Ungkapan Clr‑f Mengawal Selia Ketahanan Buah Pinggang Dan Homeostasis Metabolik Ⅲ
Nov 24, 2023
Perbincangan
Keradangan dan pengantaraan sel imunkerosakan memainkan peranan utama dalam perkembangan dan perkembangan kecederaan dan disfungsi buah pinggang. Dalam kajian ini, kami melaporkan keperluan untuk Clr-f dalam penyelenggaraankesihatan buah pinggangdan fungsisebagai kawalan homeostatik intrinsik terhadapkerosakan buah pinggang yang dimediasi imun dan metabolik. Penemuan kami menunjukkan penyusupan sel imun, dan imunoglobulin dan pelengkap pemendapan protein dalam buah pinggang tikus kekurangan Clr-f. Ciri-ciri imun tikus kekurangan Clr-f ini dipasangkan dengan penampilan lesi tiub dan glomerular yang dikaitkan dengan usia, pengumpulan lipid ektopik, dan disregulasi pelbagai proses transkrip.
Klik untuk cistanche herba untuk penyakit buah pinggang
Protein Clr yang dikodkan dalam NKC antara reseptor NKR-P1 yang dikaitkan secara genetik telah menjadi tumpuan kajian sebagai mediator bebas MHC kelas I yang tidak berlebihan bagi pengiktirafan diri yang hilang oleh NKR-P1 yang mengekspresikan sel imun9,27-31. Ekspresi peningkatan protein Clr terpilih sebagai tindak balas kepada tekanan sel juga dilaporkan berfungsi menghalang tindak balas imun sel imun pemastautin tisu7,12,32. Oleh itu, Clr-f usus didapati menyumbang kepada toleransi imun dalam persekitaran usus yang sangat imunogenik melalui interaksinya dengan limfosit intraepithelial yang mengekspresikan reseptor NKR-P1G7. Kerja yang dilakukan oleh Leibelt et al. menunjukkan bahawa tikus yang dicabar dengan poli (I: C) mempamerkan ekspresi Clr-f yang meningkat dan interaksi Clr-f/NKR-P1G secara in vitro sangat menghalang sel-sel ekspresi NKR-P1G. Bersama-sama penemuan ini boleh ditafsirkan sebagai mekanisme yang berpotensi di mana Clr-f boleh menghalang kereaktifan subset positif NKR-P1G intraepithelial usus terhadap halangan epitelium yang sentiasa diprovokasi oleh rangsangan mikrob7.
Penjanaan tikus kekurangan Clr-f memberi kami peluang pertama untuk menilaiimplikasi fungsionaldaripada ekspresi Clr-f dalam vivo dan membenarkan kami untuk menyiasat potensi peranan homeostatik imun Clr-f dalam buah pinggang. Kerosakan buah pinggang yang diperhatikan dalam tikus Clr-f−/− sejajar dengan model yang menurunkan regulasi Clr-f berfungsi sebagai penunjuk tekanan sel dan kecederaan yang melepaskan kekangan pada sel efektor yang mengekspresikan NKR-P1G. Peningkatan NKR-P1G pada sel T dalam buah pinggang tikus Clr-f−/− menunjukkan bahawa sama ada ekspresi NKR-P1G meningkat di kalangan sel T pemastautin buah pinggang jika tiada Clr-f, atau buah pinggang Clr- f−/− tikus tertakluk kepada penyusupan sel T yang mengekspresikan NKR-P1G. Ketiadaan perubahan yang dapat dikesan dalam kehadiran atau pengedaran sel pengekspres NKR-P1G dalam usus tikus Clr-f−/− mungkin menunjukkan bahawa akibat fungsi NKR-P1G: interaksi Clr-f dalam usus adalah terhad kepada kawalan kereaktifan imun dalam konteks jangkitan dan bukannya toleransi imun. Sebagai alternatif, interaksi berlebihan juga boleh mengawal aktiviti sel pengekspres NKR-P1G. Ini disokong oleh penemuan bahawa NKR-P1G mengikat bukan sahaja kepada Clr-f tetapi juga kepada Clr-d dan Clr-g33, yang terakhir dinyatakan secara sederhana dalam tisu kedua-dua buah pinggang dan usus6. Walaupun penemuan kami mendedahkan keperluan untuk Clr-f untuk melindungi daripada kerosakan buah pinggang autoimun, peranan pengantara NKR-P1G dalam patologi buah pinggang autoimun tikus Clr-f−/− tidak lengkap. Terutama, walaupun terdapat peningkatan dalam sel T yang mengekspresikan NKR-P1G dalam buah pinggang Clr-f−/−tikus, perbezaannya adalah mengecewakan. Ada kemungkinan bahawa reseptor alternatif mengambil bahagian dalam pengawasan Clr-f dalam buah pinggang. Untuk menangani sepenuhnya paksi kawalan ini dalam homeostasis buah pinggang, penyiasatan lanjut diperlukan
Kerosakan buah pinggang yang dimediasi imun dicirikan oleh penyusupan sel-sel radang ke dalam ruang interstisial atau ke glomerulus34. Pengumpulan renal monosit, sel B dan T, antibodi anti-glomerular, peningkatan sitokin IL-12 dan IFN, dan pelbagai patologi glomerular dalam tikus Clr-f−/− hampir menyerupai landskap autoimun model tetikus LN ( iaitu, MRL-Faslpr)35–37. Walaupun buah pinggang Clr-f−/− mempamerkan deposit mesangial dominan IgA dengan pemendapan IgM dan IgG yang berkaitan, dan pengelompokan profil transkrip Clr-f−/− dan IgAN, kemungkinan pramatang untuk mencadangkan bahawa fenotip ini menunjukkan sejenis CKD dengan IgAN38. Sebaliknya, kecederaan ini, bersama-sama dengan kehadiran mesangiolysis, penebalan GBM, dan kematian podosit dalam buah pinggang Clr-f−/− serta perubahan tubulointerstitial, pengumpulan lemak, dan disregulasi yang ketara dalam laluan metabolik adalah unsur yang biasa kepada pelbagai patologi. berasal daripada kecacatan metabolik yang diburukkan oleh sistem imun37,39,40. Tanpa mengira punca atau jenis penyakit disfungsi buah pinggang tetikus Clr-f−/−, Clr-f nampaknya memainkan peranan mengurangkan perkembangan autoimun dengan patologi berkaitan glomerulonephritis yang jelas.
Pemeriksaan kami terhadap tikus Rag1−/−Clr-f−/− menunjukkan sumbangan penting mediator bebas sel T dan B kepada tindak balas autoimun tikus Clr-f−/−. Khususnya, pengumpulan sel CD11c+ periglomerular, sel F4/80+ dan sel NKp46+ adalah lebih ketara sekiranya tiada sel T dan B dan dikaitkan dengan kehadiran kerosakan glomerular yang ketara. Ini menunjukkan bahawa walaupun sel T dan B boleh menyumbang kepada keradangan yang merosakkan buah pinggang dan kompleks autoantibodi, dalam tikus Clr-f−/− ini mungkin bukan penentu utama patologi, tetapi sama ada penyumbang sekunder kepada aktiviti keradangan sel imun lain atau berpotensi. menjalankan peranan imunoregulasi pada tikus yang kekurangan Clr-f. Ini membezakan bukti daripada model tetikus ddY IgAN yang menunjukkan tindak balas terpolarisasi T1 yang kuat, dengan sel T penghasil IFN meningkat dengan usia dan perkembangan kecederaan glomerular41. Penyusupan buah pinggang sel B dalam tikus kekurangan Clr-f juga telah ditunjukkan dalam model tetikus SLE42. Sehingga kini, tidak jelas sama ada sel B dalam buah pinggang menyumbang kepada keradangan yang merosakkan dalam CKD atau memainkan lebih banyak peranan pengawalseliaan43. Bukti terkini CKD pada pesakit tua mendapati bahawa penurunan populasi sel B dikaitkan dengan perkembangan penyakit buah pinggang44. Bukti daripada kedua-dua sel T dan B telah terbukti mempunyai aktiviti penindasan imun dalam penyakit buah pinggang autoimun45, 46, dan oleh itu sejauh mana ia menyumbang atau mengawal patologi tikus Clr-f−/− memerlukan siasatan lanjut.
Penemuan kami bersama-sama menunjukkan keperluan untuk ekspresi Clr-f dalam epitelium tiub tubul berbelit proksimal, podosit, dan/atau epitelium usus. Kehilangan ekspresi Clr-f membawa kepada lata autoimun dan keradangan yang jelas yang membawa kepada kerosakan buah pinggang dan adipositas yang berkaitan. Tindak balas imun yang ditimbulkan oleh kehilangan Clr-f nampaknya tidak bergantung kepada sel T dan B. Secara keseluruhan, peranan berfungsi untuk Clr-f dalam buah pinggang boleh dibayangkan sebagai molekul perencatan untuk sel imun efektor pengawas dalam buah pinggang seperti yang diletakkan di dalam usus, atau sebagaipengatur intrinsik fungsi sel tiub.
Bahan dan kaedah Tikus.
Semua tikus dikekalkan dalam persekitaran bebas patogen khusus. Tikus C57BL/6 (WT) dan B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) telah diperoleh daripada Makmal Jackson (Bar Harbor, ME, Amerika Syarikat). Tikus yang membawa mutasi nol gabungan dalam Rag1 dan Clr-f (Rag1−/−;Clr-f −/−) dihasilkan dengan menyeberangi tikus Clr-f-defcient (Clr f −/−) dengan tikus (Rag1−/−) . Semua pembiakan dan manipulasi yang dilakukan ke atas haiwan adalah mengikut garis panduan universiti dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Dalhousie dan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) Universiti Ottawa. Semua reka bentuk kajian haiwan, eksperimen dan pelaporan telah dijalankan mengikut garis panduan ARRIVE.
Penjanaan tikus kekurangan Clr‑f. Tikus kekurangan Clr-f (Clr-f −/−) dihasilkan oleh penggabungan semula homolog binaan penyasaran yang mengandungi kaset foxed phosphoglycerate kinase (PGK)–neomycin dan jujukan genomik yang merangkumi ekson 3, 4, dan sebahagian daripada ekson 5 Gen Clr-f. Pembinaan penyasaran lengkap telah disahkan dengan penjujukan di Institut Penyelidikan Hospital Ottawa (OHRI) sebelum elektroporasi ke dalam sel stem embrio (ES) C57BL/6 Bruce-4. Pemilihan klon ES oleh rintangan G{{10}}dilakukan oleh Kemudahan Teras Transgenik IRCM (Montreal Clinical Research Institute) (Montreal, QC, Kanada). Sementara itu, probe Clr-f 5' dan 3' telah diuji dalam analisis polimorfisme panjang serpihan sekatan (RFLP) menggunakan DNA genomik timik daripada tetikus WT B6, yang masing-masing dicerna dengan BamHI dan PstI. Serpihan DNA yang dicerna telah diselesaikan pada gel agarose 1% dan dipindahkan ke tompok membran nilon. Probe cDNA Clr-f dilabelkan dengan radioaktif 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, Kanada) menggunakan kit lot NEB (New England Biolabs, USA). Tompok telah disiasat dengan probe cDNA Clr-f berlabel 32P dalam larutan hibridisasi (10% (w/v) dekstran sulfat; 1 M NaCl; 1% SDS). Hibridisasi dilakukan semalaman pada suhu 65 darjah dan pencucian selepas penghibridan dilakukan dengan larutan yang mengandungi 2× SSC dan 1% SDS pra-panas hingga 65 darjah . Tompokan telah didedahkan kepada filem fotografi untuk mendedahkan isyarat hibridisasi (Rajah S1A, S3B). Membran telah dilucutkan dengan 0.2% SSC/0.2% SDS selama 30 minit pada 85 darjah antara hibridisasi yang berbeza. Klon tahan neomycin telah disaring oleh analisis Southern blot, dan kecekapan penargetan ~ 15% diperhatikan. Klon ES terpilih telah disuntik secara mikro ke dalam blastokista di Kemudahan Perkhidmatan Injeksi Mikro IRCM untuk menjana tikus pengasas Clr-flox chimeric. Tikus telah disaring oleh analisis Southern blot dan kemudian dibiakkan dengan betina B6 untuk menghasilkan tikus heterozigot Clr-fwt/lox. Tikus heterozigot telah dikawinkan untuk mendapatkan tikus Clr-flox/lox. Untuk mengeluarkan kaset neomycin, tikus Clr-flox/lox dibiakkan dengan tikus transgenik CMV-cre homozigot pada latar belakang B6 (Jackson Laboratory). CMV-CreTg/0 heterozigot berganda yang terhasil; Tikus Clr-f−/+ telah dikawinkan untuk menghasilkan tikus Clr-f−/− yang tidak mempunyai transgen CMV-cre. Tikus telah digenotip menggunakan primer khusus (Jadual 1, Rajah S1B, C, dan Rajah S3C, D). Penguatan PCR dilakukan menggunakan polimerase DNA AccuStart II Taq (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, Amerika Syarikat). Campuran PCR telah disediakan mengikut arahan pengilang. DNA telinga yang diekstrak fenol/kloroform digunakan sebagai templat. Parameter kitaran PCR berikut telah digunakan: 30 kitaran amplifikasi 94 darjah selama 40 saat, 60 darjah selama 45 saat, 72 darjah selama 60 saat. WT dan Clr-f −/− littermates telah digunakan dalam semua eksperimen melainkan dinyatakan sebaliknya.
Hibridisasi in situ.
Analisis penghibridan in situ Clr-f dicapai dengan mengklonkan untaian deria penuh CDS dan untaian antisense Clr-f-spanning ke dalam vektor Mudah pGEM-T seperti yang diterangkan sebelum ini. Antisense dan probe RNA deria berlabel genin Digoxi telah ditranskripsi daripada plasmid linear yang mengekod gen Clr-f dengan polimerase T7 menggunakan campuran pelabelan RNA DIG (Roche, Basel, Switzerland). Tisu dikumpul daripada tikus B6 dewasa dan dibetulkan sama ada dalam 10% formalin pada RT atau dalam 4% paraformaldehid pada 4 darjah dengan goncangan lembut sehingga 24 jam. Tisu kemudiannya dibenamkan dalam parafin dan bahagian 4 µm disediakan pada slaid kaca. Slaid tisu telah dinyahkarbonat dengan rawatan dengan 0.2 N HCl selama 15 minit dan 30 µg/mL proteinase K pada 37 darjah selama 20 min. Tisu telah ditetapkan dalam 4% PFA selama 10 minit diikuti dengan rawatan dengan 0.25% anhidrida asetik dalam 0.1 M triethanolamine dua kali selama 5 minit setiap satu. Slaid kemudiannya pra-hibridisasi dengan larutan hibridisasi (50% (v/v) formamide/5×SSC, pH 4.5; 2% (w/v) serbuk penyekat (Roche); 0.05% (w/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/mL heparin; 1 µg/mL yis RNA) dalam ketuhar 58 darjah selama sekurang-kurangnya 1 jam, dan kemudian diinkubasi dengan larutan hibridisasi yang mengandungi probe berlabel digoxigenin 500 ng/mL semalaman pada suhu 58 darjah . Pencucian selepas penghibridan dilakukan dengan 50% formamida/2× SSC, pH 4.5 pada 55 darjah 3×selama 20 minit setiap satu, dan slaid diwarnai dengan antibodi anti-digoxigenin alkali fosfatase-konjugasi biri-biri pada pencairan 1:1000 dalam larutan penyekat ( Roche). Pembangunan warna dilakukan dengan menambahkan substrat nitro blue tetrazolium/5-Bromo, 4-chloro dan 3-indoylphosphate (NBT/ BCIP, Roche) pada slaid. Slaid disimpan dalam gelap di RT sehingga isyarat optimum muncul. Pelabelan kawalan dilakukan menggunakan kuar untaian deria dan kajian pengikatan kompetitif dengan probe deria dan anti deria yang disahkan kekhususan. Slaid kemudian diwarnakan dengan warna hijau muda atau hijau metil dan divisualisasikan di bawah mikroskop cahaya.
RT‑PCR. Tisu buah pinggang daripada tikus WT dan Clr-f −/− padanan umur dan jantina telah dipotong, dibilas dengan PBS dan dibekukan pada darjah -80 . RNA telah diasingkan daripada tisu beku menggunakan reagen pengekstrakan RNA RiboZol (AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA) mengikut arahan pengilang. Kira-kira 1 ug RNA telah ditranskripsikan ke dalam cDNA menggunakan kit cDNA Verso (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Penguatan PCR dilakukan pada 1 μL produk cDNA menggunakan primer khusus (Jadual 1). Keadaan PCR yang digunakan ialah 94 darjah selama 30 saat, 58 darjah selama 30 saat, 72 darjah selama 60 saat, dan 35 kitaran amplifikasi. Produk PCR telah divisualisasikan pada 1% gel agarose yang diwarnakan dengan etidium bromida (Rajah 1C, Rajah S3A).
Imunohistokimia.
Tisu buah pinggang tikus WT dan Clr-f −/− yang dipadankan dengan umur dan jantina telah dinyahparafin dengan tiga pengeraman selama 5 minit dalam xilena, dua pengeraman 5 minit dalam 100% etanol, diikuti dengan 90 % etanol, kemudian 80% etanol, dan akhirnya 70% etanol. Slaid telah dihidratkan semula dengan membasuh dalam air suling (20 celup), dan pengambilan epitope akibat haba dilakukan menggunakan periuk tekanan dalam penimbal sitrat (pH 6.0). Peroksidase endogen disekat dengan 3% hidrogen peroksida dalam air steril selama 10 minit, dan protein disekat menggunakan Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA). Bahagian kemudian diinkubasi dengan antibodi anti-Clr-f monoklonal anti tikus tikus pada 4 darjah semalaman. Keesokan harinya, slaid dibilas dengan 0.1 M PBS dan diinkubasi selama 1 jam dalam antibodi sekunder. Pewarnaan dibangunkan menggunakan kit HRP-Polymer Goat-on-Rodent (Biocare Medical) dan Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), diikuti dengan pewarnaan balas hematoxylin. Proses yang sama digunakan untuk mengotorkan bahagian tisu buah pinggang untuk pelabelan IHC bagi sel NKp46+ dan CD3+, menggunakan anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, klon 29A1.4, CAT# 48-3351-82) dan anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) masing-masing sebagai antibodi utama. Pelabelan IHC F4/80 dilakukan pada bahagian buah pinggang beku menggunakan antibodi BM8 monoklonal anti-F4/80 tikus. Antibodi sekunder konjugasi IgG H&L HRP anti-tik kambing (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) telah digunakan seperti di atas dan IHC telah dibangunkan dengan, substrat lobak kuda peroksidase (HRP) telah digunakan Kit Substrat DAB (Abcam, CAT# ab64238).
Imunofluoresensi.
Buah pinggang dan/atau tisu usus tikus WT dan Clr-f −/− yang dipadankan dengan umur dan jantina telah dipelihara dalam 30% sukrosa pada −80 darjah dalam sebatian suhu pemotongan optimum Tissue-Tek (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Amerika Syarikat). Bahagian kriostat 20 μm telah ditetapkan dengan aseton dalam hud wasap pada suhu bilik selama 16 minit dan dikeringkan selama sekurang-kurangnya 30 minit, selepas dicuci dalam 0.01 M PBS, pH 7.4. Pengikatan tidak spesifik telah disekat dengan 10% serum keldai. Bahagian diinkubasi semalaman pada 4 darjah dengan antibodi utama: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (antibodi monoklonal anti-tikus yang diterangkan sebelum ini7), anti-IgA (rantai alfa IgA anti-tikus kambing (Abcam, Cambridge). , UK CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA CAT#A21042), Complement C3 Anti body (11H9 ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116), dan anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) pada kepekatan 1:100 dalam 5% serum normal dalam ruang lembap. Pelabelan antibodi sekunder anti Antibodi Clr-f dan anti-NKR-P1G menggunakan antibodi poliklonal terkonjugasi FITC dilakukan di RT selama pengeraman 1 jam. Sampel ialah nuklear DAPI yang diwarnai di RT selama 5 minit, dibasuh dengan PBS, dan dipasang pada slaid kaca dengan satu titisan VECTASHIELD Media pelekap antiludar PLUS (Vector Laboratories, San Francisco, CA, USA) dan ditutup dengan penutup kaca. Slaid diperiksa menggunakan mikroskop confocal pengimbasan laser Zeiss LSM 510.
Pemarkahan histologi dan patologi.
Bahagian buah pinggang WT yang dipadankan dengan umur dan jantina, Clr-f −/−, Rag1−/− dan Rag1−/−Clr-f −/− tikus (3 μm) telah diwarnakan dengan asid berkala-Schif (PAS). Tisu buah pinggang dinilai untuk selular mesangial (ditakrifkan sebagai 4 atau lebih nukleus setiap kawasan mesangial), percambahan endokpilari, bulan sabit, dan sklerosis glomerular. Bahagian juga dinilai untuk kehadiran tubulopati, fibrosis interstisial, atrofi tiub, dan infiltrat sel tubulointerstitial. Untuk pemarkahan patologi glomeruli skor separuh kuantitatif digunakan untuk menilai tahap kerosakan glomerular. Sekurang-kurangnya 50 glomeruli dalam setiap kumpulan telah diperiksa dan keterukan lesi telah digredkan daripada 0 hingga+3: satu+1 lesi mewakili penglibatan Kurang daripada atau sama dengan 30% daripada glomerulus,+2 sebanyak 30–60%, manakala+3 lesi menunjukkan Lebih daripada atau sama dengan 60% glomerulus terlibat. Pengukuran ketebalan GBM dilakukan pada mikrograf elektron glomerular WT dan Clr-f −/− menggunakan Imej J V1.53a47. Tisu buah pinggang yang diwarnai PAS daripada dua tikus Rag1−/− dan dua tikus Rag1−/−Clr-f −/− juga dijaringkan secara membuta tuli untuk kehadiran ciri patologi di atas, dan ciri yang dikira dikira daripada purata empat bahagian buah pinggang setiap tetikus.
Mikroskopi elektron.
Memproses tisu untuk mikroskop elektron penghantaran mengikut protokol yang diterbitkan48. Secara ringkasnya, kepingan kecil tisu buah pinggang daripada tikus WT dan Clr-f −/− 12-minggu telah ditetapkan dalam larutan glutaraldehid 2.5% dan kemudian diproses menggunakan kaedah osmium tetroksida/uranil asetat 1%. Sampel telah dibenamkan dalam resin Epon Araldite sebelum dipotong menggunakan ultramikrotom E ultra potong Reichert-Jung. Sampel telah divisualisasikan pada mikroskop elektron penghantaran JEOL JEM 1230 dan imej telah ditangkap menggunakan kamera digital Hamamatsu ORCA-HR.
Urin dan plasma sisa kimia dan pengukuran elektrolit.
Kira-kira 150 μL air kencing dikumpul setiap hari daripada 12-tikus WT jantan dan Clr-f −/− pada masa yang sama selama 5 hari berturut-turut. Air kencing disentrifugasi pada 10,000 rpm untuk membuang serpihan dan kemudian disimpan pada −80 darjah . Darah urat muka dikumpul daripada tikus yang sama dalam tiub heparin dan diasingkan dengan sentrifugasi pada 3000g selama 5 minit dan disimpan pada -80 darjah. Sampel air kencing dan plasma dihantar ke Makmal Idexx (Markham, Ontario) untuk pengukuran kepekatan protein, kreatinin dan elektrolit.
Pengukuran tekanan darah pada tikus berumur 12 dan 24 minggu. Tekanan darah sistolik dan diastolik (BP) diukur dengan plethysmography cuff ekor pada tikus WT dan Clr-f −/− 12 dan 24-minggu pada tikus pada keadaan mantap menggunakan model Visitech BP2000. BP diukur setiap hari di dalam bilik yang sama dan pada jam yang sama dalam sehari selama 5 hari berturut-turut. Nilai BP bagi 3 ukuran berturut-turut terakhir digunakan untuk mengira nilai purata BP kerana 2 hari pertama dianggap penting untuk penyesuaian tikus.
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30× 106 kedalaman bacaan bagi setiap sampel.
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 dan lipatan log menukar keratan 1.5. Nilai FPKM untuk semua titik masa dan sampel disediakan (Fail Set Data Tambahan 1). Analisis pengayaan fungsional. Ontologi gen dan Analisis Pengayaan Fungsian dilakukan menggunakan g: Profiler (versi e102_cth49_p15_7a9b4d6) dengan g: kaedah pembetulan ujian berbilang SCS yang menggunakan ambang keertian 0.05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 dan Sistem Klasifikasi PANTHER dengan ujian Fisher's Exact dan ambang FDR<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
Rangkaian pengayaan berfungsi telah dicipta menggunakan set gen Proses Biologi GO (GO: BP) untuk Mus Musculus (GRCm38. p6) Keluaran BioMart: 2020-12-08 dimuat turun daripada g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Analisis Pengayaan Set Gen (GSEA) dilakukan menggunakan GSEA V4.0354,55 menggunakan pengayaan Rangkaian berdasarkan FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
Analisis lipid perut dan ektopik. Pengumpulan lemak ditentukan oleh berat lemak perut yang dibedah daripada tikus individu. Pengukuran berat badan diambil sebelum pengekstrakan lemak. Untuk pewarnaan Minyak Merah O (ORO), bahagian buah pinggang beku dipotong pada 10 μm menggunakan cryostat dan kemudian dikeringkan di udara selama 30 minit. Pewarnaan ORO dilakukan dengan membetulkan bahagian dengan 3 cucian 60% isopropanol, mengeramkannya dengan kepekatan kerja (66%) larutan ORO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 15 minit. Slaid kemudiannya dibasuh dengan cepat dengan 60% isopropanol, dengan cepat diwarnakan dengan hematoxylin Mayer untuk menyerlahkan nukleus, dan kemudian dipasang menggunakan VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories).
Analisis pathotype. Analisis pathotype dilakukan menggunakan Diferentially Expressed Gens (DEGs) dengan q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
Tisu tercerna disalurkan melalui penapis nilon 70-μm, PBS dicuci, dan sel merah yang selebihnya dilisiskan dengan penimbal lysing ACK selama 5 minit di atas ais. Sel imun buah pinggang telah diasingkan dengan sentrifugasi RT pada 2000 rpm selama 30 minit dalam 40% Percoll. Pelet sel telah digantung semula dalam PBS dan bilangan sel diperolehi oleh hemocytometer. Pelbagai mAb digunakan untuk mengesahkan ekspresi protein permukaan sel, sel telah diwarnai untuk analisis fow cytometri dengan antibodi tikus berlabel fluorochrome: anti-CD45 (eBiosains, klon 30-F11), anti-TCR (eBiosains, klon H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBiosains, klon PK136), anti-CD19 (BioLegend, klon 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, klon M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, klon BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, klon M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, klon 1A8), anti-NKp46 (eBiosains, klon 29A1.4) dan kawalan isotaip. Daya maju sel ditentukan menggunakan Pewarna Daya Daya Betulkan (eBioscience, Cat# 65-0865-14). Untuk mengenal pasti dan mengukur populasi sel imun dalam buah pinggang WT dan Clr-f −/−, analisis fow cytometry multiparametrik menggunakan antibodi terhadap penanda khusus sel digunakan untuk mengenal pasti neutrofil (CD11b+Ly6G+), makrofaj (CD11b+Ly6G−F4/{ {57}}MHCII+), sel NK (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+), dan sel NKp46+ (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), sel T (Ly6G−NK1 .1−TCR +) dan sel B (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Semua sampel diperolehi pada sitometer fow BD-Fortessa.
Rujukan
1. Hato, T. & Dagher, PC Bagaimana sistem imun semula jadi merasakan masalah dan menyebabkan masalah.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1459–1469 (2015).
2. Krüger, T.et al.Pengenalpastian dan pencirian fungsi sel dendritik dalam buah pinggang murine yang sihat dan dalam eksperimenglomerulonephritis.J. Am. Soc. Nephrol.15, 613–621 (2004).
3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Sel dendritik dan makrofaj: Sentinel dalam buah pinggang.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1841–1851 (2015).
4. Woltman, AMet al.Kuantifikasi subset sel dendritik dalam tisu buah pinggang manusia di bawah keadaan normal dan patologi.Buah Pinggang Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Sel dendritik yang bergantung kepada Batf3-dalam nodus limfa buah pinggang mendorong toleransi terhadap antigen yang beredar.J. Am.Soc. Nephrol.24, 543–549 (2013).
6. Zhang, Q.et al.Nkrp tetikus1-Jujukan gugusan gen Clr dan analisis ekspresi mendedahkan pemuliharaan MHC khusus tisupengawasan imun bebas.PLoS One7, e50561 (2012).
7. Leibelt, S.et al.Imunosensing khusus epitelium usus tikus yang difasilitasi oleh sepasang seperti lektin yang digabungkan secara genetikreseptor.Immunol mukosa.
8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.Tetikus NKR-P1B: Sistem pengecaman Clr-b ialah pengawal selia negatif bagi tindak balas imun semula jadi.darah125, 2217–2227 (2015).
9. Carlyle, JRet al.Hilang pengiktirafan diri Ocil/Clr-b oleh reseptor sel pembunuh semulajadi NKR-P1 yang menghalang.Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004).
10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: Molekul seperti lektin jenis C berkaitan imun yang diekspresikan secara eksklusif oleh epitelium usus tikus.J. Immunol.198, 916–926 (2017).
11. Balaji, GRet al.Pengiktirafan hos Clr-b oleh reseptor NKR-P1B yang menghalang menyediakan asas untuk pengecaman diri yang hilang.Nat.Commun.9, 4623 (2018)
12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Pilih ungkapan Clr-g pada sel dendritik yang diaktifkan memudahkan interaksi serumpundengan subset kecil sel NK splenik yang menyatakan reseptor Nkrp1g yang menghalang.J. Immunol.200, 983–996 (2018).
13. Abou-Samra, E.et al.Ekspresi NKR-P1B dalam sel limfoid semula jadi yang berkaitan dengan usus diperlukan untuk mengawal gastroususjangkitan saluran.sel. Mol. Immunol.16, 868–877 (2019).
14. Germain, C.et al.Pencirian varian transkrip yang disambung secara alternatif bagi gen CLEC2D.J. Biol. Kimia.285, 36207–36215 (2010).
Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:
E-mel:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
