Konjugat Dendrimer–tesaglitazar Menggerakkan Anjakan Fenotip Mikroglia Dan Meningkatkan -amyloid Fagositosis† Bahagian 2

Ujian biologi in vitro

Kultur sel. Barisan sel mikroglial murine BV2 diperolehi daripada Kemudahan Kultur Sel Hospital Kanak-kanak Michigan.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, saintis telah mendapati bahawa budaya sel berkait rapat dengan ingatan manusia. Kajian telah menunjukkan bahawa melalui kajian kultur sel, mekanisme molekul dalam ingatan dan proses pembelajaran boleh ditemui, seterusnya meningkatkan keupayaan kognitif dan ingatan manusia.

Kultur sel merujuk kepada proses meletakkan sel biologi dalam medium kultur yang mengandungi nutrien penting untuk membesar dan membiak dalam keadaan in vitro. Sel ialah unit asas kehidupan, dan budaya sel menyediakan para saintis platform untuk mengkaji tingkah laku sel dan aktiviti kehidupan. Melalui kajian sel, saintis telah menemui banyak maklumat tentang pertumbuhan neuron dan sambungan sinaptik. Penemuan ini bukan sahaja dapat membantu manusia lebih memahami cara otak berfungsi tetapi juga membantu membangunkan rawatan dan ubat baharu.

Penyelidikan dalam beberapa tahun kebelakangan ini menunjukkan bahawa budaya sel juga berkait rapat dengan ingatan manusia. Para saintis telah mendapati bahawa pembentukan dan penyelenggaraan ingatan manusia memerlukan banyak peraturan molekul dan penghantaran isyarat. Mekanisme penghantaran dan peraturan isyarat ini mempunyai banyak persamaan dengan mekanisme dalam kultur sel. Dengan mengkaji mekanisme penghantaran dan pengawalseliaan isyarat dalam budaya sel, saintis dapat memahami dengan lebih baik memori manusia dan mekanisme pembelajaran.

Di samping itu, beberapa kajian juga menunjukkan bahawa budaya sel boleh meningkatkan daya ingatan dan keupayaan pembelajaran manusia dengan cara tertentu. Sebagai contoh, menggunakan kaedah yang dipanggil "stimulasi elektrik", aktiviti sel dan hubungan antara neuron boleh dirangsang, dengan itu meningkatkan keupayaan kognitif manusia dan kesan pembelajaran. Walaupun kaedah ini masih dalam peringkat penyelidikan makmal, ia dijangka akan menjadi kaedah latihan kognitif yang baharu pada masa hadapan.

Ringkasnya, terdapat hubungan rapat antara budaya sel dan ingatan manusia. Melalui kajian sel, kita boleh lebih memahami mekanisme kognitif manusia dan mekanisme ingatan dan juga membantu membangunkan kaedah rawatan baharu dan kaedah latihan kognitif. Marilah kita menantikan sumbangan teknologi kultur sel kepada manusia pada masa hadapan! Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche boleh meningkatkan ingatan dengan ketara kerana Cistanche mempunyai kesan antioksidan, anti-radang dan anti-penuaan, yang boleh membantu mengurangkan pengoksidaan dan tindak balas keradangan dalam otak, dengan itu melindungi kesihatan sistem saraf. Selain itu, Cistanche juga boleh menggalakkan pertumbuhan dan pembaikan sel saraf, dengan itu meningkatkan ketersambungan dan fungsi rangkaian saraf. Kesan ini boleh membantu meningkatkan ingatan, keupayaan pembelajaran, dan kelajuan berfikir, dan juga boleh mencegah berlakunya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Sel BV2 dibiakkan dalam media Modified EaglesMedium (DMEM) Dulbecco dengan 10% serum fetalbovine yang tidak diaktifkan haba (HI FBS) dan 1% penisilin/streptomycin (P/S) pada 37 darjah dan 5% CO2.

Setelah sel-sel mencapai pertemuan dalam kelalang pengkulturan, sel-sel tersebut dihantar ke dalam kelalang baharu menggunakan0.05% asid trypsin–etilenediamine tetra-acetic (EDTA). Untuk eksperimen, sel BV2 telah disemai dalam DMEM dengan 5% HIFBS dan 1% P/S. 24-48 jam kemudian, sel telah dirangsang dengan 100 ng ml−1 (300 EU ml−1) LPS selama 3 jam untuk membolehkan sel memasuki fenotip pro-radang (M1) untuk mensimulasikan persekitaran neuroinflamasi yang terdapat dalam banyak penyakit neurologi.

Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat bersama dengan LPS dan sama ada Tesa atau D-Tesa percuma pada kepekatan yang berbeza-beza untuk 48 tangan kemudian supernatan dan sel dikumpulkan untuk diproses. Sel tidak pernah dirawat dengan LPS (Tiada LPS) dan sel yang dirawat dengan LPS sahaja pada setiap masa (LPS sahaja) berfungsi sebagai kumpulan kawalan. Penyelesaian stok Tesa dan D-Tesa percuma telah disterilkan menggunakan penapis poli(eter sulfon) 0.2 µm.

D-Tesa boleh larut dalam media sel. Tesa telah dilarutkan dengan menggunakan dimetilsulfoksida (DMSO) pada kepekatan akhir kurang daripada 0.1% (v/v). Sitotoksisiti, ujian oksida nitrik dan TNF- ELISA. Untuk ujian sitotoksisiti, sel telah dirawat seperti yang diterangkan di atas dalam96-plat perigi, dan kemudian sitotoksisiti Tesa dan D-Tesa percuma telah dinilai oleh ujian MTT mengikut arahan pengilang.

Untuk ujian oksida nitrik, sel telah dirawat seperti yang diterangkan di atas dalam 12-plat perigi, dan kemudian supernatan daripada sel yang dirawat telah dikumpulkan dan serta-merta paras oksida nitrik dikira dengan mengikut protokol pengilang untuk ReagenGriess.

Untuk TNF- ELISA, sel telah dirawat seperti yang dinyatakan di atas dalam 12-plat perigi, dan kemudian supernatan daripada sel yang dirawat dikumpulkan dan disimpan pada −80 darjah sehingga bersedia untuk pemprosesan selanjutnya.

Kemudian sampel dicairkan di atas ais dan TNF- ELISA dijalankan dengan mengikut protokol pengilang. Bagi kajian ini, kedua-dua D-Tesa dan Tesa percuma telah disonikasi dan dipusing sehingga kedua-duanya larut sepenuhnya. Untuk melarutkan Tesa percuma, ia terlebih dahulu dilarutkan dalam DMSO sebelum dicairkan, dengan kepekatan akhir DMSO berada di bawah 0.1%(v/v) untuk semua sampel Tesa percuma.

Oleh kerana D-Tesa larut dalam media kultur sel, DMSO tidak ditambah kepada sampel tersebut. Untuk kajian allin vitro, jumlah ubat bebas atau konjugasi yang setara telah digunakan pada sel dalam kedua-dua kumpulan Tesa dan D-Tesa percuma.

PCR masa nyata kuantitatif (qRT-PCR). Sel telah dirawat seperti yang dinyatakan di atas dalam 12-plat perigi, dan selepas mengumpul supernatan, sel telah dikumpulkan dalam Invitrogen™ TRIzol™ Reagent(dari Fisher Scientific) dan RNA telah diekstrak dengan mengikut protokol pengilang. Kepekatan dan ketulenan RNA yang terhasil dianalisis menggunakan Nanodrop.

Jumlah RNA yang setara daripada setiap sampel telah ditukar kepada cDNA dengan mengikut protokol pengilang untuk Kit Transkripsi SongsangcDNA Berkapasiti Tinggi (daripada Applied Biosystems oleh Thermo Fisher Scientific).

cDNA yang terhasil telah digunakan untuk analisis qRT-PCR menggunakan reagen hijau FAST-SYBR dan mengikut protokol pengeluar. Nilai Ct dikira oleh mesin dan data dianalisis menggunakan kaedah 2−ΔΔCt.

Bagi setiap penanda yang berbeza, nilai ΔΔCt dikira dengan menolak ΔCt untuk kumpulan No LPS daripada ΔCt untuk setiap sampel. Nilai ΔCt ialah nilai Ct untuk gen kepentingan tolak Ct untuk GAPDH bagi setiap sampel yang diberikan.

Setelah 2−ΔΔCt dikira untuk semua kumpulan, semuanya kemudiannya dinormalkan kepada kumpulan No LPS, dengan itu memberikan kumpulan No LPS tahap ekspresi arelatif 1.0 untuk semua penanda. Urutan primer ke hadapan dan ke belakang digunakan untukqRT -PCR ditunjukkan dalam jadual di bawah. Semua urutan ditulis daripada 5′→3′.

Selain itu, primer yang tersedia secara komersil telah dibeli daripada BIORAD untuk iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017{320}C5), 2 (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837}0039837), CD{002} 6404), dan PPAR (qmmucid0018821). Ujian fagositosis.

Kesan Tesa dan D-Tesa percuma pada fagositosis -amyloid telah ditentukan menggunakan kaedah yang dilaporkan sebelum ini.47 Secara ringkas, Tepung HiLyte™ 488-berlabel -amyloid1–42 (daripada Anaspec Inc.) telah dilarutkan dalam DMSO(kepekatan akhir DMSO di bawah 0.5% (v/v)) dan dicairkan kepada5 µg ml−1 dalam PBS.

Selepas merawat sel dengan Tesa dan D-Tesa dengan skema rawatan yang digariskan di atas, larutan -amyloid digunakan pada sel selama 2 jam. Kemudian, sel-sel itu dibasuh tiga kali dengan Larutan Garam Seimbang Hank dengan kation divalen (kalsium dan magnesium), dikeluarkan daripada telaga menggunakan trypsin, dan digantung semula dalam penimbal FACS (daripada Invitrogen).

Sampel disimpan di atas ais, dan serta-merta dijalankan pada mesin sitometri aliran Sony Cell Sorter SH800, dan data dianalisis dengan perisian yang berkaitan.

Gerbang telah ditetapkan menggunakan sel yang tidak dirawat dengan pendarfluor -amyloid, dan keputusan yang ditunjukkan ialah peratusan sel daripada setiap kumpulan yang mempamerkan pendarfluor di atas pendarfluor latar belakang.

Purata keamatan pendarfluor (MFA) HiLyte™ 488-berlabel -amyloid juga dilaporkan untuk setiap kumpulan. Ujian ini dilakukan dalam pendua.Statistik. Semua data yang ditunjukkan adalah hasil daripada tiga percubaan berasingan, setiap satu dilakukan dalam tiga kali ganda melainkan dinyatakan sebaliknya.GraphPad Prism 5 dan Microsoft Excel digunakan untuk melaksanakan statistik.

Ujian t Pelajar berpasangan dua ekor, dengan BonferroniCorrection, telah dilakukan. Ujian Grubbs digunakan untuk menentukan outlier. GraphPad Prism 5 untuk Windows digunakan untuk memplot data (San Diego, CA). Data yang ditunjukkan ialah purata + SEM.

Keputusan dan perbincangan

Sintesis dan pencirian D-Tesa

Untuk membolehkan penghantaran intraselular yang disasarkan kepada sel mikroglial yang diaktifkan dalam otak, Tesa telah dikonjugasikan secara kovalen pada permukaan G4-PAMAM-OH dengan ikatan ester boleh belah antara ubat dan penghubung dendrimer (Rajah 1).

Dalam langkah pertama, Tesa (1) telah bertindak balas dengan tetramethylene glycol azide (TEG-azide)(2) untuk menghasilkan Tesa-TEG-azide (3), yang mempunyai kaitan ester antara ubat dan penghubung (Rajah 1A).

HPLC bagi kompaun(3) menunjukkan masa pengekalan 13.4 minit dengan ketulenan lebih daripada 99% (Rajah S1B†). Spektrum jisim (3) menunjukkan puncak 610.13 [M + 1]+ sepadan dengan berat molekul Tesa-TEG-azide seterusnya mengesahkan pembentukan produk(Rajah S2†). Secara berasingan, G4-PAMAM-OH dendrimer (4) telah bertindak balas dengan 5-asid heksinoik menggunakan tindak balas pengesteran untuk menghasilkan D-YNE (5) (Rajah 1B).

Akhir sekali, Tesa-TEG-azide (3) dan D-YNE (5) telah bertindak balas oleh tindak balas klik kuprum-mangkinan-alkuna (CuAAC) kuprum yang sangat cekap untuk menghasilkan D-Tesa (6) (Rajah 1B).48 NMR 1H mengesahkan kejayaan sintesis semua perantaraan dan produk akhir; D-Tesa (6) mengandungi puncak ciri proton dendrimer dan penghubung dadah yang menunjukkan kejayaan sintesis D-Tesa (Rajah 2A).

NMR bagi konjugat D-Tesa akhir mendedahkan bahawa purata sepuluh molekul Tesa telah dilekatkan pada setiap dendrimer. HPLC mengesahkan konjugasi kovalen yang berjaya, kerana D-Tesa mempamerkan anjakan daripada kedua-dua D-YNE dan TesaTEG-azide (Rajah 2B dan S1†).

Tesa mempunyai keterlarutan akueus yang lemah, dianggarkan 0.0035 mg mL−1.49 Konjugasi Tesa onhydroxyl dendrimer meningkatkan keterlarutan airnya beberapa urutan magnitud daripada anggaran ini. D-Tesa ialah keterlarutan dalam air pada 22 mg mL−1, dan oleh kerana Tesa mengandungi ~19% daripada jisim D-Tesa, 4.2 mg ml−1 bersamaan Tesa telah terlarut (Rajah 3A).

Peningkatan keterlarutan yang diberikan oleh dendrimer meningkatkan kemudahan penggubalan dan menghilangkan keperluan untuk bahan bantu yang berpotensi toksik.50 Faedah ini semuanya adalah tambahan kepada keupayaan unggul dendrimer untuk menghantar ubat percuma merentasi BBB kepada mikroglia dalam vivo, dan berpotensi mengurangkan gagal untuk mencapai kesan terapeutik.18–28 Akhir sekali, D-Tesa mempunyai saiz purata 7.75 ± 0.29 nm (Rajah S3†), dan potensi zeta sebanyak 2.86 ± 0.38 mV (N=5 dan N=3 ukuran, masing-masing).

Pembebasan dadah

Kami mereka bentuk D-Tesa untuk melepaskan Tesa secara intraselular dalam lingkungan pH rendah dan kepekatan esterase tinggi indosom/lisosom mikroglia diaktifkan. Kami sebelum ini telah melaporkan bahawa dendrimer PAMAM terutamanya memasuki sel melalui endositosis fasa bendalir, dan vesikel yang mengandungi konjugat berubah menjadi lisosom.51

Kami mengeram D-Tesa pada 37 darjah dalam penimbal natrium sitrat (pH 5.5) dengan kehadiran esterase untuk meniru keadaan lisosom, seperti yang dilakukan sebelum ini.52–54 Kami juga menyiasat pelepasan dalam keadaan yang meniru keadaan plasma (garam terbuffer fosfat [PBS] ] penimbal, pH 7.4).

Di bawah keadaan plasma, hanya kira-kira 1.5% daripada Tesa dikeluarkan selepas 48 jam, dan kurang daripada 20% daripada Tesa dikeluarkan pada hari ke-25 menunjukkan kestabilan plasma konjugat (Rajah 3B).

Di bawah keadaan lisosom, kira-kira 60% Tesa dikeluarkan daripada D-Tesa dalam tempoh 48 jam pertama, dan dalam masa 19 hari, hampir 100% Tesa dikeluarkan. Keputusan ini menunjukkan bahawa D-Tesa membekalkan pembebasan ubat percuma yang dicetuskan secara berterusan untuk dua minggu pertama yang diinkubasi di bawah keadaan lisosom yang berkaitan secara fisiologi.

Selain itu, pelepasan minimum Tesa dalam keadaan plasma simulasi ( kumpulan pH 7.4) dalam tempoh 48 jam pertama adalah penting, kerana ini adalah masa edaran G4-PAMAM-OH biasa sebelum pembersihan buah pinggang, Tesa sominimal mungkin akan dikeluarkan daripada konjugat sebelum mencapai mikroglia.24

D-Tesa mengurangkan ekspresi penanda M1 dan meningkatkan penanda M2

Untuk menilai keupayaan D-Tesa untuk mendorong peralihan fenotip M1 ke M2, kami menilai keupayaan D-Tesa untuk mengubah ekspresi penanda M1 dan M2 secara in vitro menggunakan garis sel mikroglial murine (BV2).

Sel BV2 dicipta dengan mengabadikan sel mikroglial murine dan ditunjukkan sebagai sel mikroglia toprimary alternatif yang sesuai untuk mengkaji tindak balas keradangan mikroglial.55,56 Dalam eksperimen kami, untuk meniru persekitaran neuroinflamasi yang terdapat dalam pelbagai penyakit neurologi, kami merawat mikroglia dengan 100 ng ml−1 (300 endotoxinunits (EU) per ml) LPS selama 3 jam.

Kemudian, kami merawat sel bersama LPS dan sama ada Tesa atau D-Tesa percuma selama 48 jam, dan kemudian mengumpul sampel. Kami merawat sel pada kepekatan 1.5, 15, dan 150 µM percuma Tesa atau D-Tesa, berdasarkan ubat yang setara.

Ujian MTT menunjukkan bahawa Tesaor D-Tesa percuma pada kepekatan ini tidak menyebabkan sitotoksisiti (Rajah S4†). Kajian mencari dos awal telah dilakukan dengan Tesaand D-Tesa untuk menentukan dos Tesa dan D-Tesa yang paling berkesan.

Rawatan dengan Tesa dan D-Tesadid bebas 1.5 dan 15 µM tidak mengubah rembesan nitrik oksida atau TNF-, seperti yang ditentukan oleh Reagen Griess dan TNF- ELISA, masing-masing (Rajah S5†). Berdasarkan keputusan ini, kami tidak menganalisis kepekatan yang lebih rendah ini dalam ujian qRT-PCR kami.

Dalam banyak penyakit neurodegeneratif, satu fungsi neurotoksik utama proinflamasi, M1 mikroglia ialah rembesan spesies oksigen reaktif (cth oksida nitrik) yang secara langsung membunuh neuron.57,58 Selepas itu, telah didalilkan bahawa satu strategi terapeutik yang berpotensi adalah untuk mengurangkan perembesan molekul-molekul ini.

Kami menilai keupayaan D-Tesa untuk mencapai kesan ini. Selepas rangsangan LPS, D-Tesa menurunkan oksida nitrik yang dirembeskan dan tahap mRNA nitrik oksida sintase (iNOS) teraruh 3.7-kali ganda (p < 0.0001) dan 2-kali ganda (p {{ 7}}.011), masing-masing, berbanding dengan sel yang hanya dirawat dengan LPS (LPS sahaja) (Rajah 4Adan B).

Sebaliknya, Tesa percuma mengurangkan oksida nitrik yang dirembeskan dengan lebih sederhana (1.4-lipat, p=0.004) dan tidak membawa kepada penurunan ketara dalam ekspresi mRNA iNOS (Rajah 4A dan B ).

D-Tesa jauh lebih berkesan daripada Tesain percuma yang menyekat rembesan nitrik oksida. Seterusnya, bergantung kepada jika mikroglia berada dalam fenotip M1 atau M2, mikroglia mengimbangi sama ada iNOS atau Arginase 1 (Arg1) untuk memetabolismekan L-arginine untuk menghasilkan nitrik oksida untuk tindak balas membunuh patogen M1 mereka, orornithine dan urea untuk tindak balas penyembuhan luka M2, masing-masing. 59

Selaras dengan pengawalseliaan rendah iNOS, D-Tesain meningkatkan tahap mRNA Arg1 2-lipat ganda (p=0.011) berbanding kawalan LPS sahaja, manakala Tesa percuma tidak meningkatkan ekspresi dengan ketara (p=0 .40) (Gamb. 4C).

D-Tesa, dan pada tahap yang lebih rendah, Tesa bebas, menukar mikroglia daripada melepaskan nitrikoksida sitotoksik kepada memetabolismekan L-arginine untuk penyembuhan luka, yang mempunyai simplikasi dalam mengurangkan dan berpotensi membalikkan, neurotoksisiti yang disebabkan oleh mikroglia dalam neurodegenerasi.5–7,10

Penurunan regulasi iNOS dan paras nitrik oksida yang dirembes dengan rawatan D-Tesa adalah melalui kerja terdahulu yang menunjukkan ligan semula jadi PPAR (15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2) menurunkan ekspresi dan rembesan iNOS dan nitrik oksida dalam LPS yang dirawat mikroglia primer.60

IL-10, IL-4 dan TGF- 1 adalah semua sitokin yang dirembeskan oleh mikroglia M2 diaktifkan secara alternatif yang boleh mendorong persekitaran neuroprotektif, anti-radang dalam otak.58,61,62Ke arah akhir ini, D-Tesa meningkatkan ungkapan IL-105.5-lipat ganda (p=0.011) dan IL-4 8.2-lipat ganda (p { {15}}.013) berbanding kawalan LPS sahaja (Rajah 4D dan E).

Tesa Percuma tidak meningkat dengan ketara sama ada tahap IL-10 atau IL-4, walaupun purata ialah 1.7-kali ganda (p -10}.066) dan 2.{{7} }lipatan (p=0.11)lebih tinggi, masing-masing, untuk mikroglia yang dirawat Tesa berbanding dengan kawalan LPS sahaja (Rajah 4D dan E). Selain itu, D-Tesain meningkatkan ungkapan TGF- 1 2.3-lipat ganda (p=0.015) dan Tesa percuma tidak mengubah ekspresi dengan ketara (Gamb. 4F).

Oleh itu, D-Tesa mendorong rembesan sitokin anti-radang selepas rawatan LPS terhadap mikroglia, yang boleh mengurangkan persekitaran pro-radang kemudianeurotoksik yang terdapat dalam penyakit neurodegeneratif.5–7,10

Ungkapan teraruh D-Tesa bagi penanda subjenis M2-

CD206, Ccl1 dan TLR8 ialah penanda khusus untuk subjenis mikroglia M2a, M2b dan M2c.58 D-Tesa upregulatedCD206 ungkapan 4.{{10 }}lipatan (p < 0.001), Ccl1 3.5-lipatan (p < 0.005),dan TLR{17}}lipatan (p < 0.01), manakala Tesa percuma tidak meningkatkan ekspresi mana-mana daripada tiga penanda ini (Rajah 5A–C).

Data ini menunjukkan bahawa mikroglia yang dirawat D-Tesa menunjukkan peningkatan yang ketara bagi penanda bagi ketiga-tiga subjenis M2, yang bersetuju dengan pemahaman bahawa fenotip mikroglia adalah plastik dan bukan binari.63–65

Nomenklatur M1/M2 terlalu memudahkan kerumitan bahawa mikroglia boleh wujud dalam spektrum keadaan pengaktifan; sepanjang kontinum ini, tiga fenotip M2 yang berbeza (M2a, M2b, dan M2c) telah dicirikan, dan D-Tesa mendorong ekspresi penanda yang konsisten dengan setiap keadaan ini.58,61,63,66,67 M2a mikroglia terlibat dalam peningkatan fagositosis patogenik protein dengan mengawal selia reseptor pemulung, pembaikan tisu, dan tindakan anti-radang.

Mikroglia M2b adalah seperti mikroglia M1 kerana mereka menyatakan IL-1 , TNF- dan IL-6; walau bagaimanapun, M2b berbeza daripada mikroglia M1 kerana ia menyatakan IL-10 pada tahap tinggi dan mengecilkan ungkapan iNOS. Makrofaj M2b dan mikroglia merangsang sel-T Th2, yang menunjukkan salah satu peranan M2b dalam mendorong tindak balas anti-radang.

M2cmicroglia terlibat dalam penyembuhan luka, pembentukan semula tisu, penyerapan besi, dan pengaktifan STAT3 yang mengurangkan isyarat proinflamasi.58,61,63,66Aktiviti PPAR Tesa merangsang gelung ke hadapan yang mengakibatkan peningkatan ekspresi PPAR dan protein isyarat hulunya (STAT6), yang merupakan kedua-dua penanda M2a.58D-Tesa meningkatkan ungkapan PPAR 2.3-lipat ganda (p=0.0036)dan STAT6 3.4- kali ganda (p < 0.001), manakala Tesa percuma meningkatSTAT6 1.8-lipat ganda (p=0.011) tanpa peningkatan ketara dalam ungkapan PPAR (1.58-lipat ganda, p=0.17) (Gamb. 5D dan E).

Ekspresi STAT6 dan PPAR yang meningkat menghasilkan pengeluaran gen antiradang dan perencatan isyarat pro-radang dengan menghalang aktiviti NF-κB. Memandangkan mikroglia M2a boleh diinduksi dengan merawat mikroglia dengan IL-4, yang memberi isyarat melalui STAT6 dan PPAR , penyelarasan kedua-dua protein isyarat hiliran ini boleh mengakibatkan polarisasi M2a ke hadapan.68

Dalam ujian kami, pengaktifan LPS meningkatkan tahap IL-6, TNF- dan IL-1, dan rawatan dengan D-Tesa meningkatkan lagi ekspresi sitokin ini (Rajah S6A–D†), yang berkemungkinan dueto D-Tesa mendorong fenotip M2b (Rajah 5B).

Tesain Percuma meningkatkan ungkapan IL-6 dan tidak mengubah ekspresi TNF- dan IL-1 dengan ketara (Rajah S6A–D†). Walaupun sitokin ini dirembes oleh mikroglia M1, mikroglia M2b juga mengekspresikan sitokin ini.58,61 CD86 ialah penanda kedua-dua mikroglia M1 dan M2b, dan ditingkatkan dengan rawatan D-Tesa(Gamb. S6E†).

Selain itu, penindas isyarat sitokin (SOCS) ialah keluarga protein intraselular yang mengawal polarisasi fenotip mikroglia dengan menekan berbilang laluan isyarat yang diaktifkan oleh sitokin.69 SOCS1 ialah salah satu ahli keluarga ini, dan ia telah ditunjukkan untuk menghalang LPS/TLR4 pengantaraan isyarat NF-κB dan JAK2, dengan itu mengurangkan jumlah TNF-, IL-1 dan IL-6 yang dikeluarkan oleh mikroglia M1 melalui laluan LPS/TLR4.

D-Tesa mengimbangi ekspresi SOCS1 berbanding kawalan LPS sahaja (Rajah S6F†), menunjukkan bahawa peningkatan dalam IL-6, TNF- dan IL-1 yang ditunjukkan oleh D-Tesa mungkin disebabkan oleh induksi Fenotip M2b dan bukan melalui peningkatan LPS/TLR4, M{10}}fenotaip mendorong.

Selain itu, isyarat LPS melalui TLR4 dan untuk mengelakkan pengaktifan selular yang berlebihan, mikroglia mempunyai mekanisme maklum balas negatif di mana pengaktifan TLR4 membawa kepada penurunan ekspresi TLR4.70

Rawatan dengan Tesa percuma dan D-Tesa meningkatkan TLR4tahap 3.6-lipat ganda (p < 0.001) dan 3.7-lipat ganda (p < 0.001), masing-masing (Rajah 5F), menunjukkan bahawa Tesa dan D-Tesa mengubah laluan isyarat maklum balas negatif LPS/TRL4 biasa.

For more information:1950477648nn@gmail.com