Analisis Komposisi Dan Aktiviti Imunologi Oligosakarida Diasingkan Daripada Cistanche Deserticola

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Abstrak.Oligosakarida (CDOS) diperoleh daripadaCistanche deserticolamelalui pengekstrakan alkali (pH{{0}}), pemendakan etanol, dan dipecahkan kepada dua pecahan tulen (iaitu, CDOS-1 dan CDOS-2)oleh Sephadex G-100 dan kromatografi penapisan lajur Sephadex G-25. Komposisi monosakarida CDOS telah diuji oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC). Didapati bahawa CDOS-1 hanya terdiri daripada sukrosa dan CDOS-2 terutamanya terdiri daripada sukrosa, rhamnose dan manitol, dengan nisbah mol 1:0.73:3.61. Ujian imunologi menunjukkan bahawa CDOS memberikan kesan ketara pada indeks limpa tikus, meningkatkan aktiviti fagositosis makrofaj dan merangsang percambahan sel penghasil antibodi. Diharapkan CDOS akan dibangunkan menjadi makanan berfungsi atau perubatan.

Kata kunci:Cistanchedeserticola, oligosakarida, penulenan, komposisi, aktiviti imunologi.

Cistanche deserticola mempunyai banyak kesan, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Cistanchedeserticola YCMa. (Family Orobanchaceae) ialah tumbuhan parasit pendek yang berasal dari barat laut China. Keseluruhan tumbuhan kering (tanpa bunga) dikenali sebagai tonik dan dipanggil "Rou Congrong". Dalam perubatan oriental, ia dikelaskan sebagai rasa manis dan masin, sifatnya hangat, dan bercirikan saluran buah pinggang dan usus besar, dengan fungsi daripadamenyegarkanyangbuah pinggangdan pati pelengkap, melembapkan usus, dan melegakan usus [1]-[3]. Kajian farmakologi moden menunjukkan bahawa ia boleh mendorong sintesis DNA dan melambatkan proses nyanyuk, meningkatkan antioksida [4] , mencegah dan merawat penyakit kardiovaskular [3]. Selain itu, ia juga boleh menyebabkan analgesik dananti-radangkesan [5], meningkatkan pembelajaran dan ingatan dengan mendorong faktor pertumbuhan saraf [6]. Beberapa kajian menunjukkan bahawa ekstrak C. deserticola boleh mengaktifkan fungsi fagositik makrofaj intra-perut pada tikus [7]-[9] danmempertingkatkanbadan's imuniti[10]. Menurut kajian terdahulu, tumbuhan ini mengandungi berbilang juzuk aktif termasuk glikosida phenylethanoid, iridoid, lignan, sakarida, alkaloid, dll. [11] Sebagai C.deserticolaphenylethanoidglikosidadan polisakarida diiktiraf sebagai komponen aktif utama, banyak kajian telah menumpukan pada struktur dan bioaktiviti mereka sepanjang dekad yang lalu [12]-[17]. Bagi oligosakarida yang berharga dalamC. deserticola, laporan agak terhad. Oligosakarida, sakarida rantai pendek yang mengandungi gula homo atau hetero, terkenal kerana kesannya yang bermanfaat terhadap kehidupan manusia dan telah digunakan secara meluas untuk masa yang lama [18]. Oligosakarida berfungsi, yang mempunyai fungsi fisiologi seperti kariogenisiti rendah dan faktor pertumbuhan bifidobakteria [19], meningkatkan kesihatan manusia dan haiwan. Mereka telah digunakan sebagai bahan makanan. Baru-baru ini, fungsi baru oligosakarida, yang mempunyai keupayaan untuk memodulasi sistem imun pada manusia, haiwan, dan ikan, telah dilaporkan [20]. Dalam kertas ini, kami melaporkan bahagian pertama hasil program penyelidikan, pecahan. daripada jumlah oligosakarida yang diperoleh daripada ekstrak alkali C. deserticola dengan gabungan ultrafiltrasi dan kromatografi resapan gel, dan analisis komposisinya oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC). Di samping itu, kami juga membentangkan aktiviti imunologi C. deserticola oligosaccharides. Untuk pengetahuan kami, terdapat beberapa laporan yang diterbitkan mengenai kajian aktiviti imunostimulasiC. deserticolaoligosakarida.

2. Eksperimen

2.1. Bahan

C. deserticola ditanam dan dikumpulkan dari Liga Alxa (Inner Mongolia, China). Tikus Kunming (GradeII, enam minggu) telah dibeli dari Pusat Eksperimen Farmakologi Universiti Mongolia Dalam. Sephadex G-100,Sephadex G-25, asid trifluoroacetik (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolon(PMP), D-glukosa, D- galaktosa, D-fruktosa, D-xylose, D-mannose, D-galakturonik asid, D- asid glukuronik, sukrosa, rhamnose, manitol, fucose, rhamnose, dibeli dari Sigma (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). RPMI Sederhana-1640 telah dibeli daripada Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, Amerika Syarikat). Semua bahan kimia lain adalah gred analitik.

2.2. Pengekstrakan oligosakarida

Badan kering C. deserticola dipotong menjadi kepingan yang lebih kecil dan dikisar lagi menjadi serbuk oleh kilang diekstrak dengan etanol kontang (3×5000 ml) pada 70 darjah selama 3 jam di bawah tekanan atmosfera. Pemeluwap refluks telah ditetapkan untuk mengeluarkan lipid. Sisa yang tinggal kemudian diekstrak dengan alkali (pH=10) pada 60 darjah selama 3 kali (2j setiap kali). Selepas sentrifugasi (2000 g selama 15 minit, pada 20 darjah ), supernatan itu tertumpu kepada satu persepuluh isipadu dalam penyejat berputar di bawah tekanan berkurangan pada 50 darjah dan ditapis. Kemudian turasan dinyahprotein menggunakan reagen Sevag [21], dan dinyahwarna dengan karbon teraktif.

2.3. Pengasingan dan penulenan oligosakarida

Oligosakarida mentah kering beku telah dilarutkan dalam air suling, disentrifugasi, dan kemudian supernatan itu ditulenkan oleh lajur Sephadex G-100 (1×50 cm), diseimbangkan dengan air ultratulen. Selepas memuatkan dengan sampel, lajur dielusi dengan air ultratulen pada kadar aliran 5 ml/min. Pecahan yang berbeza dikumpul menggunakan tabung uji. Jumlah kandungan karbohidrat setiap tiub diukur pada 490nm dengan kaedah fenol-H2SO4 [22]. Penyelesaian air yang dicairkan telah diasingkan kepada dua pecahan CDOS-1 dan CDO-2. Dua pecahan masing-masing disucikan lagi pada lajur Sephadex G-25 (2.7×85 cm) dengan menggunakan air ultratulen (pada kadar aliran 1 ml/min). Selepas mengumpul pecahan yang telah disucikan, ia telah diliofilkan.

2.4. Analisis komposisi monosakarida

Komposisi monosakarida CDO dicapai dengan analisis HPLC. CDO (2 mg) telah dihidrolisiskan dahulu dengan metanol kontang yang mengandungi 2 M HCl pada 8{18}} darjah selama 16 jam di bawah atmosfera nitrogen dan kemudian dengan 2 M TFA pada 120 darjah selama 1 jam. Selepas TFA dikeluarkan melalui penyejatan, hidrolisat kemudiannya diterbitkan dengan PMP mengikut kaedah yang dilaporkan [23] dan dianalisis oleh HPLC. Pemisahan HPLC telah dilakukan pada sistem EF-2002 HPLC (syarikat KNAUER, Jerman). Derivatif PMP dikromatografi menggunakan isipadu Gula-PAK (6.5×300mm, gelas syarikat air, Amerika), dan penyerapan diukur pada 245 nm. Isipadu suntikan ialah 20µL, dan fasa bergerak, terdiri daripada PBS (pelarut A) dan asetonitril (pelarut B), digunakan untuk elusi isokratik pada nisbah isipadu 82 peratus (A) hingga 18 peratus (B). Jumlah masa larian HPLC ialah 40 minit, dan kadar aliran ialah 0.5 mL/min.

2.5. Aktiviti Imunobiologi

2.5.1. Fungsi fagositik monosit-makrofaj

Enam puluh tikus Kunming (GradeII, enam minggu) telah dibeli dari Pusat Eksperimen Farmakologi Universiti Mongolia Dalam dan telah disesuaikan selama 1 minggu sebelum digunakan. Semua tikus dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan, terdiri daripada kumpulan kawalan salin, kumpulan dos CDO tinggi, kumpulan dos sederhana, dan kumpulan dos CDO rendah. Tikus telah disuntik secara intraperitoneal dengan 0.5mL larutan oligosakarida sekali sehari selama 5 hari. Kumpulan dos CDO tinggi, sederhana atau rendah masing-masing menerima 10{{10}}, 50 atau 25 mg/kg/BW CDO; dan 0.5ml saline disuntik dalam kumpulan kawalan. Pada hari ketujuh eksperimen pelepasan zarah karbon telah dijalankan, menurut Hou [24], dan indeks limpa dan indeks timus diukur. Secara ringkas, dakwat India 0.05 mL/10 g/bw disuntik ke dalam setiap tetikus melalui vena caudalis, kemudian 20μL darah diperolehi daripada vena orbitalis posterior 3 dan 7 minit selepas suntikan. Sampel darah diletakkan di dalam tiub dengan 2mL 0.1 peratus Na2CO3, dan nilai OD diukur pada 600 nm. Indeks pelepasan (K), indeks fagositik ( ), dan indeks organ imun dikira seperti berikut (1), t2 dan t1 masing-masing bermakna 7 minit dan 3 minit.

2.5.2. Pembiakan sel penghasil antibodi

Kumpulan tikus Kunming (lima setiap kumpulan) telah diimunisasi dengan suntikan intraperitoneal 2 x 107 SRBC dalam 1.0 ml PBS ditambah dengan 50ug bahan ujian (tiada dalam kawalan). Seminggu kemudian, splenosit (106 sel setiap 2 ml setiap telaga) daripada tikus Kunming telah dibiakkan dengan atau tanpa bahan ujian selama 72 jam dalam 10 peratus RPMI 1640 medium di bawah 5 peratus CO2 di udara, dalam tiga kali ganda untuk setiap budaya. Bilangan PFC terhadap SRBC setiap 106 splenosit telah ditentukan [25], [26].

2.6. Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai nilai min ±SD. Perbezaan antara kumpulan yang diuji dan kawalan telah dianalisis dengan ujian-t Pelajar. P < 0.05="" dianggap="">

3. Keputusan dan perbincangan

3.1. Pengasingan dan penulenan oligosakarida

CDO telah diasingkan daripada ekstrak alkali badan kering C. deserticola dengan hasil sebanyak 3.07 peratus . Dua pecahan CDOS-1 dan CDOS-2 telah diasingkan daripada elusi air suling oleh lajur Sephadex G-100, masing-masing (Gamb.1). Pecahan tulen CDOS-1 dan CDOS-2 menunjukkan satu puncak pada lajur Sephadex G-25, menunjukkan bahawa tiada oligosakarida lain hadir dalam sampel. Keputusan komposisi monosakarida menunjukkan bahawa CDOS-1 hanya terdiri daripada sukrosa (Rajah.2) dan CDOS-2 terutamanya terdiri daripada sukrosa, rhamnose dan manitol (Rajah.3), dengan nisbah mol daripada 1:0.73:3.61.

3.2. Aktiviti Imunobiologi CDO

Banyak bukti in vivo dan in vitro telah menunjukkan bahawa oligosakarida semulajadi menunjukkan fungsi imunomodulasi dengan merangsang kedua-dua selular dan humoral.imun maklum balas[27], [28]. Dalam kertas kerja ini, 100 mg/kg/BW CDO meningkatkan indeks limpa tetikus, tetapi tidak terdapat perbezaan ketara dalam indeks timus antara kumpulan yang dirawat dan kumpulan kawalan (Jadual 1). Makrofaj adalah komponen penting dalam pertahanan perumah terhadap jangkitan virus dengan menghalang replikasi virus intraselular dan dengan membunuh sel yang dijangkiti virus [29]. Apabila diaktifkan, pelbagai oksigen atau nitrogen perantaraan dan sitokin dibebaskan daripada makrofaj dan mengambil bahagian dalam pelbagai fungsi biologi penting, seperti aktiviti anti-radang dan anti-tumor [30]-[32]. Oleh itu, aktiviti fagositik makrofaj adalah penunjuk penting fungsi imun organisma. Dalam kajian ini, dos CDO yang sederhana dan tinggi meningkatkan aktiviti fagositosis makrofaj (Jadual 1). Pembiakan sel penghasil antibodi yang disebabkan oleh CDO telah dikaji dengan pemeriksaan peningkatan PFC hemolitik dalam limpa tikus Kunming yang telah diimunisasi dengan SRBC serta spesimen ujian. Keputusan menunjukkan bahawa dos CDO yang sederhana dan tinggi dengan ketara meningkatkan percambahan sel penghasil antibodi (Jadual2). Dos CDO yang tinggi menyebabkan peningkatan yang sangat ketara dalam kiraan PFC (P <>

Rujukan

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Pengiktirafan Campuran Isyarat Biologi Berdasarkan Analisis Wavelet. Dalam: Y. Jiang, et al (eds). Proc. Bengkel Kejuruteraan Sukan UK-China. Liverpool: Kesatuan Akademik Dunia. 2007, hlm. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Kesan unsur nadir bumi terhadap pertumbuhan sel Cistanche deserticola dan penghasilan glikosida phenylethanoid. JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian, et al. Produk semula jadi baharu daripada Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Tindakan anti-oksidatif glikosida Cistanche dalam tisu tikus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRAaktiviti anti-nociceptive dan anti-radang yang disebabkan oleh Cistanche deserticola dalam tikus. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Bulan, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MS Cistanches Herba meningkatkan pembelajaran dan ingatan dengan mendorong faktor pertumbuhan saraf. Penyelidikan Otak Tingkah Laku. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Perbandingan antara Cistanche deserticola YC Ma dan C, tubulosa (Shenk) Wight pada beberapa tindakan farmakologi.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ, et al. Kajian meningkatkan potensi seks C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL, et al. Perbandingan antara berat Cistanche deserticola YC Ma dan C.tubulosa pada beberapa tindakan farmakologi. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Kesan imunomodulator polisakarida Cistanche deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan,Song Yuanyuan,Zhang Hongquan. Kemajuan dalam Penyelidikan Bahan Kimia dan Aktiviti Perubatan Cistanche. Sumber Tumbuhan Liar Cina, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Pengasingan dan pengenalpastian glikosida phenylethanoid daripada Cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Penentuan glikosida phenylethanoid dalam Cistanche deserticola oleh resin retikular makro- spektrofotometri. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Perencatan nitrik oksida oleh phenylethanoids dalam makrofaj diaktifkan.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan, et al. Analisis Struktur Polisakarida larut air SPA Diasingkan daripada Batang Cistanche Deserticola Ma. Jurnal Kimia Universiti Cina, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Kajian tentang farmakologi imun dan sifat penyerapan polisakarida Cistanche deserticola. 2011, No.S1, Perubatan dan Sains Kesihatan, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Aktiviti hepatoprotektif feniletanoid daripada Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Buku Panduan Amilase dan Enzim Berkaitan (ed. oleh The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (ed.) Prosiding Persidangan Ke-5 mengenai Karies Pergigian dan Gula Gandingan (dalam bahasa Jepun), Institut Kesihatan Kebangsaan, Tokyo (1980)

[20] Kodo Otaka. Oligosakarida Berfungsi dan Aspek Barunya sebagai Modulasi Imun. J. Biol. Makromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polisakarida daripada ekstrak air panas kacang Coffea arabica panggang: Pengasingan dan pencirian. Karbohidr. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kaedah kolorimetrik untuk penentuan gula dan bahan berkaitan. dubur. Kimia. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analisis komponen monosakarida dalam polisakarida Angelica oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi. Sains Dubur. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan, et al. Pengekstrakan dan Pemurnian Lektin daripada Kacang Buah Pinggang Merah dan Kajian Fungsi Imun Awal Lektin dan Empat Polisakarida Herba Cina. Jurnal Bioperubatan dan Bioteknologi, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ, dan A. Szenberg. Penambahbaikan lanjut dalam teknik plak untuk mengesan sel pembentuk antibodi tunggal. Immunology.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura, et al. Aktiviti Imunobiologi Pecahan Porin Diasingkan daripada Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Jangkitan dan Kekebalan. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Aktiviti imunomodulasi CVT- E002: ekstrak proprietari daripada ginseng Amerika Utara (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Struktur dan hubungan struktur-aktiviti tiga mitogenik dan penetapan pelengkap arabinogalactans pectic dari tumbuhan antiulser Malian Cochlospermum tinctorium A. Rich dan Vernonia kotschyana Sch Bip. bekas Walp. Biomakromolekul. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim, dan J.-K. Hwang, Aktiviti imunomodulasi Arabinogalactan dan Fucoidan secara in vitro. Jurnal Makanan Berubatan. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Penilaian dan perbandingan aktiviti imunoregulasi empat pecahan hidrosoluble Angelica Sinensis in vitro pada makrofaj peritoneal dalam tikus ICR. Imunofarmakologi Antarabangsa. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Ekspresi gen sitokin pro-radang dan pengawalan nitrik oksida bagi radix Astragali yang diekstrak akueus dalam sel makrofaj RAW 264.7. Jurnal Etnofarmakologi. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee dan YJ Jeon. Polisakarida yang diasingkan daripada Poria cocos sclerotium mendorong pengaktifan NF-κB/ Rel dan ekspresi iNOS dalam makrofaj murine. Imunofarmakologi Antarabangsa. 2003, 3(10-11):1353–1362.