Danegaptide Menghalang TGF 1-Kerosakan Terinduksi dalam Sel Epitelium Tubul Proksimal Manusia Buah Pinggang
Mar 12, 2022
Abstrak:Kronikpenyakit buah pinggang(CKD) ialah masalah kesihatan global yang dikaitkan dengan beberapa komorbiditi. Bukti terkini membabitkan peningkatan pelepasan adenosin trifosfat (ATP) yang dimediasi hemichannel dalam perkembangan fibrosis tubulointerstitial, patologi asas utama CKD. Di sini, kami menilai kesan danegaptide pada menyekat perubahan pengantara hemichannel dalam ekspresi dan fungsi protein yang berkaitan dengan perkembangan penyakit dalam epitelium tiub.buah pinggangsel. Sel epitelium tubul proksimal manusia primer (hPTECs) telah dirawat dengan isoform beta1 faktor pertumbuhan mengubah sitokin pro-fibrotik (TGF 1) ± danegaptide. qRT-PCR dan immunoblotting mengesahkan mRNA dan ekspresi protein, manakala susunan antibodi sitokin menilai ekspresi/rembesan sitokin proinflamasi dan profibrotik. Pengambilan pewarna Carboxyflfluorescein dan biosensing ATP mengukur aktiviti hemichannel dan pelepasan ATP, manakala rintangan elektrik transepithelial digunakan untuk menilai kebolehtelapan paraselular. Danegaptide menafikan pengambilan pewarna carboxyfluorescein dan pembebasan ATP dan dilindungi daripada perubahan protein yang berkaitan dengan kecederaan tiub. Menyekat Cx43-pelepasan ATP yang dimediasi selari dengan pemulihan separa ekspresi perencat kitaran sel, perekat dan protein simpang ketat serta kebolehtelapan paraselular yang berkurangan. Tambahan pula, danegaptide menghalang TGF 1-mengakibatkan perubahan dalam ekspresi dan rembesan adipokin utama, sitokin, kemokin, faktor pertumbuhan dan interleukin. Data menunjukkan bahawa sebagai modulator simpang jurang dan penyekat hemikhannel, danegaptide mempunyai potensi dalam rawatan CKD pada masa hadapan.
Kata kunci:danegaptide; connexin; hemik saluran; ATP; penyakit buah pinggang yang kronik; keradangan; fibrosis; hPTEC; TGF 1; buah pinggang, buah pinggang
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
pengenalan
Kronikpenyakit buah pinggang(CKD) adalah kebimbangan kesihatan yang semakin meningkat yang dikaitkan dengan peningkatan risiko penyakit kardiovaskular dan morbiditi [1]. Dianggarkan menjejaskan 10 peratus daripada populasi global [2], faktor risiko termasuk umur, diabetes, hipertensi, dislipidemia dan obesiti [3]. Penyakit ini dicirikan oleh penurunan kadar penapisan glomerular (GFR), sebagai tambahan kepada proteinuria, dengan glomerulosklerosis, atrofi tiub dan fibrosis tubulointerstitial (TIF), yang merupakan perubahan histopatologi biasa [4]. Memuncak dengan kehilangan kestabilan epitelium, keradangan berterusan dan peningkatan pemendapan matriks ekstraselular [5,6], rawatan TIF dan CKD lanjutan mewakili keperluan klinikal yang tidak dipenuhi [3]. Oleh itu, pendekatan terapeutik segera diperlukan. Ekspresi dan fungsi connexin (Cx) yang diubah telah terlibat dalam patologi pelbagai bentuk penyakit (seperti yang disemak dalam [7]), termasuk CKD (seperti yang disemak dalam [8,9]). Connexins adalah keluarga protein terikat membran yang oligomer menjadi himpunan heksamerik yang dipanggil connexons [10]. Apabila sel-sel jiran diselaraskan, konnexon berlabuh untuk membentuk persimpangan jurang, liang berterusan yang melaluinya molekul penghantar boleh ditukar, membenarkan laluan komunikasi langsung [10]. Apabila tidak terikat, penghubung membentuk hemikhannel melalui mana molekul, contohnya, adenosin trifosfat (ATP), boleh dilepaskan ke dalam ruang ekstraselular tempatan untuk mempengaruhi sel-sel jiran melalui pengaktifan purinoreseptor [11]. Ekspresi reseptor P2X7 purinergic (P2X7R) dikawal selia dalambuah pinggangtubul individu yang menghidap diabetespenyakit buah pinggang[12] dan telah banyak terlibat dalam perkembangan fibrosis kedua-duanya dalambuah pinggang[13–17] dan dalam jenis tisu lain [18–21]. Tidak mengejutkan, penyasaran isyarat purinergik telah mendapat perhatian yang besar. Walau bagaimanapun, sehingga kini, ujian klinikal telah gagal untuk menunjukkan kesan berfaedah antagonisme P2X7R dalam pelbagai keadaan keradangan, kesan yang mungkin dikaitkan dengan variasi genetik dalam reseptor [22]. Menyasarkan huluan pelepasan ATP akan mengelakkan masalah ini.
Bukti memautkan ungkapan menyimpang dan/atau aktiviti connexin dengan pelbagai bentuk CKD [12,23-26]. Kajian awal oleh Abed et al. melaporkan bahawa tikus heterogen (Cx43 plus /-), dengan halangan ureter unilateral (UUO), mempamerkan pemendapan matriks ekstraselular (ECM) berkurangan dan mengurangkan keradangan [27], manakala Cx43-mimetik khusus, GAP{{6} }, mampu menghalang lekatan monosit dan menumpulkan ekspresi kolagen I dalam model tetikus renin transgene (RenTG) CKD yang bergantung kepada renin [25]. Baru-baru ini, kami mengenal pasti bahawa isoform penghubung utama yang dinyatakan dalam tubul proksi mal, Cx43, dinaikkan dalam bahan biopsi yang diasingkan daripada individu dengan nefropati diabetik, pemerhatian yang selari dengan peningkatan pelepasan ATP pengantara hemichannel dalam TGFp{11}}primary yang dirawat. sel tubul proksimal [12]. Dalam menilai kesan peningkatan tempatan dalam kepekatan ATP ekstraselular, kami menentukan bahawa komunikasi pengantara Cx{13}}yang menyimpang memulakan pembongkaran pematuhan (cth, E-cadherin) dan kompleks simpang ketat (cth, Zona Occludens) melalui pengaktifan P2X7R. Kesan ini, yang telah dinafikan dalam model tetikus Cx43 plus /- heterogen UUO [12], mencadangkan hubungan yang jelas antara Cx43 dan kecederaan tiub. Walaupun ablasi separa Cx43 mengesahkan peranan penghubung dalam memulakan perubahan fenotip kecederaan tiub, campur tangan farmakologi dengan peptide5 penyekat hemikhannel Cx43 membuktikan bahawa sifat perlindungan aktiviti Cx43 yang berkurangan ini berpunca daripada perencatan pembebasan ATP pengantara hemikhannel. Penggunaan peptida mimetik untuk menekankan sifat perlindungan di sebalik menyekat aktiviti hemichannel telah berjaya dilaporkan dalam model penyakit lain, termasuk retinopati [28], neuroinflammation [29], glioma [30,31] dan degenerasi makula yang berkaitan dengan usia [32, 33]. Akhirnya, kajian mengaitkan aktiviti penghubung yang diubah kepada peningkatan keradangan [34-36] dan fibrosis [37-40] dan mencadangkan bahawa menstabilkan komunikasi pengantara hemichannel dan/atau gap-junction-mediated (GJIC) boleh melambatkan permulaan kerosakan diperhatikan dalam pelbagai model kecederaan. Akibatnya, menghalang hemichannel connexin menyediakan cara yang menarik untuk mengurangkan keradangan dan mempunyai kepentingan terapeutik yang besar.
Danegaptide ((2S, 4R)-1-(2-aminoacyl)-4-benzamidopyrrolidine2-asid karboksilik), juga dikenali sebagai ZP1609 atau GAP-134, ialah sejenis dipeptida yang diperoleh daripada rotigaptide (AAP10, ZP123). Pada asalnya dibangunkan sebagai agen anti-aritmia [41], ia berinteraksi dengan Cx43 [42] dan bertindak sebagai pengubah simpang jurang yang kuat [43]. Kompaun ini telah menunjukkan sifat perlindungan dan anti-aritmia dan sebelum ini telah menunjukkan kesan ketara dalam model praklinikal yang telah ditetapkan bagi kecederaan reperfusi iskemia jantung [44,45]. Walaupun ujian klinikal manusia fasa 2, malangnya, gagal memenuhi titik akhir mereka [46], kajian dari kumpulan lain telah meneroka potensi terapeutik danegaptide dalam jenis tisu dan model penyakit lain [41,47-49]. Selain itu, walaupun sedikit diketahui peranannya dalam memodulasi aktiviti hemichannel, ia telah ditunjukkan bahawa danegaptide mengurangkan pengambilan pewarna pengantara hemichannel dalam sel glioma C6 [43]. Walaupun begitu, peranan untuk sebatian ini dalam menyekat pembebasan ATP pengantara hemichannel dalam jenis tisu lain masih perlu disahkan.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Kajian semasa menyiasat keberkesanan danegaptide dalam menafikan pelepasan ATP hemikhanel pengantara pengantara dalam TGF 1-sel epitelium tubul proksimal manusia (hPTECs) yang dirawat primer, sebelum menggambarkan peranan perlindungannya terhadap ekspresi dan perubahan fungsi yang biasanya dikaitkan dengan perkembangan fibrosis tubulointerstitial. Menggunakan teknik untuk menentukan perubahan dalam ekspresi (qRT-PCR, immunocytochemistry, immunoblotting, susunan antibodi) dan fungsi (biosensing ATP, pengambilan pewarna, rintangan elektrik transepithelial, susunan antibodi), penemuan kami menunjukkan bahawa kepekatan nanomolar blok danegaptide Cx hemichannel-mediated ATP melepaskan dan melemahkan sebahagiannya TGF 1-perubahan yang disebabkan dalam ekspresi protein kitaran sel (cth, p16, p21, cyclin D1) dan faktor reno-pelindung (cth, Klotho). Selain itu, danegaptide mengurangkan perubahan yang sering diperhatikan dalam kecederaan tiub, termasuk pembongkaran simpang adherens (termasuk kehilangan E-cadherin) dan simpang ketat (termasuk kehilangan zona occludens 1 (ZO-1) dan claudin 2). Yang penting, susunan profiler proteome menunjukkan keupayaan danegaptide untuk memulihkan perubahan dalam ekspresi dan rembesan protein matriks ekstraselular utama, adipokin, kemokin dan faktor pertumbuhan yang disebabkan oleh TGF 1. Akibatnya, data in vitro kami mencadangkan bahawa danegaptide (50-100 nM ) boleh berjaya menyekat pelepasan ATP yang dimediasi hemichannel dalam hPTEC primer dan melindungi sebahagian daripada perubahan yang berkaitan dengan keradangan dan fibrosis, seperti yang diperhatikan dalam CKD peringkat akhir.
2. Keputusan
2.1. Danegaptide Tidak Menjejaskan Daya Daya Sel Epitelium TiubManusiabuah pinggang2 (HK2) sel telah dibiakkan dalam glukosa rendah (5 mM) selama 48 jam, sebelum dimakan serum semalaman dan seterusnya dirawat dengan kepekatan optimum TGF 1 (10 ng/mL) [12,24] ± danegaptide (50). nM–1 µM) selama 48 jam (Rajah 1A, n=3). Ujian 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) mengesahkan bahawa tiada TGF 1 (101.9 ± 11.7 peratus ) mahupun danegaptide sahaja mengubah daya maju sel (95.2 ± 7 peratus (50 nM), 103 ± 5.7 peratus (100 nM) dan 96.6 ± 5.3 peratus (1 µM)) berbanding kawalan. Tiada kesan diperhatikan apabila TGF 1-sel yang dirawat diinkubasi bersama dengan danegaptide (104.1 ± 2.2 peratus (50 nM), 93.4 ± 1.6 peratus (100 nM) dan 89.3 ± 3.7 peratus (1 µM)). Untuk menyokong data ini, ujian kristal violet (CV) dan laktat dehidrogenase (LDH) telah dilakukan. Pelepasan LDH dalam TGF 1-sel yang dirawat adalah setanding dengan kawalan (109.3 ± 11.3 peratus ), dan inkubasi bersama dengan danegaptide tidak mempunyai kesan tambahan (106.4 ± 11.6 peratus (50 nM), 113.9 ± 15.6 peratus (100 nM) dan 113.2 ± 4.3 peratus (1 µM)). Seperti yang dijangkakan, danegaptide sahaja tidak mengubah pelepasan LDH dengan ketara berbanding kawalan (104.4 ± 4.3 peratus (50 nM), 95.3 ± 4.7 peratus (100 nM) dan 92.6 ± 3.3 peratus (1 µM)). Pewarnaan sel menggunakan kristal violet menyusun semula fifinding ini, dengan data untuk TGF 1 (10 ng/mL; 96.9 ± 7.3 peratus ) dan TGF 1 ditambah danegaptide (50 nM–1 µM) setanding dengan kawalan (98.2 ± 1.9 peratus (50 nM) , 97.5 ± 1.8 peratus (100 nM) dan 85.8 ± 5.3 peratus (1 µM). Akhir sekali, danegaptide sahaja tidak mengubah pewarnaan kristal ungu (98.3 ± 2.5 peratus (50 nM), 99.6 ± 2.7 peratus (100 nM) dan 98 nM 2.2 peratus (1 µM) kawalan) Berdasarkan data ini, kepekatan 50–100 nM telah dipilih untuk kajian seterusnya.
Rajah 1. Danegaptide menghalang TGF 1-menimbulkan peningkatan dalam pengambilan pewarna pengantara hemikhannel. Dalam panel (A), manusiabuah pinggang2 (HK2) sel telah dikultur dalam glukosa rendah (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50, 100 dan 1000 nM) selama 48 jam dan daya maju sel adalah dinilai. Keputusan dibentangkan sebagai min ± SEM (n=3). Pengeraman dengan TGF 1 (10 ng/mL ± danegaptide (50–1000 nM)) tidak mengubah 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 19}}pengambilan diphenyltetrazolium bromide (MTT), pelepasan laktat dehidrogenase (LDH) atau pewarnaan kristal violet (CV). Dalam panel (B) dan (C), pengambilan pewarna carboxyfluorescein digunakan untuk menilai aktiviti hemichannel dalam sel HK2 dan sel epitelium tubul proksimal manusia (hPTECs), dengan tahap pemuatan pewarna berkadar terus dengan pembukaan. Sel telah dibiakkan dalam glukosa rendah (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50 atau 100 nM) selama 48 jam. Danegaptide menghalang TGF 1-menimbulkan peningkatan dalam pengambilan pewarna carboxyflfluorescein dalam sel HK2 (panel (B)) dan hPTEC (panel (C)). Pemuatan pewarna minimum berlaku dalam sel kawalan, manakala pemuatan pewarna meningkat dengan ketara dalam sel yang dirawat dengan TGF 1. Penambahan danegaptide (50 atau 100 nM) mengurangkan pengambilan pewarna, mengembalikan intensiti pendarfluor FL kepada tahap kawalan. Intensiti dinyatakan sebagai peratusan berbanding dengan kawalan glukosa rendah dan mewakili 3 eksperimen berasingan. Data dibentangkan sebagai min ± SEM (n=3), dengan kepentingan utama ditunjukkan (** p < 0.01,="" ***="" p="">< 0.001;="" anova="" sehala="" dan="" ujian="" pasca="">
2.2. Danegaptide Menyekat TGF 1-Membangkitkan Perubahan dalam Pengambilan Pewarna Hemichannel-Mediated dalam Sel Epitelium TiubKami sebelum ini telah menunjukkan bahawa TGF 1 meningkatkan aktiviti hemik saluran pengantara Cx43-dan pembebasan ATP daripada sel epitelium tubul proksimal [24]. Ujian pengambilan pewarna carboxyflfluorescein digunakan untuk menentukan sama ada danegaptide boleh menafikan pengambilan pewarna teraruh TGF 1-melalui hemichannel dalam sel HK2 dan hPTEC primer. Seperti yang dijangkakan, TGF 1 (10 ng/mL) meningkatkan pengambilan pewarna kepada 354.9 ± 32.6 peratus kawalan dalam sel HK2, manakala inkubasi bersama dengan danegaptide (50 nM dan 100 nM) tumpul dengan ketara respons kepada 165.5 ± 17.9 peratus dan 147.6 ± 18.1 peratus masing-masing (Rajah 1B; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, n=4). Danegaptide sahaja tidak mengubah pengambilan pewarna. Pengambilan pewarna Carboxyflfluorescein telah meningkat oleh TGF 1 (10 ng/mL) dalam hPTEC primer (310.8 ± 38.6 peratus daripada kawalan), tindak balas yang sebahagiannya dinafikan oleh pengeraman bersama danegaptide (100 nM; 145 ± 19.7 peratus) berbanding dengan kawalan (Rajah 1C; p Kurang daripada atau sama dengan 0.01, n=4).
2.3. Danegaptide Menafikan TGF 1-Keluaran ATP Berantara Hemichannel Teraruh dalam Sel HK2Untuk menentukan sama ada danegaptida (5{{10}}–100 nM) boleh menghalang TGF 1 (10 ng/mL)- pembebasan terdorong ATP daripada hemichannel dalam sel HK2, kami menggunakan biosensing ATP [24,50]. TGF 1 (10 ng/mL) meningkatkan keluaran ATP daripada 0.33 ± 0.11 µM kepada 3.60 ± {{40} }.29 µM (Rajah 2A,B,E; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001), kesan yang dinafikan sebahagiannya oleh danegaptide pada kedua-dua 50 nM (1.90 ± 0.26 µM; p Kurang daripada atau sama dengan 0.01 ) dan 100 nM (0.79 ± 0.19 µM; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001) (Rajah 2D,E, n=3, enam ulangan/nombor sampel). Danegaptide sahaja tidak menjejaskan pelepasan ATP (Rajah 2C, E), dengan tahap ATP direkodkan pada 0.35 ± 0.10 µM (50 nM) dan 0.31 ± 0.09 µM (100 nM) berbanding kawalan (Rajah 2E).
2.4. Danegaptide Membalikkan TGF 1-Perubahan Teraruh dalam Protein Kitaran Sel dan Penanda Perlindungan Reno dalam hPTECUntuk menentukan sama ada danegaptide boleh menafikan peraturan pengantara hemichannel bagi kitaran sel biasa dan penanda pelindung reno, hPTEC telah diinkubasi dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) untuk 12 jam dan ekspresi mRNA gen calon dinilai melalui analisis qPCR. Penambahan danegaptide kepada TGF 1-hPTEC yang dirawat mengembalikan ekspresi p16 daripada 358.8 ± 21.1 peratus kepada 193 ± 18.5 peratus kawalan, ekspresi p21 daripada 221.8 ± 12.9 peratus kepada 142.2 ± 6.2 peratus daripada ± 2.2 peratus dan cyclin. peratus kepada 132.9 ± 15.0 peratus (Rajah 3; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, n=3). Selain itu, danegaptide membalikkan sebahagian penurunan Klotho daripada 43.3 ± 3.8 peratus kepada 59.9 ± 11.7 peratus kawalan (Rajah 3, n=3).
2.5. Danegaptide Memulihkan TGF 1-Perubahan Pengantaraan dalam Adheren dan Protein Persimpangan Ketat serta Kebolehtelapan Paraselular dalam hPTECDi dalambuah pinggangperekatan sel pengantara E-cadherin (ECAD) yang dikurangkan memulakan satu siri peristiwa yang memuncak dalam fenotip terputus-putus yang dikaitkan dengan transformasi epitelium-ke-mesenkim separa. Permulaan memudahkan pembongkaran kedua-dua penganut dan kompleks simpang ketat, yang memuncak dengan kehilangan lekatan, persimpangan jurang yang berkurangan komunikasi antara sel dan epithelia bocor [12,24,51]. Untuk menentukan sama ada danegaptide boleh menafikan TGF 1-perubahan pengantara dalam kepatuhan dan protein simpang ketat, hPTEC diinkubasi dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (10{{41 }} nM) selama 48 jam dan ekspresi protein calon dinilai. Danegaptide memulihkan sebahagian ekspresi E-cadherin daripada 33.3 ± 3.3 peratus kepada 89 ± 7.6 peratus kawalan, ekspresi N-cadherin (NCAD) daripada 224.4 ± 29.6 kepada 161.9 ± 27.4 peratus dan ekspresi vimentin daripada 213.3 ± 4.8 peratus Rajah 4A; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, p Kurang daripada atau sama dengan 0.01 dan p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, masing-masing; n {{43} }). Ekspresi -catenin kekal tidak diubah oleh penyekat hemichannel daripada 149.2 ± 11.2 peratus (TGF 1 sahaja) kepada 151.6 ± 16.8 peratus (TGF 1 ditambah danegaptide, Rajah 4B; p=NS, n=3). Penilaian kesan danegaptide pada protein simpang ketat mengesahkan bahawa modulator simpang jurang memulihkan sebahagian ungkapan claudin-2 daripada 44.5 ± 5 peratus kepada 74.6 ± 5 peratus kawalan dan ZO-1 daripada 27.8 ± 11.3 peratus kepada 52.8 ± 5.4 peratus berbanding dengan kawalan (Rajah 4B; p Kurang daripada atau sama dengan 0.05, n=3). Kajian yang mengkaji rintangan elektrik transepithelial mengesahkan bahawa pengurangan ekspresi protein simpang ketat yang dilihat dengan TGF 1 (10 ng/mL) adalah selari dengan kehilangan rintangan transepithelial daripada 57.33 ± 1.86 Ω·cm2 kepada 10 ± 1.53 Ω· cm2 (p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, n=3). Peningkatan kebocoran ini sebahagiannya diperbetulkan oleh pengeraman bersama dengan danegaptide (36 ± 2.08 Ω·cm2 ) (Rajah 4C; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, n=3).
2.6. Danegaptide Menghalang TGF 1-Menimbulkan Regulasi Protein Matriks Ekstraselular dalam hPTECdisebabkan oleh ketidakseimbangan antara pembentukan dan degradasi, pengumpulan ECM adalah ciri utama CKD. Peranan untuk TGF 1 dalam proses ini sudah mantap [52], dan memahami cara menafikan perubahan ini mempunyai implikasi yang jelas kepada perkembangan penyakit. Untuk mengkaji kesan danegaptide pada TGF 1-menimbulkan perubahan dalam ekspresi protein ECM, hPTEC dibiakkan dalam glukosa rendah (5 mM) selama 48 jam, serum-kebuluran semalaman dan dirawat dengan TGF 1 (1{{ 28}} ng/mL) ± danegaptide (100 nM) selama 48 jam. Berbanding dengan kawalan, TGF 1 meningkatkan ekspresi protein ECM kolagen I (334.6 ± 30.14 peratus), kolagen IV (354.5 ± 16.9 peratus), fibronektin (301.7 ± 50.4 peratus) dan laminin (324.8 ± 5A, 36.4 peratus). B; p Kurang daripada atau sama dengan 0.001, n=3). Inkubasi bersama dengan danegaptide melemahkan perubahan ini dengan ketara, memulihkan ekspresi kepada 180.7 ± 27.3 peratus (kolagen I), 164 ± 6.9 peratus (kolagen IV), 161.3 ± 4 peratus (fibronektin) dan 149 ± 20.4 peratus Les (laminin) daripada atau sama dengan 0.001; n=3 dalam setiap kes). Danegaptide (100 nM) juga mengurangkan perubahan TGF 1 (10 ng/mL) yang ditimbulkan dalam kinase integrin-linked 1 (ILK1) daripada 378.9 ± 16.8 peratus kepada 251.8 ± 33 peratus (p Kurang daripada atau sama dengan 0.001) tetapi mempunyai kesan yang minimum pada matriks metalloproteinase 3 (MMP3), mengurangkan ungkapan daripada 185.3 ± 19.6 peratus dengan sitokin sahaja kepada 147.1 ± 12.2 peratus apabila diinkubasi bersama dengan danegaptide (Rajah 5B)
2.7. Danegaptide Mengurangkan TGF 1-Membangkitkan Perubahan dalam Ekspresi Adipokines, Chemokines, Growth Factors dan Interleukins daripada hPTECs
Tindak balas keradangan di dalam dan di sekitar tubul proksimal melibatkan pengaktifan pelbagai jenis sel dan rembesan banyak penanda keradangan. Khususnya, kemokin larut, sitokin dan faktor pertumbuhan merekrut dan mengaktifkan sel imun yang menyusup dan merangsang fibroblas pemastautin. Pengaktifan berterusan sel-sel ini mengantara fibrosis tubulointerstitial. Kami menggunakan tatasusunan pemprofil proteom untuk menentukan sama ada danegaptide menafikan TGF 1-mengakibatkan perubahan dalam ekspresi dan rembesan pengantara proin-radang utama. Hotel utama telah dikultur, seperti yang diterangkan di atas, dan dirawat dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) selama 48 jam. Senarai perubahan dalam lisat (Rajah 6) dan supernatan (Rajah 7) disediakan untuk 31 protein calon yang dikumpulkan mengikut fungsi utama.
3. Perbincangan
Pada tahun 2017, kejadian CKD global adalah pada 697.5 juta kes, dengan keadaan itu dikenal pasti sebagai penyebab kematian ke-12 utama di seluruh dunia [53]. Sehingga kini, tiada pilihan terapi kuratif untuk peringkat akhirpenyakit buah pinggang(ESRD). Tambahan pula, dengan kadar survival dialisis yang rendah dan kekurangan globalbuah pinggangpenderma, terdapat keperluan mendesak untuk membangunkan terapi yang boleh menghalang perkembangan CKD dan meningkatkan kualiti hidup pesakit. Dalam CKD, keterukan keradangan dalam tubul proksimal menentukan seberapa cepat abuah pinggangakan gagal. Disebabkan oleh pengaktifan pelbagai jenis sel, nampaknya, sebahagiannya, melibatkan komunikasi sel-ke-sel pengantara yang disambungkan [9]. Connexins memudahkan komunikasi sel pengantara paracrine secara langsung dan tempatan melalui keupayaan mereka untuk oligomer menjadi sambungan heksamerik. Apabila sel-sel jiran diselaraskan, penghubung berlabuh untuk membentuk persimpangan celah [10]. Saluran berterusan ini menyediakan laluan terus untuk pemindahan maklumat, membenarkan sel untuk mengunci frekuensi tertentu dan menyegerakkan aktiviti. Berbeza dengan gap junctions, yang biasanya terbuka di bawah keadaan fisiologi, undocked connexons, juga disebut hemichannels, mempunyai kebarangkalian terbuka yang rendah dan terbuka sebagai tindak balas kepada kecederaan [10]. Aktiviti hemichannel yang diubah dikaitkan dengan patofisiologi pelbagai keadaan penyakit, dengan bukti yang menghubungkan komunikasi sel-ke-sel yang diubah kepada peningkatan penuaan [54], keradangan [34,55,56] dan fibrosis [18-21]. Data dari makmal kami sendiri menunjukkan bahawa isoform connexin yang dominan dalam tubul proksimal (Cx43) dikawal selia dalam CKD lanjutan dan berkorelasi dengan tahap TGF 1 yang tinggi dan keterukan fibrosis dan keradangan [24]. Lebih-lebih lagi, ungkapan yang diubah ini diterjemahkan kepada kehilangan komunikasi antara simpang jurang, yang disertai dengan peningkatan pelepasan ATP pengantara hemikhannel dan perubahan yang menunjukkan kecederaan tiub awal. Akibatnya, menyekat Cx43-pengantaraan keluaran ATP hemichannel mungkin mewakili sasaran yang berdaya maju untuk rawatan kerosakan peringkat akhir yang berlaku pada individu dengan CKD.
Danegaptide adalah peptida terapeutik kecil yang sehingga baru-baru ini telah digunakan dalam kapasitinya untuk memulihkan gandingan gap junction dalam pelbagai model kecederaan, termasuk iskemia [43,44] dan retinopati [49]. Danegaptide telah ditunjukkan untuk menyekat aktiviti hemichannel dan pengambilan pewarna dalam sel glioma C6 [43]; walau bagaimanapun, peranan kompaun dalam menyekat pembebasan ATP pengantara hemikhannel masih belum disahkan, dan belum ada kajian yang menilai kesan danegaptide pada kecederaan.buah pinggangtubulus. Dalam kajian semasa, kami membentangkan bukti yang meyakinkan bahawa danegaptide menyekat TGF 1-mengakibatkan pelepasan ATP pengantara hemikhannel dalam sel epitelium tubul proksimal manusia primer. Tambahan pula, kompaun TGF yang dipulihkan 1-menimbulkan perubahan dalam ekspresi dan rembesan protein yang dikaitkan dengan keradangan dan fibrosis. Dalam CKD, fibrosis tubulointerstitial berkembang sebagai tindak balas kepada pelbagai perubahan morfologi dan fenotip, termasuk peralihan epitelium-ke-mesenchymal (EMT), penyusupan sel radang, pengaktifan fibroblast dan pembentukan semula matriks ekstraselular (ECM) [57]. Bukti terkini menunjukkan bahawa penuaan selular mungkin memainkan peranan penting dalam perkembangan kronikpenyakit buah pinggang[58], dengan penuaan dikaitkan dengan EMT, rembesan pro-radang, dan pemendapan matriks ekstraselular [59-62]. Senescence menandakan penangkapan pertumbuhan proliferatif yang tidak dapat dipulihkan dengan perubahan yang berkaitan dalam organisasi kromatin, transkripsi gen dan rembesan protein [63,64]. Akibatnya, sel senescent diketahui menunjukkan peningkatan ekspresi perencat kinase (CDK) yang bergantung kepada siklik (CKI), termasuk p21Cip1 (p21) dan p16Ink4a (p16), dan ekspresi yang diubah Klotho pelindung reno [65-68]. Dalam kajian semasa, ekspresi mRNA perencat CDK p16, p21 dan cyclin D1 telah meningkat dengan ketara dalam sel epitelium tiub yang dirawat 1-TGF, manakala protein anti-penuaan reno-pelindung Klotho menunjukkan ekspresi yang berkurangan berbanding dengan kawalan. Menariknya, ekspresi p16, p21 dan cyclin D1 telah diperbaiki apabila sel diinkubasi bersama dengan danegaptide. Kepentingan pemerhatian ini disokong oleh banyak kajian in vivo [69,70], termasuk kerja baru-baru ini dalam model tetikus p16 INK4a double-knockout. Apabila diinduksi dengan UUO untuk mempamerkan keradangan interstisial dan fibrosis lanjutan, tikus ini mempamerkan penurunan apoptosis, penuaan, tahap isyarat TGF 1/Smad yang berkurangan dan pengurangan penyusupan sel radang berbanding haiwan jenis liar [70]. Selain itu, sel tubul proksimal yang diasingkan daripada model UUO menunjukkan peningkatan tahap p21, penindasan yang selari dengan pengurangan penanda yang biasanya dikaitkan dengan EMT [71,72]. Pautan langsung kepada penuaan sel dan induksi EMT telah pun ditubuhkan [73].
Kehilangan lekatan sel pengantara E-cadherin adalah pencetus permulaan EMT, dengan peningkatan serentak dalam N-cadherin (suis cadherin), disertai dengan pembongkaran persimpangan adheren dan pemerolehan protein yang biasanya dikaitkan dengan fenotip fibroblast, cth. , vimentin dan protein khusus fibroblast [74]. Di dalambuah pinggang, memang terbukti bahawa kecederaan tiub membangkitkan beberapa perubahan morfologi dan fenotip ciri EMT separa, jika tidak penuh. Kajian terbaru kami menunjukkan bahawa glukosa membangkitkan perubahan dalam TGF 1 menengahi pembongkaran bahan penganut dan kompleks simpang ketat dengan mengawal selia perubahan dalam pematuhan (ECAD, NCAD, -catenin) dan ekspresi protein simpang ketat (ZO-1). Selain itu, pentadbiran in vitro ATP yang tidak boleh dihidrolisiskan merendahkan ekspresi E-cadherin dalam proksimalbuah pinggangsel-sel, kehilangannya adalah selari dengan pengurangan daya pengikatan antara sel, penurunan kejadian pecah tether dan pembentukan semula sitoskeletal [51]. Ditengahkan oleh P2X7R, kesannya telah diterbalikkan dalam model Cx43 plus /- UUO heterogen [12]. Berdasarkan penemuan ini, keberkesanan danegaptide menggariskan peranan perlindungan untuk menyekat pembebasan ATP pengantara hemikhannel dalam menghalang ekspresi diubah epitelium utama (ECAD, -catenin, ZO-1, claudin 2) dan mesenchymal (NCAD, vimentin) protein, implikasinya adalah kepentingan terapeutik.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Persimpangan adherens berkumpul apabila ekor sitoplasma E-cadherin mengikat -catenin, mengantarkan lampiran pada rangkaian sitoskeletal dan memastikan kekutuban dan seni bina sel dikekalkan [75]. Walaupun peranannya dalam mengekalkan kekutuban sel, pembongkaran simpang ini membolehkan pembebasan -catenin ke dalam sitosol, yang apabila diaktifkan oleh sama ada protein Wnt atau pengawal selia hulu lain, contohnya, kinase berkaitan integrin (ILK), boleh translokasi ke dalam nukleus. dan mengawal selia kesan khusus sel. Integrin-linked kinase ialah kinase serine/threonine-protein intraselular yang memainkan peranan asas dalam pengawalseliaan lekatan sel, survival, percambahan dan pemendapan matriks ekstraselular (ECM) [76]. Yang penting, perencatan ILK melemahkanbuah pinggangfibrosis dalam pelbagai model CKD [77]. Dalam kajian semasa, TGF 1-kenaikan peningkatan dalam ekspresi ILK1, sebahagiannya, dipulihkan apabila sel diinkubasi bersama dengan danegaptide, kesan yang selari dengan penurunan dalam ekspresi -catenin dan protein berkaitan ECM. Menariknya, walaupun danegaptide gagal mengubah dengan ketara TGF 1-peningkatan yang disebabkan oleh -catenin, adalah penting untuk ambil perhatian bahawa ketiadaan perubahan dalam ekspresi tidak menggambarkan ketiadaan fungsinya dalam sel. Laluan Wnt kanonik melibatkan translokasi nuklear -catenin dan pengaktifan gen sasaran melalui sekumpulan faktor transkripsi yang dipanggil faktor sel T/faktor penambah limfoid (TCF/LEF) [78]. Biasanya, isyarat Wnt/ -catenin adalah senyap, tetapi ia diaktifkan semula selepas kecederaan dalam beberapa model kronik yang berbeza.penyakit buah pinggang[79,80]. Selain itu, isyarat Wnt/ -catenin yang menyimpang sangat dikaitkan dengan permulaan penuaan, kesan yang selari dengan kehilangan ekspresi Klotho, protein anti-penuaan yang bertindak sebagai pengawal selia negatif laluan Wnt kanonik [81], dan dalam kajian semasa telah dikurangkan dalam sel yang dirawat TGF 1- (Rajah 3). Akibatnya, pengaktifan berterusan isyarat Wnt/ -catenin dikaitkan dengan perkembangan fibrosis dalam kedua-duabuah pinggangdan jenis tisu lain [79,82,83]. Setelah dialihkan ke dalam nukleus, -catenin dikaitkan dengan peningkatan ekspresi faktor transkripsi SNAIL dan matriks metalloproteinase MMP7. Menariknya, peristiwa ini dikaitkan dengan penindasan transkrip dan pelepasan membran domain ekstraselular E-cadherin, yang terakhir menyaksikan peningkatan dalam kumpulan sitoplasma bebas -catenin [84]. Sehubungan itu, isyarat Wnt adalah pengaktif utama EMT dalam keadaan kecederaan [85]. Selain itu, dengan bukti bahawa isyarat Wnt/ -catenin menggalakkan ekspresi banyak gen, termasuk fibronektin, FSP1, Snail1, MMP7 dan cyclin D1, tidaklah menghairankan bahawa pengecilan lata isyarat ini dikaitkan dengan peningkatanfungsi buah pinggang, mengurangkan EMT [86] dan mengurangkan keradangan [87] dan fibrosis [80,88]. Akibatnya, sebahagiannya boleh menyumbang kepada TGF 1-yang mendorong peningkatan ekspresi dan rembesan protein matriks ekstraselular (Rajah 5), sitokin proinflamasi dan kemokin yang diperhatikan dalam kajian ini (Rajah 6 dan 7). Peningkatan pemendapan ECM dan rembesan molekul proinflamasi adalah ciri fibrosis tubulointerstitial, dengan jenis sel yang berbeza, termasukbuah pinggangsel epitelium tiub diketahui merembeskan sejumlah besar faktor yang secara kolektif ditakrifkan sebagai fenotip rembesan berkaitan CKD (CASP). Dicirikan oleh banyak molekul, termasuk interleukin, protein matriks ekstraselular dan kemokin, CASP ini menunjukkan persamaan yang ketara dengan fenotip rembesan yang berkaitan dengan penuaan (SASP), dengan komponen CASP telah dikaitkan dengan patologi fibrosis tubulointerstitial [89]. Apabila dilepaskan, faktor pro-radang ini bertindak ke atas sel-sel sihat yang berdekatan dengan cara paracrine, dengan itu memacu perkembangan fibrosis dalam CKD. Oleh kerana banyak faktor yang berkaitan dengan CASP diketahui menyebabkan fibrosis dalambuah pinggang(cth, TGF , interleukin (IL)-1 dan interleukin (IL)-6), menyasarkan hulu perantara isyarat radang ini mungkin membuktikan strategi alternatif yang berkesan untuk rawatan CKD. Menggunakan tatasusunan profil proteom, supernatan sel daripada sel yang dirawat TGF 1±danegaptide telah diinkubasi pada membran sel yang diserap dengan antibodi yang dinaikkan terhadap protein keradangan utama. Seperti yang diserlahkan dalam Rajah 6 dan 7, inkubasi bersama sel dengan TGF 1 dan danegaptide memulihkan ekspresi dan rembesan beberapa protein calon yang berperanan dalampenyakit buah pinggangsudah terbukti sama ada memudaratkan (faktor nekrosis tumor-alfa, interleukin 1-alfa, interferon-gamma) atau pelindung (faktor pertumbuhan hepatosit). Selain itu, dalam CKD, kemokin larut, molekul lekatan dan faktor pertumbuhan merekrut dan mengaktifkan sel imun yang menyusup dan fibroblas pemastautin untuk mengantara keradangan dan fibrosis pada yang cedera.buah pinggang. Data tatasusunan kami mengesahkan bahawa memodulasi Cx43 dan menyekat pembebasan ATP pengantara hemichannel dalam sel epitelium tiub menafikan, sama ada sebahagian atau sepenuhnya, rembesan banyak mediator keradangan, termasuk kemokin, protein penarik kemosit monosit (MCP1) dan Dikawal pada Pengaktifan, Normal T Cell Expressed and Secreted (RANTES), kedua-duanya terlibat dalam pengambilan monosit. Ditingkatkan dalam kedua-dua manusia dan eksperimenpenyakit buah pinggang, rembesan MCP1 dicetuskan oleh interleukin-1, tumor necrosis factor-alpha [90] dan interferon-gamma [91], yang kesemuanya telah diinduksi dalam model kami oleh TGF 1, namun disekat apabila digunakan bersama dengan danegaptide. Selain itu, danegaptide juga diperhatikan untuk menghalang rembesan TGF 1-yang disebabkan oleh molekul perekatan sel antara sel (ICAM1) [92], faktor perangsang koloni granulosit-makrofaj (GM-CSF) [93] dan peptida pengaktifan epitelium-neutrofil. (ENA78) [94]. Secara kolektif, ini telah dikaitkan dengan perkembangan CKD dan dengan protein patogen utama lain, termasuk dipeptidyl peptidase 4 (DPPIV) [95] dan faktor pertumbuhan endothelial vaskular (VEGF) [96], dan telah dikenal pasti sebagai sasaran terapeutik yang berpotensi. Walaupun pemerhatian ini, analisis tatasusunan mengenal pasti beberapa protein pada 48 jam, di mana peraturan teraruh TGF 1- kelihatan bebas daripada pelepasan ATP pengantara hemikhannel. Seperti yang dibuktikan oleh ungkapan ligan FLT3 dalam lisat sel, danegaptide gagal mengubah dengan ketara TGF 1-perubahan yang disebabkan oleh ekspresi seluruh sel. Ligan FLT3 pada mulanya disintesis sebagai protein terikat membran, yang mesti dibelah untuk menjadi faktor pertumbuhan larut. Dalam sel yang dirawat TGF 1-, peningkatan dalam FLT3L terikat membran telah diperhatikan berbanding dengan kawalan dalam lisat sel, tindak balas yang tidak terjejas apabila sel diinkubasi bersama dengan danegaptide. Walaupun sedikit diketahui tentang enzim yang terlibat dalam pembelahan proteolitik dan pembebasan FLT3L, kajian oleh Horiuchi et al. menunjukkan bahawa penumpahan FLT3L dan pelepasan daripada membran adalah bergantung kepada metalloprotease dan bahawa kesan dalam fibroblas ini bergantung kepada enzim penukar TNF (TACE) [97]. Walaupun kita hanya boleh membuat spekulasi, ada kemungkinan bahawa menyekat Cx43-pelepasan ATP pengantara boleh menumpulkan aktiviti protein yang diperlukan untuk penumpahan membran FLT3 dan, dengan itu, jika tiada pelepasan FLT3L, paras FLT3L dalam supernatan adalah kurang ketara dalam sel TGF 1 ditambah danegaptide yang dirawat berbanding dengan kawalan yang dirawat TGF 1-. Menariknya, walaupun danegaptide nampaknya tidak membalikkan peningkatan TGF 1-yang disebabkan oleh lisat sel FLT3L, ia mempunyai kesan ke atas bentuk protein yang dirembeskan.
Reseptor larut untuk produk akhir Glycation Lanjutan (RAGE) adalah biomarker berpotensi keradangan dan tekanan oksidatif [98]. Ia bertindak sebagai reseptor umpan yang menghalang produk akhir glikasi lanjutan daripada mengikat kepada RAGE terikat membran dan kesan buruk berkaitan RAGE. Dalam kajian semasa, kami melihat peningkatan 70 peratus dalam rembesan sRAGE dengan TGF 1, kesan yang dipulihkan kepada kawalan oleh danegaptide. sRAGE berfungsi dan mampu menimbulkan kesan apabila dirembeskan. Potensi danegaptida untuk menafikan dengan ketara rembesan ini adalah kepentingan terapeutik yang jelas. Menariknya, bagaimanapun, kami tidak melihat peningkatan dalam RAGE lysate pada 48 jam dengan TGF 1 ± danegaptide. Walaupun eksperimen ini telah dilakukan dalam sel tubul proksimal utama manusia, batasan model kami mungkin mempunyai kesan bergantung kepada sel, masa dan kepekatan. Akibatnya, sementara pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme tindakan danegaptide diperlukan, penemuan daripada kajian ini memberikan bukti awal yang penting tentang faedah menggunakan danegaptide untuk menafikan perubahan yang disebabkan oleh TGF 1-dalam penanda keradangan dan kecederaan tiub melalui sekatan pembebasan ATP pengantara hemichannel. Kami mengakui bahawa data in vitro kami menyediakan model minimalis peristiwa multifaktorial yang menimbulkan fibrosis tubulointerstitial, dan mengesyorkan berhati-hati dalam menterjemah penemuan novel ini kepada situasi in vivo, terutamanya apabila kajian ke atas spesies dan model kecederaan lain telah menunjukkan kesan berubah-ubah. [41,44,46–49]. Kajian lanjut kini diperlukan untuk menentukan selektiviti hemikhannel ini dan keupayaan ubat dalam model praklinikal kerosakan kronik, sebelum menguji keberkesanan dalam ujian klinikal manusia.
4. Bahan dan Kaedah
4.1. Bahan
Manusia klonalbuah pinggang2 (HK2) sel epitelium dan sel epitelium tubul proksimal manusia primer (hPTECs) telah dibeli daripada American Type Culture Collection (ATCC)(LGC Standards). Bekalan kultur tisu telah dibeli daripada Invitrogen (Paisley, UK). Membran PVDF Immobilon-FL adalah dari Millipore (Watford, UK), dan penimbal penyekat Odyssey dan antibodi pendarfluor FL sekunder dibeli dari LI-COR (Cambridge, UK). Antibodi untuk E-cadherin, N-cadherin, ILK1, MMP-3, -catenin, vimentin dan ZO-1 diperoleh daripada Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, UK), manakala claudin-2, antibodi laminin, kolagen I, dan kolagen IV diperoleh daripada ABCAM (Cambridge, UK). Antibodi fibronektin dibeli dari Santa Cruz (Santa Cruz, CA, Amerika Syarikat). HTGF 1 rekombinan diperolehi daripada Sigma (Poole, UK), seperti juga semua bahan kimia am yang lain. Danegaptide disediakan oleh Zealand Pharmaceuticals. Biosensor ATP adalah daripada Sarissa Biomedical Ltd. (Coventry, UK) dan hidangan tepung daripada WPI (Hertfordshire, UK). Penapis Transwell telah dibeli dari Corning (Nottinghamshire, UK). Kit Tatasusunan Sitokin Manusia Proteome Profiler adalah daripada Sistem R&D (Oxfordshire, UK).
4.2. Kultur Tisu
Sel epitelium tubul proksimal manusia utama (hPTECs) dikekalkan dalam abuah pinggangmedium basal sel epitelium daripada ATCC, ditambah dengan 0.5 peratus serum anak lembu janin (FCS wt/vol, triiodothyronine (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), hydrocortisone hemisuccinate (100 ng/mL), rhInsulin (5 µg/mL), epinefrin (1 µM), transferin (5 µg/mL) dan L-alanyl-glutamin (2.4 mM), dalam suasana lembap pada 37 ◦C dengan 5 peratus CO2. Sel-sel tertakluk kepada semalaman kebuluran serum sebelum rawatan.Manusiabuah pinggang2 (HK2) sel (petikan 18–30) telah ditanam dalam medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Hams F12, ditambah dengan 10 peratus FCS wt/vol, glutamin (2 mmol/L) dan faktor pertumbuhan epitelium (EGF) ( 5 ng/mL), dalam suasana lembap pada 37 ◦C dengan 5 peratus CO2. Sel HK2 telah diabadikan oleh transduksi gen human papillomavirus 16 (HPV-16) E6/E7 dan bebas mikoplasma. Dalam semua eksperimen, sel telah disemai dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mmol/L) selama 48 jam dan kemudian serum-kebuluran semalaman sebelum rawatan.
4.3. Ujian MTT Ujian 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) telah dilakukan, seperti yang diterangkan sebelum ini, untuk menilai kesan sitotoksik danegaptide pada percambahan sel [99]. Sel HK2 telah disemai dalam 96-plat perigi dan dikultur dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mM) selama 48 jam, sebelum kebuluran serum semalaman, dan kemudiannya dirangsang selama 48 jam dengan TGF 1 (10 ng/mL ) ± danegaptide (50–1000 nM). Pengukuran kolorimetrik pengeluaran formazan sepadan dengan bilangan sel yang berdaya maju.
4.4. Ujian Dehidrogenase LaktatPembebasan laktat dehidrogenase (LDH) ke dalam media akibat kerosakan membran plasma biasanya digunakan untuk menilai kematian sel atau sitotoksisiti. Sel HK2 telah disemai dalam 96-plat perigi dan dikultur dalam DMEM/F12 (5 mM) rendah glukosa selama 48 jam sebelum kebuluran serum semalaman. Sel kemudiannya dirangsang selama 48 jam dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50-1000 nM). Kit ujian sitotoksisiti LDH II (Abcam) digunakan untuk mengukur LDH mengikut arahan pengilang.
4.5. Ujian Crystal VioletUjian mudah ini digunakan untuk mengukur ketumpatan relatif sel yang melekat pada hidangan berbilang perigi. Violet kristal mengotorkan DNA dan boleh dikira secara kolorimetrik selepas pelarutan. Sel HK2 telah disemai dalam 12-plat perigi dan dikultur dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mM) selama 48 jam, sebelum kebuluran serum semalaman, dan kemudiannya dirangsang selama 48 jam dengan TGF 1 (1{{16 }} ng/mL) ± danegaptide (50–1000 nM). Ujian telah diterangkan sebelum ini [99]. Secara ringkas, sel telah ditetapkan menggunakan paraformaldehid selama 10 minit, dibasuh dengan garam penampan fosfat (PBS) dan diinkubasi selama 10 minit pada suhu bilik (RT) dalam larutan kristal ungu 0.1 peratus. Selepas beberapa kali cucian lagi, noda telah dilarutkan menggunakan 1 peratus SDS, dan penyerapan diukur oleh pembaca plat.
4.6. Western BlottingPenyediaan protein sitosol dari sel HK2 dan hPTEC, pemisahannya oleh elektroforesis gel SDS dan pemindahan ke membran PVDF Immobilon-FL telah diterangkan sebelum ini [12]. Membran disekat menggunakan penimbal penyekat Odyssey (LI-COR) dan kemudian disiasat semalaman dengan antibodi terhadap E-cadherin (1:1000), N-cadherin (1:1000), claudin-2 (1:500), ZO -1 (1:1000), kolagen I (1:1000), kolagen IV (1:2000), fibronektin (1:2000), laminin (1:500), ILK1 (1:500), -catenin (1:2000), vimentin (1:500) dan MMP3 (1:500). Band telah divisualisasikan menggunakan OdysseyFC dan separuh kuantitatif menggunakan ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, USA).
4.7. Rintangan TransepithelialSel HK2 telah disemai (6 × 104sel/mL) pada penapis Transwell (diameter 12 mm, saiz liang 0.4 µM; Corning, NY, USA) dan dikultur dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mM) untuk 48 jam, kebuluran serum semalaman dan seterusnya dirangsang dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) selama 48 jam. Rintangan elektrik transepithelial (TER) diukur menggunakan radas EVOM (Instrumen Ketepatan Dunia, Sarasota, FL, Amerika Syarikat). Rintangan kosong yang diukur dari perigi dengan medium sahaja telah ditolak daripada setiap bacaan rintangan.
4.8. Kajian Pengambilan PewarnaSel HK2 dan hPTEC telah disemai pada fluorodishes (diameter 22 mm) dan dibiakkan dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mmol/L) selama 48 jam. Selepas kebuluran serum semalaman, sel diinkubasi dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50–100 nM) selama 48 jam. Untuk langkah seterusnya, larutan garam seimbang (BSS, pH 7.0) terdiri daripada NaCl (137 mM), KCl (5.4 mM), MgSO4 (0.8 mM), Na2HPO4 (0.3 mM), KH2PO4 (0.4 mM), NaHCO3 (4.2 mM). ), HEPES (10 mM) dan glukosa (5 mM) telah digunakan. Untuk mendorong pengambilan pewarna, sel-sel telah terdedah kepada Ca2 plus -free BSS (sifar CaCl2 plus EGTA (1 mM)) ditambah carboxyflfluorescein (200 µM) selama 10 minit, diikuti dengan tempoh 5 minit dalam Ca2 plus -mengandungi BSS (1.3 mM) ditambah carboxyflfluorescein (200 µM). Pinggan mangkuk kemudiannya dibasuh dengan Ca2 plus -mengandungi BSS (12 mL). Imej diperoleh dengan kamera CCD Cool Snap HQ (Roper Scientific, Göttingen, Jerman) dan perisian Metamorph (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, UK). ImageJ digunakan untuk mengukur pengambilan pewarna, di mana kawasan minat (ROI) dilukis di sekeliling setiap sel (lebih kurang 10–15 sel/hidangan) dan keamatan piksel min diukur. Nilai pendarfluor latar belakang telah ditolak daripada setiap ROI.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
4.9. ATP BiosensingBiosensor ATP (Sarissa Biomedical, Coventry, UK) digunakan dalam persediaan amperometri dwi-rakaman serentak, seperti yang diterangkan sebelum ini [12]. Biosensor nol telah digunakan untuk mengambil kira artifak elektro-aktif bukan spesifik dan ditolak daripada surih ATP. Gliserol (2 mM) dimasukkan dalam semua penyelesaian rakaman untuk membolehkan pengesanan ATP. Sel HK2 telah disemai pada penutup kaca (diameter 10 mm) dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mmol/L) selama 48 jam sebelum kebuluran serum semalaman. Sel-sel tersebut kemudiannya diinkubasi dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) selama 48 jam. Slip penutup dipindahkan ke ruang yang mengandungi Ca2 plus -mengandungi BSS yang diresapi pada 6 mL/min (37 ◦C) dan dibiarkan selama 10 minit untuk menyesuaikan diri. ATP dan biosensor nol dibengkokkan dan diturunkan supaya elektrod terletak selari dengan monolayer selular. Sebaik sahaja garis dasar yang stabil berlaku, perfusi BSS tanpa Ca2 ditambah merangsang pembukaan hemik saluran. Selepas pembebasan ATP, Ca2 plus -mengandungi BSS digunakan untuk menutup hemik saluran, diikuti dengan penyelesaian penentukuran ATP (10 mM). Rakaman diperoleh pada 4 Hz dengan antara muka Micro CED (Mark2) menggunakan perisian Spike (v8.03).
4.10. Susunan Antibodi Keradangan,Susunan antibodi keradangan (Sistem RnD) menilai TGF 1-regulasi yang disebabkan oleh 31 penanda keradangan. Tatasusunan dilakukan dengan mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, hPTEC dibiakkan dalam DMEM/F12 rendah glukosa (5 mM) selama 48 jam, sebelum kebuluran serum semalaman, dan kemudian dirangsang selama 48 jam dengan TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM). Lisat dan supernatan sel dikumpul dan diinkubasi semalaman dengan membran pra-sekat yang dilihat dalam pendua dengan antibodi tangkapan. Campuran koktel pendarfluor streptavidin/biotinilasi 800 CW FL digunakan untuk menggambarkan kompleks protein/antibodi ekspresi dengan menggunakan Odyssey FC dan dikira separuh menggunakan ImageStudio (v5.2, LI-COR).
4.11. PCR Masa Nyata KuantitatifRNA diekstrak menggunakan kit mini RNeasy (QIAGEN) dan transkripsi terbalik (Invitrogen). PCR masa nyata (SYBR GreenER, Invitrogen) dilakukan menggunakan instrumen StepOne Plus (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). Ekspresi cDNA diperoleh dengan membandingkan dengan lengkung standard cDNA yang dicairkan secara bersiri. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) dan GAPDH (ke hadapan: GTCTC CCTTGACTTCAACAGCG, terbalik: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). Analisis lengkung cair mengesahkan kekhususan primer dan menyemak kemungkinan pencemaran.
4.12. AnalisisUntuk semua eksperimen, kawalan rendah glukosa (5 mM) telah dinormalkan kepada 100 peratus , dan semua keadaan lain dibandingkan dengan kawalan masing-masing. Analisis statistik dilakukan menggunakan ujian ANOVA sehala dengan ujian pasca perbandingan berganda Tukey. Data dinyatakan sebagai min ± SEM, dengan n menandakan nombor sampel. Nilai-p Kurang daripada atau sama dengan 0.05 menandakan kepentingan statistik.
