Perbandingan Antara QPCR Dan RNA‑seq Mendedahkan Cabaran Mengukur Ungkapan HLA Bahagian 1

Abstrak

Antigen leukosit manusia (HLA) kelas I dan II lokus adalah unsur penting imuniti semula jadi dan diperolehi. Fungsi mereka termasuk pembentangan antigen kepada sel T yang membawa kepada tindak balas imun selular dan humoral, dan modulasi sel NK. Pengaruh luar biasa mereka terhadap hasil penyakit kini telah dijelaskan oleh kajian persatuan seluruh genom. Ekson yang mengekodkan alur pengikat peptida telah menjadi tumpuan utama untuk menentukan kesan HLA terhadap kerentanan/patogenesis penyakit. Walau bagaimanapun, tahap ekspresi HLA juga telah terlibat dalam hasil penyakit, menambah dimensi lain kepada kepelbagaian melampau HLA yang memberi kesan kebolehubahan dalam tindak balas imun merentas individu.

Terdapat hubungan rapat antara antigen leukosit dan imuniti. Antigen leukosit merujuk kepada molekul pada permukaan sel darah putih manusia, yang boleh mengenal pasti dan membezakan jenis sel dan patogen yang berbeza. Ia adalah bahagian penting dalam sistem imun manusia dan pengawal selia tindak balas imun yang penting.

Perbezaan dalam antigen leukosit boleh mengakibatkan tindak balas imun yang berbeza dan kerentanan penyakit. Contohnya, antigen leukosit tertentu dikaitkan dengan penyakit autoimun, penyakit berjangkit dan tumor. Ekspresi antigen leukosit tertentu juga berkaitan dengan fungsi dan kuantiti sel imun.

Oleh itu, memahami ciri-ciri molekul permukaan leukosit individu adalah sangat penting untuk menilai status imun individu dan risiko dan prognosis penyakit tersebut. Pada masa yang sama, ia juga kondusif untuk perumusan rawatan peribadi dan langkah-langkah pencegahan. Dari sudut pandangan ini, kita perlu meningkatkan imuniti. Cistanche mempunyai kesan yang ketara dalam meningkatkan imuniti. Cistanche kaya dengan pelbagai bahan antioksidan, seperti vitamin C, dan karotenoid Bahan-bahan ini boleh menghilangkan radikal bebas, mengurangkan tekanan oksidatif, dan meningkatkan daya tahan sistem imun.

Klik serbuk ekstrak cistanche tubulosa

Untuk menganggarkan ekspresi HLA, kajian imunogenetik secara tradisinya bergantung pada PCR kuantitatif (qPCR). Penggunaan teknologi pemprosesan tinggi alternatif seperti RNA-seq telah dihalang oleh isu teknikal akibat polimorfisme yang melampau pada gen HLA. Walau bagaimanapun, baru-baru ini, pelbagai kaedah bioinformatik telah dibangunkan untuk menganggarkan ekspresi HLA dengan tepat daripada data RNA-seq. Ini membuka peluang menarik untuk mengukur ekspresi HLA dalam set data yang besar tetapi juga membawa persoalan sama ada keputusan RNA-seq adalah setanding dengan hasil oleh qPCR. Dalam kajian ini, kami menganalisis tiga kelas data ekspresi untuk gen kelas I HLA untuk set individu yang dipadankan: (a) RNA-seq, (b) qPCR, dan (c) ekspresi HLA-C permukaan sel. Kami melihat korelasi sederhana antara anggaran ungkapan daripada qPCR dan RNA-seq untuk HLA-A, -B dan -C ({{10}}.2 Kurang daripada atau sama dengan rho Kurang daripada atau sama dengan 0.53 ). Kami membincangkan faktor teknikal dan biologi yang perlu diambil kira apabila membandingkan kuantifikasi untuk fenotip molekul yang berbeza atau menggunakan teknik yang berbeza.

Kata kunci

HLA · Ekspresi · PCR · RNA-seq.

pengenalan

Ekspresi gen menyediakan fenotip molekul yang terletak pada kedudukan pertengahan antara variasi genetik dan fenotip kompleks, seperti status penyakit. Memahami asas genetik ekspresi gen boleh menjadi strategik untuk membuat hubungan antara variasi genetik dan fenotip kompleks (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), termasuk kerentanan kepada penyakit autoimun dan berjangkit. Walaupun kajian variasi genetik pada lokus antigen leukosit manusia (HLA), dan dalam kawasan kompleks histokompatibiliti utama (MHC) secara amnya, telah digunakan untuk membedah asas genetik beberapa penyakit kompleks (Trowsdale dan Knight 2013; Dendrou et al . 2018), kemasukan fenotip molekul, khususnya yang dikaitkan dengan ekspresi gen, adalah secara perbandingan terkini (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Rantau MHC manusia pada kromosom 6p21 memaparkan ketumpatan gen yang tinggi, dengan corak unik ketidakseimbangan hubungan (LD) dan polimorfisme melampau (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). Rantau MHC mengandungi lokus kelas I dan II HLA yang mengekod molekul yang terlibat dalam mencetuskan dan memodulasi tindak balas imun. Molekul kelas I HLA dinyatakan oleh kebanyakan sel bernukleus dan secara amnya membentangkan peptida intraselular kepada sel T CD8 plus. Sebaliknya, molekul kelas II HLA diekspresikan terutamanya oleh sel pembentang antigen profesional, dan hadir kepada antigen eksogen sel CD4 ditambah T yang telah dihayati oleh endositosis. Molekul kelas I juga diiktiraf oleh reseptor pada sel pembunuh semulajadi (NK), reseptor seperti imunoglobulin sel pembunuh (KIR), yang memberi kesan kepada kedua-dua pendidikan dan pengaktifan sel NK (Colonna dan Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Gandingan alotaip kelas I HLA yang berbeza dan molekul KIR tertentu mempengaruhi aktiviti sel NK (dan subset CD8 tambah sel T), mengakibatkan risiko berbeza kepada kanser, penyakit berjangkit dan autoimun (disemak dalam Kulkarni et al. 2008).

Persatuan penyakit HLA telah dikaitkan terutamanya dengan perbezaan khusus alel dalam persembahan antigen, disebabkan oleh polimorfisme yang meluas dalam alur pengikat peptida. Walau bagaimanapun, tahap ekspresi HLA menyumbang kepada beberapa persatuan yang diperhatikan antara polimorfisme HLA dan hasil penyakit. Tahap ekspresi HLA ialah pengubah penting autoimun dan kepada kekuatan tindak balas imun pengantara HLA terhadap kanser dan jangkitan (disemak dalam René et al. 2016).

Terdapat beberapa contoh perkaitan antara tahap ekspresi HLA dan hasil jangkitan virus. Sebagai contoh, telah didokumenkan dengan baik bahawa tahap ekspresi HLA-C yang lebih tinggi, pada kedua-dua tahap mRNA dan protein pada permukaan sel, dikaitkan dengan kawalan HIV yang lebih baik-1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), manakala ekspresi HLA-A yang tinggi dikaitkan dengan kawalan HIV terjejas (Ramsuran et al. 2018). Jangkitan SARS-CoV-2 merendahkan ekspresi gen HLA-C (Loi et al. 2022) dan ekspresi kelas HLA I pada permukaan sel (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), serta kelas HLA Ekspresi gen II, termasuk HLA-DPA1, -DPB1, -DRA, dan -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Selain itu, terdapat perkaitan antara tahap ekspresi HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) dan HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) dengan pelepasan HBV; Ekspresi HLA-DRA dengan kerentanan kepada jangkitan oleh virus Influenza A kelawar dalam garisan sel manusia (Karakus et al. 2019); dan perkaitan yang meluas antara varian pengawalseliaan dan tahap ekspresi pada gen kelas II HLA, termasuk HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1, dan -DRB5 dengan tindak balas antibodi terhadap berbilang virus lazim (Kachuri et al. 2020).

Tahap ekspresi lokus HLA juga dikaitkan dengan autoimun (lihat Johansson et al. 2022 untuk semakan). Tahap ekspresi HLA-C pada permukaan sel (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), serta tahap HLA-G pada permukaan sel dan dalam plasma (da Costa Ferreira et al. 2021), telah dikaitkan dengan risiko penyakit radang usus. Peningkatan ekspresi HLA-B27 pada permukaan sel diperhatikan dalam kalangan pesakit ankylosing spondylitis (Cauli et al. 2002), seperti keseluruhan ekspresi HLA kelas I dalam kalangan pesakit penyakit Graves (Weider et al. 2021). Tahap ekspresi kelas II HLA juga mempengaruhi risiko keadaan autoimun.

Ekspresi gen HLA-DQA1 dan -DRB1 dan ekspresi molekul DQ dan DR pada permukaan sel meningkat dalam monosit darah periferi pesakit vitiligo (Cavalli et al. 2016); varian pengawalseliaan yang dikaitkan dengan ekspresi gen HLA-DQA1, -DQB1, dan -DRB1 yang lebih tinggi dan ekspresi DQ dan DR pada permukaan sel dikaitkan dengan risiko lupus erythematosus sistemik (Raj et al. 2016); Ekspresi gen HLA-DRB5 lebih tinggi pada pesakit skleroderma dengan penyakit paru-paru interstisial (Odani et al. 2012); alel HLA-DRB1 khusus sangat dinyatakan dalam pesakit arthritis rheumatoid (Houtman et al. 2021); dan ekspresi DRB1*15:01 yang lebih tinggi dikaitkan dengan risiko sklerosis berganda (Alcina et al. 2012). Oleh itu, memahami variasi ekspresi HLA di kalangan individu dan mekanisme yang mengawal tahap ekspresi HLA akan menjadi kunci untuk mendedahkan asas genetik fenotip penyakit.

Secara tradisinya, ekspresi HLA telah dianggarkan oleh teknik berasaskan antibodi untuk tahap ekspresi pada permukaan sel (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) atau oleh PCR kuantitatif (qPCR atau RT-PCR) untuk tahap transkripsi mRNA (Bettens et al. al. 2014; Ramsuran et al. 2015, 2017). Adalah mencabar untuk membandingkan keputusan merentas kajian atau membandingkan lokus HLA yang berbeza dalam kajian yang sama kerana prosedur percubaan yang berbeza digunakan untuk setiap analisis dan untuk setiap lokus HLA, yang boleh menghasilkan kecekapan amplifikasi yang berbeza dalam qPCR atau pertalian antibodi dalam sitometri aliran.

Teknologi pemprosesan tinggi seperti RNA-seq memberikan anggaran ekspresi untuk semua gen dalam genom, termasuk gen HLA, dengan itu membenarkan penilaian ekspresi HLA dalam konteks genom yang luas. Walau bagaimanapun, teknologi ini membawa banyak cabaran apabila digunakan untuk menganggar tahap ekspresi gen HLA. Sebagai tambahan kepada berat sebelah yang didokumentasikan dengan baik yang dikaitkan dengan ujian RNA-seq (cth, kesan kelompok, penyediaan perpustakaan, kandungan GC ('t Hoen et al. 2013), kesukaran dalam menganggar tahap ekspresi untuk gen HLA disebabkan oleh fakta bahawa kuantifikasi melibatkan penjajaran bacaan pendek kepada genom rujukan, yang tidak memberikan perwakilan lengkap kepelbagaian alel HLA.

Oleh itu, sesetengah bacaan mungkin gagal diselaraskan kerana sejumlah besar perbezaan berkaitan genom rujukan (Brandt et al. 2015). Di samping itu, gen HLA adalah sebahagian daripada keluarga gen yang terbentuk selepas pusingan pertindihan berturut-turut dan selalunya mengandungi segmen yang sangat serupa antara paralog, dengan itu mengakibatkan penjajaran silang antara gen dan kuantifikasi tahap ekspresi yang berat sebelah. Kesukaran ini mendorong pembangunan saluran paip pengiraan (lihat Johansson et al. 2022 untuk semakan) yang merangkumi kepelbagaian HLA yang diketahui dalam langkah penjajaran dan telah ditunjukkan untuk menyediakan tahap ekspresi yang tepat untuk gen HLA (Boegel et al. 2012; Lee et al. al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020).

Walaupun kedua-dua pendekatan RNA-seq dan qPCR menganggarkan ekspresi HLA dengan mengukur banyaknya transkrip, kaedah tersebut melibatkan prosedur pemprosesan eksperimen dan bioinformatik yang berbeza. Untuk pengetahuan kami, perbandingan kuantitatif hasil daripada RNA-seq kepada yang diperoleh daripada qPCR untuk gen HLA belum dilakukan. Dalam kajian ini, kami berusaha untuk membandingkan teknik yang berbeza dan fenotip molekul untuk kuantifikasi ekspresi kelas I HLA, dengan mengingati bahawa tiada teknik boleh dianggap sebagai standard emas. Untuk mengurangkan kesan variasi teknikal dan biologi dalam perbandingan kajian yang berbeza, kami melakukan ujian RNA-seq pada satu set 96 individu yang mana anggaran ekspresi qPCR tersedia (untuk HLA-A, -B, -C), dan untuk subset yang ekspresi permukaan sel berasaskan antibodi HLA-C juga tersedia. Kuantifikasi RNA-seq dilakukan dengan saluran paip disesuaikan HLA yang membolehkan anggaran ekspresi yang tepat, meminimumkan bias pendekatan standard bergantung pada genom rujukan tunggal.

Bahan dan kaedah

Sampel

Sampel darah diperoleh daripada 96 penderma darah sihat yang mendaftar dalam program penderma sukarela di Makmal Penyelidikan Kanser Kebangsaan Frederick (FNLCR). Persetujuan termaklum bertulis diperoleh daripada semua subjek dan spesimen tidak dikenali oleh prosedur Institut Kanser Kebangsaan yang diluluskan oleh LHDN. RNA diekstrak daripada sel mononuklear darah periferal (PBMC) yang baru diasingkan menggunakan kit Universal RNeasy (Qiagen). RNA dirawat dengan DNAse bebas RNAse untuk penyingkiran DNA genomik. Jumlah RNA yang diekstrak daripada PBMC dikira menggunakan HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Semua sampel yang menunjukkan skor kualiti RNA lebih daripada 8 digunakan dalam analisis ekspresi gen.

menaip HLA

Alel HLA ditentukan oleh penjujukan Sanger. Selain itu, kami menjalankan HLApers (Aguiar et al. 2019) dan Kourami (Lee dan Kingsford 2018) untuk membuat kesimpulan alel HLA terus daripada RNAseq dan menyemak persetujuan dengan panggilan berasaskan penjujukan Sanger. Jika kami menganggap panggilan yang konsisten antara HLApers dan Kourami, kami melihat hanya 10 percanggahan dengan panggilan Sanger daripada 288 perbandingan (3 loci × 96 individu). Kebanyakan daripada mereka (n=5) menunjukkan sokongan daripada RNA-seq untuk alel yang sangat hampir dengan alel yang ditentukan oleh penjujukan Sanger, oleh itu kami memilih untuk mengekalkan panggilan berasaskan RNA-seq. Untuk 3 genotip, kami memerhatikan panggilan homozigot daripada RNA-seq berkemungkinan kerana satu alel tidak dinyatakan, dan kami menyimpan panggilan daripada penjujukan Sanger. Ini tidak memberi kesan kepada anggaran ungkapan, kerana tiada bacaan yang sejajar dengan alel yang tidak dikesan melalui RNA-seq. Untuk satu genotip, kami melihat sokongan yang baik untuk panggilan heterozigot manakala penjujukan Sanger dipanggil homozigot. Dalam kes itu, kami mengekalkan panggilan berasaskan RNA-seq kerana ia lebih menjelaskan bacaan yang diperhatikan. Untuk satu panggilan alel, kami menganggap ralat panggilan berasaskan RNA-seq kerana liputan bacaan yang tidak mencukupi.

PCR Kuantitatif (qPCR)

Tahap transkripsi mRNA HLA untuk HLA-A, -B, dan -C diukur oleh qPCR dalam ujian yang memastikan penguatan alel biasa yang tidak berat sebelah pada setiap lokus sambil mengelakkan penguatan semua lokus lain. Primer yang digunakan ialah: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Transkripsi terbalik dilakukan menggunakan kit RNA-ke-cDNA Berkapasiti Tinggi (Applied Biosystems). Penguatan HLA dan gen housekeeping 2 microglobulin (B2M) cDNA dilakukan menggunakan campuran induk hijau Power SYBR (Applied Biosystems), pada mesin ABI 7900HT. Urutan primer untuk B2M diterangkan dalam Jadual S4 Kulkarni et al. (2013). Tahap ekspresi purata bagi setiap gen HLA telah dinormalkan kepada B2M dan dikira menggunakan kaedah 2-∆∆Ct (dengan Ct ialah kitaran ambang).

Tahap ekspresi spesifik alel purata alel HLA biasa dianggarkan oleh model linear seperti yang diterangkan dalam Ramsuran et al. (2015). Secara khusus, kami memodelkan ekspresi sebagai fungsi linear bagi dua alel yang dibawa oleh setiap individu dan mengekstrak kesan setiap alel pada ekspresi gen. Kami melakukan langkah ini dalam R (lihat bahagian ketersediaan Kod).

Ekspresi permukaan

Ekspresi permukaan sel HLA-C diukur pada sel CD3 tambah daripada PBMC yang baru diasingkan oleh sitometri aliran menggunakan antibodi monoklonal HLA-C khusus DT9 (Apps et al. 2013). Untuk analisis HLA-A dalam subset individu yang membawa A*03 dan A*11, kami mengotorkan sel dengan antibodi 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA‑seq

Penyediaan RNA

RNA-seq dilakukan pada RNA yang disimpan pada-80 darjah . Jumlah RNA dikira menggunakan Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher). Kualiti RNA dinilai menggunakan instrumen Bioanalyzer 2100 dan Kit Pico RNA Agilent 6000 (Agilent Technologies). Bagi setiap sampel, 500 ng jumlah RNA digunakan sebagai input untuk penyediaan keseluruhan perpustakaan yang habis transkrip rRNA. Perpustakaan berikat penyesuai telah disediakan dengan Kit KAPA HyperPrep (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) menggunakan Penyesuai Barcoded DNA Bioo Scientific NEXTfex™ (BioScientifc, Austin, TX, USA) mengikut protokol yang disediakan oleh KAPA.

Pengurangan rRNA menggunakan RiboErase

RNA ribosom telah habis dengan mengeramkan jumlah RNA dengan probe pelengkap kepada urutan rRNA. Berikutan hibridisasi, RNase H digunakan untuk merendahkan rRNA secara enzimatik. Pembersihan dan pencernaan DNase dilakukan menggunakan Kapa Pure Beads dan DNase mengikut protokol Kapa.

Pemecahan, sintesis cDNA, dan pembinaan perpustakaan

Sampel yang habis rRNA telah dipecahkan pada 85 darjah selama 4.5 minit dengan kehadiran magnesium sebelum sintesis untai pertama dan ke-2 dan tindak balas A-Tailing. Penyesuai Berkod Bar DNA NEXTfex (1.5 uM) telah disambungkan kepada cDNA berekor A dengan kod bar unik untuk setiap sampel. Produk telah disucikan dengan Kapa Pure Beads dan 8 kitaran Penguatan Perpustakaan telah dilakukan. Berikutan penguatan, pembersihan perpustakaan akhir telah dilakukan, dan kuantifikasi perpustakaan dan QC dinilai menggunakan Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) dan kit Agilent DNA HS pada instrumen 2100 Bioanalyzer.

Urutan

Pustaka penjujukan berganda yang terhasil digunakan dalam pembentukan kluster pada Illumina cBOT (Illumina, San Diego, CA, Amerika Syarikat) dan penjujukan dilakukan menggunakan Illumina HiSeq 2500 mengikut protokol yang disediakan Illumina untuk penjujukan akhir berpasangan 2×126 bp. Setiap transkrip disusun mengikut kedalaman sasaran 40-50 juta bacaan.

RNA‑seq pada sampel segar daripada 11 individu

Untuk menyiasat kemungkinan kemerosotan sampel bahan yang disimpan pada-80 darjah sebelum penjujukan RNA, sumber potensi perselisihan dengan anggaran qPCR, kami menarik semula darah daripada 11 penderma dan melakukan RNA-seq pada sampel baharu. Eksperimen telah dijalankan dengan penyediaan dan kaedah perpustakaan yang sama seperti sebelumnya, tetapi disusun menggunakan Illumina NextSeq dengan bacaan 2×150 pb.

Kuantifikasi ungkapan untuk RNA‑seq

Transkriptom rujukan

Kami menggunakan Salmon (Patro et al. 2017) untuk menganggarkan tahap ekspresi bagi semua transkrip yang dijelaskan dalam pangkalan data Gencode v37. Kami menggunakan semua pilihan untuk pembetulan berat sebelah pada Salmon (berat sebelah GC, berat sebelah kedudukan dan berat sebelah khusus jujukan).

diperibadikan

Sama seperti "transkrip Rujuk", tetapi dengan transkrip HLA diperibadikan mengikut genotip HLA-A, -B, dan -C yang dibawa oleh setiap individu. Pemperibadian dilakukan dengan menjajarkan urutan untuk alel HLA genom rujukan kepada genom untuk mendapatkan koordinat. Kemudian, dengan menggunakan penjajaran berbilang jujukan alel yang terdapat pada genom rujukan dengan semua alel lain (tersedia daripada keluaran IPD-IMGT/HLA 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), kami mengaitkan genomik kedudukan kepada semua alel HLA. Akhirnya, kami membina transkrip yang diperibadikan berdasarkan gabungan maklumat mengenai koordinat transkrip dan jujukan alel HLA. Prosedur ini dijalankan dalam R (R Core Team 2020), menggunakan pakej Biostrings (Pagès et al. 2020) dan pakej meta tidyverse (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com