Pemadaman Alox15 Memperbaiki Disfungsi Buah Pinggang Dan Menghalang Fbrosis Dengan Peningkatan PGD2 dalam Buah Pinggang
Mar 12, 2022
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
pengenalan
Asid lemak tak tepu (PUFA) dan metabolitnya dikaitkan dengan keradangan dan penyelesaiannya dalam beberapa organ [1]. Oxylipins, yang dihasilkan oleh pengoksidaan PUFA, adalah penting untuk aktiviti biologi PUFA sebagai mediator lipid [1, 2]. Biosintesis oxylipins dimediasi oleh beberapa enzim, seperti lipoxygenase (LOX), cyclooxygenase (COX), dan cytochrome P450 (CYP) [3]. Enzim ini menghasilkan beberapa metabolit lipid, seperti prostaglandin, leukotrien, dan lipoxin, yang semuanya sangat terlibat dalam pengawalan keradangan [1, 4]. Sebagai contoh, ALOX15, subjenis utama LOX, mempunyai dua aspek sifat proinflamasi dan anti-radang melalui metabolitnya [5]: ALOX15 sangat dinyatakan dalam eosinofil, sel epitelium bronchoalveolar dan makrofaj alveolar dalam keadaan bukan patologi [5, 6]. ], dan menggalakkan keterukan asma [7], kecederaan paru-paru [8], dan kegagalan jantung [9], manakala ia mengatasi keradangan pada arthritis [10] dan otak iskemia [11]. Selain itu, mediator lipid dan enzimnya menjejaskan fibrosis organ serta keradangan. Pengantara lipid khusus terlibat dalam patogenesis paru-paru [12], hati [13], dan jantung [14] fibrosis. Begitu juga, ALOX15 yang disebutkan di atas juga dikaitkan dengan patogenesis fibrosis seperti fibrosis dermal [15].
Salah satu penyakit kronik yang biasa adalah kronik penyakit buah pinggang(CKD), yang menjejaskan kira-kira 8-16 peratus daripada populasi umum dalam semua peringkat digabungkan [16]. Walaupun patogenesis CKD adalah kompleks dan berbeza-beza bergantung kepada penyakit yang mendasari,buah pinggangtisu secara amnya menjadi tidak berfungsi, membawa kepada peringkat akhirkegagalan buah pinggangdisebabkan oleh keradangan kronik dan fibrosis seterusnya [17]. Seperti yang dinyatakan, mediator lipid yang diperoleh daripada PUFA sangat dikaitkan dengan keradangan dan fibrosis yang terhasil. Sebagai contoh, lipoxin dan resolvins menghalang fibrosis buah pinggang [18, 19], tetapi kesan ini belum lagi diperiksa dalam model CKD dengan gangguanfungsi buah pinggang.Selain itu, profil lipidomik komprehensif dalam CKDbuah pinggangtisu masih tidak dilaporkan. Oleh itu, peranan enzim metabolik lipid dan produknya dalam patogenesis CKD masih kurang difahamiKajian ini bertujuan untuk menjelaskan penglibatan enzim metabolisme asid lemak dan produknya dalambuah pinggangkemerosotan 5/6 tikus model CKD nefrektomi (Nx). Kajian ini mendedahkan bahawa kedua-dua tahap transkripsi dan ekspresi protein Alox15 telah meningkat dalam CKDbuah pinggang, dan tikus Alox15−/− menunjukkan peningkatanbuah pinggangdisfungsi dan fibrosis dalam model CKD. Selain itu, PGD2, yang merupakan peningkatan metabolit lipid dalam CKDbuah pinggangdaripada tikus Alox15−/−, menghalang peralihan epitelium-mesenchymal (EMT) dalam sel kultur tubular proksimal. Oleh itu, perencatan Alox15 dan / atau pentadbiran PGD2 boleh menjadi sasaran terapeutik novel CKD dan fibrosis.
Kata kunci:penyakit buah pinggang yang kronik; lipoksigenase; ALOX15; Lipidomik mediator; Asid lemak tak tepu; buah pinggang
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Bahan dan kaedah
Haiwan dan eksperimenKajian ini menggunakan 8-tikus C57BL/6 J jantan berumur seminggu (CLEA Jepun), yang telah disesuaikan selama 1 minggu sebelum semua eksperimen dilakukan. Selain itu, tikus Alox15−/− dijana dalam latar belakang C57BL/6 J (Makmal Jackson), dan model 5/6 Nx telah ditubuhkan mengikut kajian terdahulu [20]. Kami mengumpul sampel darah untuk penilaianfungsi buah pinggangdanbuah pinggangsampel tisu untuk immunoblotting dan tindak balas rantai polimerase pada 8 minggu selepas 5/6 Nx, dan untuk analisis histologi pada 40 minggu selepas 5/6 Nx. Semua eksperimen mematuhi garis panduan untuk penyelidikan haiwan TMDU, dan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan TMDU meluluskan protokol kajian kami (nombor kelulusan: A2019-117C4).
Lipidomik mediator berasaskan LC-MS/MSKami menjalankan analisis LC-MS / MS seperti yang diterangkan sebelum ini [21, 22]. Butiran prosedur diterangkan dalam Kaedah Tambahan,Kaedah eksperimen lainKami menerangkan kaedah eksperimen lain dalam Kaedah Tambahan.
Keputusan
Tahap mRNA Alox15 telah meningkat dalam buah pinggang 5/6 NxPerubahan kuantitatif enzim oxylipin dalam CKDbuah pinggangtelah disiasat dengan menggunakan tikus C57BL/6 untuk operasi palsu atau 5/6 Nx seperti yang diterangkan sebelum ini [20]. Untuk menganalisis ekspresi enzim oxylipin utama yang dinyatakan dalam buah pinggang (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 dan Cyp2c44) [23, 24], kami mengekstrakbuah pinggangsampel. Antara enzim, Alox15 dalam 5/6 Nxbuah pinggangmempunyai tahap mRNA yang ketara tinggi (P=0.0004) berbanding dengan yang secara palsubuah pinggang(Rajah 1). Sebaliknya, tahap mRNA enzim utama yang lain tidak berubah dengan ketara dalam model CKD ini.
Tahap protein Alox15 telah meningkat dalam sel tubular proksimal buah pinggangDalam 5/6 Nxbuah pinggang, paras protein ALOX15 turut meningkat (P=0.0078), seperti yang dijangkakan oleh peningkatan paras transkrip (Rajah 2a). Untuk menentukan jenis sel mana yang telah meningkatkan tahap protein Alox15 dalam CKDbuah pinggang,kami mengkaji penyetempatan mRNA Alox15 dengan hibridisasi in situ. Hibridisasi in situ kepada mRNA mendedahkan bahawa tahap ekspresi tinggi Alox15 disetempatkan padabuah pinggangsel tiub dalam model 5/6 Nx, tetapi tidak dalam glomeruli (Rajah 2b). Ciri-ciri histologi mencadangkan bahawa mRNA Alox15 sangat kuat dalam tubul proksimal.
Alox15−/− tikus tahan terhadap kerosakan buah pinggang dan fibrosis dalam model 5/6 NxDalam 5/6 Nx CKDbuah pinggang, tahap ekspresi transkripsi dan protein ALOX15 telah dinaikkan. Oleh itu, kami menyiasat sama ada dan bagaimana ALOX15 memainkan peranan dalam CKD dari segibuah pinggangdisfungsi dan fibrosis buah pinggang. Untuk tujuan ini, tikus Alox15−/− digunakan pada model 5/6 Nx CKD. Menariknya, paras serum Cre dan nitrogen urea darah (BUN) lebih rendah dalam tikus Alox15−/− 5/6 Nx
daripada tikus jenis liar (WT) (Rajah 3a), menunjukkan bahawa pengurangan Alox15 menunjukkan kesan perlindungan dalam patogenesis CKD. Sehubungan itu, NGAL (akerosakan buah pinggangpenanda) ekspresi protein telah ditindas dalam tikus Alox15−/− berbanding dengan tikus WT (Rajah 3b). Selain itu, tetikus Alox15−/−buah pinggangmenunjukkan penurunan paras mRNA Col1a1, Fn dan Acta2 ( SMA) (Rajah 3c), dan juga menunjukkan penurunan fibronektin dan ekspresi protein SMA (Rajah 3d). Selain itu, tetikus Alox15−/−buah pinggangmempamerkan perubahan fibrotik interstisial yang ditindas dengan jelas ditunjukkan dalam pewarnaan trichrome Masson (Rajah 3e). Oleh itu, pemadaman Alox15 bertambah baikbuah pinggangdisfungsi dan fibrosis dalam model haiwan CKD.
Lipidomik mediator mendedahkan metabolisme PUFA yang diubah dalam buah pinggang Alox15−/− CKDSeperti yang dinyatakan dalam bahagian Pengenalan kertas ini, kesan biologi Alox15 berkaitan dengan mediator lipid yang dihasilkan oleh Alox15. Untuk menjelaskan profil metabolit lipid yang dihasilkan oleh Alox15 dalam CKDbuah pinggang,kami meneliti dan membandingkan sham dan 5/6 Nxbuah pinggangsampel oleh lipidomik mediator berasaskan LC-MS/MS untuk menentukan profil mediator lipid antara tikus WT dan tikus Alox15−/− CKD (Jadual Tambahan 1). Jadual 1 menunjukkan metabolit lipid yang berbeza secara ketara antara tikus Alox15 plus / plus dan Alox15−/− di bawah keadaan 5/6 Nx. Di samping itu, kami membuat peta laluan mediator lipid dengan pengelasan mengikut substrat dan enzim metabolismenya (Rajah 4). Satu siri Alox15-metabolit PUFA yang diperolehi seperti 14-HDoHE, 17-HDoHE dan 15-HEPA [5, 25–27] telah meningkat dengan ketara dalam model CKD yang berkorelasi baik ke tahap peningkatan ekspresi ALOX15 dalambuah pinggang (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">buah pinggangberbanding dengan buah pinggang WT CKD, manakala hanya PGD2 meningkat dengan ketara dalam buah pinggang Alox15−/− CKD (Rajah 6).
PGD2 menindas EMT dalam sel buah pinggang berbudayaKesan metabolit lipid yang berbeza dengan ketara antara tikus Alox15 plus / plus dan Alox15−/− di bawah keadaan 5/6 Nx telah diperiksa dengan mentadbir lipid ini kepada sel NRK-52E yang diaktifkan oleh sitokin pro-fibrotik TGF - 1. Kami menilai ekspresi mRNA Cola1a dan Acta2 ( SMA) sebagai tindak balas kepada TGF- 1 untuk menentukan kesan lipid ini dalam kultur (Rajah 7a). Antaranya, PGD2 memberikan kesan antifibrotik yang kuat pada sel NRK-52E sebagai tindak balas kepada TGF- 1. Kesan penindasan PGD2 pada ekspresi COL1A1 dan SMA adalah bergantung kepada dos dengan EC50 masing-masing 7.12 μM dan 6.48 μM (Rajah 7b). Selain itu, kami menjalankan eksperimen yang sama dalam sel HK-2, iaitu sel epitelium tubul proksimal yang diabadikan daripada manusia dewasa normalbuah pinggang,dan mendapati hasil yang sama, iaitu, perencatan COL1A1 dan SMA dalam cara yang bergantung kepada dos, sebagai tindak balas kepada rawatan dengan PGD2 (Rajah 7c). Oleh itu, peningkatan tahap PGD2 dalam Alox15−/− CKDbuah pinggangboleh menyumbang kepada kesan antifibrotik dalam CKD.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
15-PGDH, enzim metabolisme PGD2 utama, telah dikurangkan dalam buah pinggang Alox15-/- CKDUntuk menjelaskan mekanisme peningkatan PGD2 dalambuah pinggangdaripada tikus model Alox15−/− CKD, kami mengukur tahap mRNA sintase PGD2. PGD2 synthase (PGDS) mempunyai dua isoform: lipocalin PGDS (L-PGDS) dan PGDS hematopoietik (H-PGDS) [28]. Kedua-dua tahap L-PGDS dan H-PGDS meningkat dengan ketara di bawah keadaan 5/6 Nx jika dibandingkan dengan tahap yang di bawah keadaan palsu dalambuah pinggangtikus WT (Rajah 8a, kedua-dua P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, yang dikenali sebagai enzim metabolisme2-PGD utama [29, 30]. Walaupun tahap mRNA COX-1, COX-2 dan AKR1C18 tidak berubah, tahap mRNA 15-PGDH dikurangkan dengan ketara dalam CKDbuah pinggangtikus Alox15−/− jika dibandingkan dengan tikus WT (Rajah 8b, P=0.0325), yang berpotensi membawa kepada peningkatan PGD2 dalam CKDbuah pinggangdaripada Alox15−/− tikus.
Perbincangan
Kajian ini menunjukkan bahawa dalam CKDbuah pinggangsampel, kedua-dua tahap transkripsi dan protein Alox15 telah meningkat, danbuah pinggangdisfungsi dan fibrosis telah diperbaiki dalam tikus Alox15−/−. Di samping itu, lipidomik mediator berasaskan LC-MS/MS mendedahkan bahawa tetikus Alox15−/− CKDbuah pinggangtelah meningkatkan tahap PGD 2 dengan ketara berbanding dengan tikus WT. PGD2 menghalang EMT sel NRK-52E dan HK-2; oleh itu, peningkatan PGD2 boleh menyumbang kepada rintangan Alox15−/− tikus terhadapkecederaan buah pinggangdan fibrosis. Hubungan antarapenyakit buah pinggangdan profil lipid menggunakan lipidomik pada serum atau plasma manusia telah disiasat secara meluas [31-33], tetapi tidak padabuah pinggangtisu. Begitu juga, walaupun laporan mengenai lipidomik menggunakan model haiwan CKD adalah sedikit [34-36], semua kajian ini melakukan lipidomik pada sampel plasma daripada model haiwan CKD; walau bagaimanapun, tiada lipidomik komprehensif padabuah pinggangtisu daripada model CKD telah dilaporkan lagi. Lipidomik langsung pada tisu juga berkesan, serta sampel plasma, dalam mengenal pasti metabolit berfungsi. Selain itu, perubahan metabolit dalam tisu, serta sampel darah, adalah jauh berbeza mengikut organ [20]. Dalam kajian ini, kami menganalisis dengan teliti profil mediator lipid yang diperolehi PUFA dalambuah pinggangtisu model haiwan CKD.
Kajian ini memberi tumpuan kepada ALOX15, yang merupakan salah satu enzim utama yang memetabolismekan PUFA. Dalam kajian ini, kedua-dua tahap ekspresi protein dan mRNA ALOX15 telah meningkat dengan jelas dalam CKDbuah pinggang. Kami menangani jenis sel yang bertanggungjawab untuk ekspresi ALOX15 dalam CKDbuah pinggang,dan dengan hibridisasi in situ, kami mendapati peningkatan ekspresi mRNA ALOX15 dalambuah pinggangsel tiub dalam model 5/6 Nx.
ALOX15 terlibat dalam penyakit kronik, seperti aterosklerosis, dan pemadamannya dalam model penyakit haiwan meningkatkan penyakit ini [5]. Berkenaan persatuan ALOX15 denganpenyakit buah pinggang, proteinuria berkurangan dalam Alox15−/− tikus di bawah kecederaan glomerular oleh model nefropati diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin [37]. Walau bagaimanapun, model tetikus diabetes mellitus ini tidak menunjukkan sebarang penurunanfungsi buah pinggang; oleh itu, mekanisme bagaimana ALOX15 dikaitkan dengan terjejasfungsi buah pinggangdalam model CKD masih tidak jelas. Dalam kajian ini, menggunakan model tetikus 5/6 Nx, kami mendapati bahawa pemadaman ALOX15 telah diperbaiki.buah pinggangdisfungsi danbuah pinggangfibrosis dalam model CKD. Sehingga kini, hanya IL-4 dan IL-13 dalam monosit diketahui sebagai faktor pengawalseliaan yang secara langsung meningkatkan ekspresi ALOX15 [5]. Walau bagaimanapun, masih tidak jelas apa yang meningkatkan ALOX15buah pinggangsel tiub. Pelbagai sitokin dan toksin uremik diketahui meningkat dalam plasma dan buah pinggang dalam CKD [38, 39]. Antaranya, mungkin terdapat pengawal selia baru ALOX15. Kajian lanjut diperlukan untuk menjelaskan faktor pengawalseliaan utama ALOX15 dalam CKD. Dalam kajian kami untuk mengenal pasti oxylipin campur tangan khusus yang menghubungkan penghapusan Alox15 kepada kesan renoprotektifnya dalam model 5/6 Nx, kami mendapati bahawa PGD2 mungkin terlibat dalam penentangan terhadapkerosakan buah pinggangdisebabkan oleh pemadaman ALOX15. Sebagai pemahaman umum, untuk menjana PGD2, COX-1 dan
CCOX-2 menghasilkan PGG2 daripada asid arakidonik, yang kemudiannya ditukar kepada PGH2. Apabila PGH2 dimetabolismekan oleh PGD2 synthase (PGDS), PGD2 dihasilkan [28]. PGDS mempunyai dua isoform yang berbeza secara genetik, iaitu, lipocalintype PGDS (L-PGDS) dan PGDS jenis hematopoietik (H-PGDS) [28]. Walaupun PGD2 meningkat dalam tetikus Alox15-/- CKDbuah pinggang, L-PGDS mahupun H-PGDS tidak dinaikkan dalam tetikus Alox15−/− CKDbuah pinggang, walaupun peningkatan besar dalam PGDS dalam tetikus CKD WTbuah pinggang(Gamb. 8a). Tambahan pula, kami juga mendedahkan bahawa COX-1 mahupun COX-2 tidak meningkat dalam buah pinggang tikus Alox15−/− CKD (Rajah 8b). Keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan dalam PGD 2 dalam buah pinggang tetikus Alox15−/− CKD bukan disebabkan oleh peningkatan dalam sintase tetapi disebabkan oleh peningkatan ketersediaan substrat atau perencatan degradasi, dan sebenarnya, kami telah mendedahkan pengurangan dalam {{ 7}}PGDH, salah satu daripada enzim metabolisme PGD2 utama [29], dalam buah pinggang tikus Alox15−/− CKD (Rajah 8b). Siasatan lanjut diperlukan untuk menjelaskan sebab pemadaman Alox15 membawa kepada penurunan dalam 15-PGDH.
Seperti yang dinyatakan di atas, PGD2 boleh terlibat dalam penentangan terhadapkecederaan buah pinggangdisebabkan oleh kerugian ALOX15. Dalam kajian ini, PGD2 menghalang EMT oleh TGF- 1 dalam sel NRK-52E dan HK-2, yang mewakili sel tubular proksimal. PGD2 mengikat kepada dua reseptor berganding protein G yang berbeza, iaitu, DP1 dan DP2, yang fungsinya berbeza [28]. Walau bagaimanapun, dalam eksperimen in vitro kami, PGD2 berkesan pada kepekatan antara 4 hingga 32 μM, yang agak tinggi, memandangkan nilai Ki DP1 dan DP2 ialah 1.7 nM dan 2.4 nM, masing-masing [28]. Keputusan ini menunjukkan bahawa PGD2 mungkin memberikan kesan antifibrotik bukan melalui reseptor yang digabungkan dengan protein G tetapi melalui laluan lain seperti PPAR , yang melaluinya 15-d-PGJ2, metabolit PGD2 hiliran, diketahui memberikan kesannya [28]. Dalam kajian ini, yang memberi tumpuan kepada enzim metabolik lipid dan metabolitnya, perencatan ALOX15 dan/atau pentadbiran PGD2 boleh menjadi sasaran terapeutik yang menjanjikan untuk CKD. Malangnya, tiada perencat khusus ALOX15 yang boleh digunakan dalam amalan klinikal telah dibangunkan [40, 41]. Penyasaran terapeutik metabolit berfungsi hiliran, seperti PGD2, dan bukannya perencatan enzim metabolisme asid lemak, yang menjejaskan pelbagai metabolit, boleh menjadi terapi CKD yang ideal.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
