. Dalam kerja ini, kami menggunakan empat spesies lichen, Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, dan Letharia vulpina (L.) Hue, dan Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy, untuk mendapatkan ekstrak dalam pelarut dengan kekutuban yang semakin meningkat, iaitu. kloroform, kloroform-metanol, metanol, dan air. Eksperimen perencatan tyrosinase tanpa sel menunjukkan perencatan tertinggi untuk ekstrak metanol L. vulpina, diikuti oleh C. islandica chloroform-methanol. Keputusan yang setanding untuk aktiviti penyahpigmenan diperhatikan menggunakan sistem in vitro dan in vivo, seperti sel melanoma MeWo dan larva ikan zebra. Kajian kami menyediakan bukti pertama kesan penyahpigmenan ekstrak lichen, daripada perencatan tyrosinase kepada model sel dan in vivo, menunjukkan bahawa ekstrak L. vulpina dan C. islandica patut dikaji lebih lanjut untuk membangunkan produk pemutihan kulit.

Menurut kajian yang berkaitan,cistancheadalah herba biasa yang dikenali sebagai "herba ajaib yang memanjangkan hayat". Komponen utamanya ialahcistanoside, yang mempunyai pelbagai kesan sepertiantioksidan, anti-radang, dan promosi fungsi imun. Mekanisme antara cistanche danpemutihan kulitterletak pada kesan antioksidan cistancheglikosida. Melanin dalam kulit manusia dihasilkan oleh pengoksidaan tirosin yang dimangkin olehtyrosinase, dan tindak balas pengoksidaan memerlukan penyertaan oksigen, jadi radikal bebas oksigen dalam badan menjadi faktor penting yang mempengaruhi pengeluaran melanin. Cistanche mengandungi cistanoside, yang merupakan antioksidan dan boleh mengurangkan penjanaan radikal bebas dalam badan, dengan itumenghalang pengeluaran melanin.

Klik pada Suplemen Cistanche Tubulosa untuk Pemutihan

Untuk maklumat lanjut:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Mata pelajaranSains Tumbuhan, Dermatologi

Kata kunciTyrosinase, metabolit sekunder liken, Zebrafish, Melanogenesis, Letharia vulpina, Cetraria islandica

PENGENALAN

Dalam vertebrata, sintesis melanin direalisasikan oleh sel khusus yang dipanggil melanosit, dalam organel seperti lisosom yang dipanggil melanosom. Melanisasi dikawal oleh proses yang berbeza, termasuk faktor persekitaran (cth, sinaran UV) dan endogen (cth, -MSH), rangsangan reseptor melanocortin-1 (MC1R), transduksi isyarat oleh laluan cAMP dan MAPK, pengaktifan mikroftalmia- faktor transkripsi yang berkaitan (MITF), dan ekspresi protein pra melanosom (Pmel), tyrosinase (TYR), dan protein berkaitan tyrosinase (TYRP1) (D'Mello et al., 2016; Cheli et al., 2010).

Tyrosinase (EC1.14.18.1) ialah enzim utama sintesis melanin dan telah disiasat secara meluas sebagai sasaran agen modulasi melanisasi. Ia adalah enzim yang mengandungi kuprum pelbagai fungsi, diedarkan secara meluas dalam alam semula jadi, bertanggungjawab untuk melanisasi dalam haiwan dan keperangan dalam tumbuhan dan mikroorganisma (Kondo & Hearing, 2011). Enzim ini memangkinkan dua tindak balas berbeza pembentukan melanin: hidroksilasi tirosin oleh aktiviti mikofenolat dan pengoksidaan 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) kepada o-dopaquinone oleh tindakan diphenols. O-kuinon reaktif ini menjalani pempolimeran bukan enzim untuk membentuk melanin.

Walaupun melanin dalam kulit manusia adalah pigmen penting untuk perlindungan terhadap kerosakan akibat UV, pengeluaran melanin yang berlebihan menyebabkan gangguan hiperpigmentasi, seperti melasma, ephelides, dan lentigines (Mukherjee et al., 2018). Keadaan ini merupakan masalah bagi ramai orang dan sebagai akibatnya, pencarian agen penyahpigmen telah menarik minat ramai dalam bidang perubatan dan farmaseutikal (Solano, 2014). Oleh itu, usaha penyelidikan yang besar telah diarahkan untuk menemui produk aktif semula jadi baharu yang kaya dengan perencat pigmentasi yang selamat dan tersedia secara kuantitatif (Li et al., 2013; Lo et al., 2013; Wang et al., 2011). Strategi utama adalah untuk menyasarkan tyrosinase, dengan minat yang semakin meningkat dalam produk semulajadi untuk digunakan sebagai perencat tyrosinase (Leyden et al., 2011). Dalam kesusasteraan, sejumlah besar perencat tyrosinase daripada sumber semula jadi telah dilaporkan untuk kemungkinan penggunaannya untuk merawat gangguan kulit pigmentasi (Mukherjee et al., 2018; Parvez et al., 2007). Bagi kebanyakan sebatian ini, aktiviti perencatan telah dikaitkan dengan struktur fenoliknya yang memberikan kuasa antioksidan yang tinggi. Pelbagai bukti menunjukkan bahawa lichen patut disiasat sebagai kemungkinan sumber kompaun jenis ini (Brandão et al., 2017; Higuchi et al., 1993; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018).

Lichens adalah persatuan simbiotik antara kulat heterotrofik (mycobiont) dan satu atau lebih pasangan fotosintesis (photobionts) (Nash III, 2006). Hasil daripada simbiosis, mycobiont menghasilkan beberapa metabolit sekunder (dipanggil bahan liken), yang kebanyakannya unik kepada organisma ini (Ranković & Kosanić, 2015). Metabolit ini boleh membantu melindungi daripada faktor biotik dan abiotik, seperti herbivor atau sinaran UV (Phinney, Solhaug & Gauslaa, 2018). Kebanyakannya adalah sebatian fenolik yang diperoleh terutamanya daripada laluan malonat poli asetat dan dijangka mampu melakukan beberapa aktiviti biologi. Sehubungan itu, lichen digunakan dalam ubat tradisional di seluruh dunia untuk tujuan yang berbeza (Crawford, 2015; Devkota et al., 2017), manakala bahan lichen yang berbeza telah diambil untuk aplikasi herba dan farmaseutikal (Einarsdóttir et al., 2010; Gül¸ cin et al., 2002; Ranković & Kosanić, 2015). Antara sifat yang berbeza, sifat fenolik sebatian ini menunjukkan kesan ke atas aktiviti enzim fenolase seperti tyrosinase (Honda et al., 2016). Lichen adalah sumber antioksidan semulajadi yang baik, sebahagian daripadanya diiktiraf sebagai perencat tyrosinase (Behera, Adawadkar & Makhija, 2004). Sesetengah paten juga menuntut aktiviti terhadap tyrosinase yang berkaitan dengan ekstrak liken atau sebatian liken (Takayama et al., 2010), tetapi mereka telah lama diabaikan dan diabaikan terutamanya disebabkan oleh kesukaran untuk mendapatkan bahan liken dalam kuantiti dan ketulenan yang mencukupi untuk penjelasan struktur dan ujian farmakologi (Boustie, Tomasi & Grube, 2011; Muggia, Schmitt & Grube, 2009).

Kajian ini bertujuan untuk meneroka kesan biologi bahan liken pada pelbagai model pigmentasi, kedua-dua model bebas sel dan selular, juga termasuk eksperimen Zebrafish in vivo. Selain itu, kami memberikan petunjuk tentang kemungkinan mengeksploitasi lichen untuk pengekstrakan sebatian penyahpigmen dan penyediaan produk penyahpigmenan farmaseutikal dan kosmetik. Disebabkan pengetahuan terhad tentang kesan liken pada melanisasi, kami mula-mula melakukan saringan yang dijalankan ke atas spesies berbeza yang terkenal dengan pengedaran dan kelimpahannya yang luas, iaitu. Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue, dan Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. Daripada setiap spesies, kami memperoleh satu siri empat ekstrak dengan menggunakan pelarut yang meningkatkan kekutuban, daripada kloroform tulen kepada air. Sebagai tinjauan pertama, semua ekstrak telah diuji dalam eksperimen perencatan tyrosinase bebas sel. Ekstrak yang menunjukkan aktiviti perencatan bergantung dos yang ditanda telah digunakan pada model melanisasi in vitro dan in vivo, dengan menggunakan kultur sel melanoma penghasil melanin (MeWo) dan masing-masing membangunkan embrio ikan zebra. Kami menggunakan ikan zebra kerana ia telah ditubuhkan baru-baru ini sebagai model in vivo untuk pemeriksaan berasaskan fenotip bagi sebatian pengawalseliaan melanogenik (Lin et al., 2011). Khususnya, ikan zebra telah menjadi model vertebrata yang penting untuk menilai kesan dadah kerana ia mempamerkan ciri unik, termasuk kemudahan penyelenggaraan dan pentadbiran dadah, kitaran pembiakan pendek, persenyawaan luaran, dan pembangunan, membenarkan manipulasi persekitaran pembangunan dan pengukuran optik melalui telus. dinding badan.

BAHAN DAN KAEDAH

Bahan kimia

Semua reagen telah dibeli dari Sigma-Aldrich (Milan, Itali) melainkan dinyatakan sebaliknya.

Penyediaan spesies lichen dan ekstrak

Thalli dari F. caperata dan P. perlatum dikumpulkan di kawasan hutan di timur Liguria (NW Itali), L. vulpina di kawasan hutan Valtournenche (NE Valle d'Aosta, Itali), dan C. islandica dibeli dari Kubja Ürditalu (Tallinn, Estonia). Tiada kebenaran untuk pengumpulan lichen diperlukan mengikut perundangan Itali. Bahan lichen telah dikenal pasti oleh salah seorang daripada kami (PG) menggunakan analisis mikroskop dengan bantuan kunci pengenalan dan ujian titik. Selepas itu bahan lichen dibersihkan daripada serpihan, dibiarkan kering pada suhu bilik semalaman, dan disimpan dalam beg kertas pada suhu bilik sehingga digunakan.

Lichen thalli kering telah diekstrak pada suhu bilik (kira-kira 23 ◦C) dengan empat kekutuban pelarut daripada kloroform kepada air: kloroform, kloroform–metanol (9:1), metanol dan air (14.4 g F. caperata dalam 70 mL setiap satu. pelarut, 10.4 g P. perlatum dalam 60 mL, 13.3 g L. vulpina dalam 75 mL, dan 100.6 g C. islandica dalam 500 mL). Pengekstrakan dilakukan selama 5 hari dan 3 kali untuk setiap pelarut, dengan pengadukan yang kerap. Cecair supernatan kemudiannya ditapis dan disejat hingga kering di bawah tekanan yang dikurangkan dalam sistem berputar (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Jerman) untuk mendapatkan ekstrak kering (Souza et al., 2016). Hasil ekstrak lichen dilaporkan dalam Jadual 1.

Ujian perencatan tyrosinase

Profil kromatografi TLC konvensional telah dijalankan pada plat 20×20 cm (Merck silica gel 60 F254) mengikut protokol literatur (Culberson & Kristinsson, 1970; White & James, 1985). Secara ringkas, sampel ekstrak metanol L. vulpina dan ekstrak C. islandica kloroform-metanol telah dilarutkan semula dalam pelarut pengekstrakannya dan kemudian dikesan pada plat TLC menggunakan tiub kapilari. Profil TLC telah dijalankan menggunakan toluena: asid asetik (200:30 ml) sebagai fasa mudah alih (pelarut C). Selepas bahagian hadapan pelarut dicapai, plat dibiarkan kering pada suhu bilik. Plat kering diperiksa dan difoto pada mulanya dalam cahaya yang boleh dilihat (siang hari) untuk mengesan pigmen sebagai bintik berwarna, dan kemudian dalam cahaya pendarfluor, menggunakan pengujaan 254 dan 350 nm.

Untuk menggambarkan kehadiran aktiviti perencatan tyrosinase di setiap tempat, plat TLC disembur dengan larutan L-tirosin (kira-kira 2.5 × 10−5 mmol/cm2 ) dan kemudian dengan larutan tyrosinase (kira-kira 3.6 U/cm2 ). Bintik-bintik dengan aktiviti perencatan tyrosinase kelihatan putih pada latar belakang gelap (Wangthong et al., 2007).

Kultur sel, daya maju sel, dan ujian melanin

Barisan sel melanoma manusia MeWo (kucing. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, USA, digunakan untuk ujian daya maju sel, seperti yang dilaporkan oleh Pastorino et al. (2017), dan untuk ujian melanin, seperti yang diterangkan oleh Cornara et al.(2018).

Ujian depigmentasi ikan zebrafi

Ikan zebra dewasa (Danio rerio) diperoleh daripada peniaga komersial dan disimpan dalam sistem peredaran dengan kekonduksian air 500–530 /cm pada 27 ◦C, pH 7.0–7.5 di bawah cahaya 14/10 malar/ fotokala gelap. Penjagaan veterinar haiwan telah dijalankan mengikut undang-undang Itali (D.to L.Vo 26/2014) dan eksperimen telah diluluskan oleh Badan Kajian Etika Institusi (Universiti Genoa) dan Kementerian Kesihatan Itali (kebenaran 720/ 2015-PR). Pemijahan ikan zebra dewasa dilakukan mengikut kaedah standard. Khususnya, embrio yang disegerakkan diperoleh daripada pemijahan semula jadi yang disebabkan pada waktu pagi dengan menghidupkan lampu. Embrio disusun dalam 6-plat perigi yang mengandungi 2 ml medium embrio dan 15 embrio setiap telaga. Larutan stok ekstrak telah dicairkan kepada kepekatan yang dikehendaki dengan medium embrio sejurus sebelum digunakan (ekstrak metanol L. vulpina: 6–45 µg/ml; ekstrak C. islandica chloroform-methanol: 5–65 µg/ml). Ekstrak yang dicairkan telah ditambah kepada setiap telaga dan diinkubasi dari 8 hingga 56 hpf (jam selepas persenyawaan), menghasilkan pendedahan selama 48 jam. Arbutin 10 mM digunakan sebagai kawalan positif. Penggantian medium dilakukan setiap 24 jam untuk memastikan pengagihan sebatian sebatian ujian. Embrio pada 56 hpf telah dinyahkorion oleh forsep, dibius dalam larutan tricaine methanesulfonate (Sigma Aldrich), dan kemudian difoto di bawah stereomikroskop (Leica M205C). Kesan pada pigmentasi dinilai menggunakan perisian ImageJ v. 1.74. Fungsi penganalisis ukuran piksel digunakan untuk menilai kawasan pigmentasi ikan zebra.

Analisis statistik

Keluk tindak balas dos yang diperolehi oleh perencatan tyrosinase, MTT, dan data pigmentasi ikan zebra, telah dianalisis oleh model regresi logistik, menghasilkan nilai IC50 dan IC05 yang diandaikan sebagai tahap median dan ambang, masing-masing. Perbandingan statistik dilakukan dengan persekitaran R 3.0.1 (Pasukan Teras R, 2013), menggunakan ujian ANOVA, t Pelajar dengan pembetulan Bonferroni, dan ujian Dunnett untuk pelbagai perbandingan.

KEPUTUSAN

Kesan pada aktiviti tyrosinase

Ekstrak lichen menunjukkan kompleks kesan modulasi pada aktiviti tyrosinase cendawan, dinilai secara in vitro dalam ujian bebas sel. Sesetengah ekstrak menyebabkan pengaktifan tyrosinase, terutamanya F. caperata metanol, kloroform, dan ekstrak air L. vulpina, yang lain menunjukkan tingkah laku dwifasa, manakala sesetengahnya adalah perencatan (Rajah 1 dan Jadual 2). Khususnya, kloroform-metanol (Rajah 1B) dan ekstrak metanol (Rajah 1C) menunjukkan pada keseluruhan perencatan tyrosinase yang lebih kuat, dengan kesan bergantung kepada dos. Aktiviti perencatan terkuat direkodkan untuk ekstrak metanol L. vulpina (Rajah 1C), diikuti oleh ekstrak kloroform-metanol C. islandica (Rajah 1B). Aktiviti perencatan ekstrak ini adalah satu-satunya yang dibenarkan untuk menganggarkan nilai IC50 dengan 95 peratus CI (Jadual 2). Sebagai kawalan positif, dalam eksperimen ini perencatan tyrosinase yang disebabkan oleh asid kojic dengan IC50 sebanyak 13.9 µg/ml (95 peratus selang keyakinan: 12.4–15.7).

Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501