Cistanche Deserticola Polysaccharides Meningkatkan Penuaan Usus Dengan Menghalang Pengaktifan Inflammasom NLRP3

 

 

Penuaan membawa kepada penurunan beransur-ansur pelbagai fungsi fisiologi dan meningkatkan risiko penyakit berkaitan usia [1]. Kajian telah menunjukkan bahawa penuaan mempunyai kesan yang signifikan terhadap struktur dan fungsi usus [2]. Sebagai organ teras untuk pencernaan, metabolisme, dan pertahanan imun, penuaan usus boleh menyebabkan malabsorpsi nutrien, gangguan metabolik, dan fungsi imun terjejas [3-4], dengan itu meningkatkan kerentanan kepada penyakit gastrousus [5]. Keradangan kronik adalah ciri penuaan usus, tetapi mekanisme molekulnya masih belum dijelaskan sepenuhnya. Pada masa ini, agen anti-penuaan terutamanya termasuk beta-nicotinamide mononucleotide (NMN), rapamycin, dasatinib plus quercetin, dan lain-lain [3]. Antaranya, NMN ialah pendahulu utama koenzim penting NAD+, dan pelbagai kajian telah mengesahkan bahawa ia melambatkan penuaan usus dengan ketara pada tikus yang berumur secara semula jadi; ia diiktiraf secara meluas di lapangan sebagai intervensi yang berkesan [4–5]. Oleh itu, meneroka mekanisme yang berkaitan dan strategi intervensi adalah sangat penting.

Cistanche Oral Liquor Untuk Penyakit Berkaitan Penuaan

Hubungi sekarang kenali petani cistanche di china

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:
E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Radang 3 (NLRP3) yang mengandungi domain oligomerisasi seperti reseptor keluarga reseptor nukleotida 3 (NLRP3) adalah pengawal selia utama imuniti semula jadi dan memainkan peranan penting dalam penyakit berkaitan penuaan. Pengaktifannya memerlukan dua isyarat. Isyarat pertama: corak molekul berkaitan patogen (PAMP) dan corak molekul berkaitan kerosakan (DAMP) mendorong ekspresi NLRP3 dan prekursor interleukin-1 (pro-IL-1 ). Isyarat kedua (seperti pelepasan kalium dan kerosakan mitokondria) mencetuskan pemasangan inflammasom, mengaktifkan caspase-1, dan membelah pro-IL-1 dan pro-IL-18 untuk menjana IL-1 dan IL-18 matang, dengan itu mendorong keradangan [6]. Semasa penuaan, homeostasis usus terganggu, membawa kepada pembebasan faktor pro-radang seperti lipopolysaccharide (LPS), yang secara berterusan mengaktifkan inflammasom NLRP3, membentuk keradangan gred rendah kronik. Ini memburukkan lagi kerosakan halangan usus dan dysbiosis, mengubah ekspresi protein simpang ketat, meningkatkan kebolehtelapan usus, dan mempercepatkan penuaan usus [7-10].

Cistanche deserticola, herba perubatan tradisional Cina yang terkenal dan homolog makanan yang dikenali sebagai "ginseng padang pasir", menguatkan buah pinggang, menyuburkan pati dan darah, dan melembapkan usus untuk melegakan sembelit. Polisakarida aktifnya mempamerkan ciri anti-penuaan, antioksidan, dan pelindung usus [11-12]. Dari segi perlindungan usus, Cistanche deserticola polysaccharides (CDPs) boleh memodulasi keseimbangan mikrobiota usus dengan menghalang pengaktifan laluan Toll-like receptor 4 (TLR4)/faktor nuklear-kappa B (NF-κB), dengan itu mengurangkan tahap LPS dan membaiki fungsi penghalang usus. [13–14]. CDP juga boleh meningkatkan fungsi mitokondria melalui pengaktifan laluan protein kinase (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1) yang diaktifkan AMP, melambatkan penuaan selular, mengawal metabolisme lipid, dan mengurangkan kecederaan lipotoksik dalam sel epitelium usus [15].

Walaupun kesan perlindungan usus CDP telah ditunjukkan, masih tidak jelas sama ada ia memperbaiki penuaan usus dengan menekan laluan inflammasom NLRP3. Kajian ini bertujuan untuk menyiasat mekanisme di mana CDP menghalang pengaktifan inflammasom NLRP3 untukmeningkatkan penuaan usus.

Bahan

 

1.1 Haiwan eksperimen

Lima puluh tikus C57BL/6J jantan yang sihat (10 pada umur 2 bulan; 40 pada umur 20 bulan) telah dibeli daripada Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Lesen pengeluaran: SYXK (Beijing) 2023-0011. Haiwan ditempatkan dalam persekitaran penghalang di Kemudahan Haiwan Eksperimen Hospital Daerah Perubatan Tradisional Cina Hebei di bawah keadaan berikut: suhu 22 ± 2 darjah, kelembapan relatif 50% ± 10%, dan kitaran gelap 12 jam/12 jam. Semua tikus diadaptasikan selama 1 minggu. Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Hospital Daerah Hebei Perubatan Tradisional Cina (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Instrumen dan reagen

 

Cryostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Mikroskop confocal pengimbasan laser (Nikon; AX)

Sistem PCR masa nyata (Thermo Fisher; 7500)

Pembaca plat berbilang mod (Tecan; Spark)

Beta-nikotinamide mononucleotide (Bontac, China; Cat. BT05N120A005)

Kit pewarnaan SA- -gal (Solarbio, Beijing; Kucing. 250003003)

Kit LPS ELISA tetikus (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Cat. CSB-E13066m)

Kit RNA TransZol Up Plus (TransGen Biotech, Beijing; Cat. ER501-01-V2)

MonAmp ChemoHS qPCR Mix (Monad; Cat. MQ00501S)

Antibodi poliklonal Lgr5 (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 antibodi monoklonal, antibodi monoklonal NLRP3, antibodi monoklonal Caspase-1, antibodi monoklonal ASC, antibodi monoklonal GAPDH, antibodi monoklonal Ki67 (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179515, ab9494, ab9494)

Kaedah

 

2.1 Penyediaan polisakarida deserticola Cistanche

Bahan cistanche (50 g) diekstrak dua kali dengan merebus dengan isipadu 8 kali ganda air, 1 jam setiap kali. Penapisan digabungkan dan disejukkan ke suhu bilik. Etanol kontang ditambah kepada kepekatan akhir 80% untuk pemendakan. Selepas sentrifugasi, supernatan dibuang. Mendakan dilarutkan dalam air, didialisis, kemudian diliofilkan untuk mendapatkan sampel.

 

2.2 Pengumpulan dan pentadbiran haiwan

Selepas penyesuaian, empat puluh tikus C57BL/6J berusia 20 bulan secara rawak diberikan kepada: kumpulan penuaan semula jadi, kumpulan CDP dos rendah (2.5 g·kg−1), kumpulan CDP dos tinggi (5.0 g·kg−1), dan kumpulan NMN (200 mg·kg−1). Sepuluh tikus tambahan SPF C57BL/6J berusia 2 bulan berfungsi sebagai kumpulan kawalan muda. Dos CDP rendah dan tinggi diberikan melalui gavage oral pada 2.5 g·kg−1 dan 5.0 g·kg−1, masing-masing. Menggunakan penukaran kawasan permukaan badan dan faktor penukaran manusia-ke-tikus sebanyak 12 [16], ini sepadan dengan kira-kira 1× dan 2× dos setara klinikal dewasa. Kumpulan NMN menerima NMN 200 mg·kg−1 secara gavage. Kawalan muda dan kumpulan penuaan semulajadi menerima jumlah garam fisiologi yang sama (10 mL·kg−1). Rawatan diberikan secara berterusan selama 2 bulan.

 

2.3 Penyediaan bahagian beku

Tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal natrium pentobarbital (30 mg·kg−1) dan dimatikan. Perut dibuka dengan cepat, mesenterium dipisahkan, dan tisu ileal dikumpulkan dan dipotong pada 5 μm untuk bahagian beku [17].

 

2.4 SA- -gal assay untuk aktiviti -galactosidase usus

Pewarnaan dilakukan mengikut - -arahan kit gal SA. Selepas pengeraman, larutan pewarna dikeluarkan dan bahagiannya dibasuh dengan PBS. Imej dikumpulkan menggunakan mikroskop terbalik.

 

2.5 PCR masa nyata untuk fenotip rembesan berkaitan penuaan (SASP)

Jumlah RNA daripada tisu ileal telah diekstrak menggunakan kit TransZol Up Plus. Transkripsi terbalik dilakukan dengan sistem GoScript di bawah keadaan berikut: 42 darjah selama 15 minit, 70 darjah selama 15 minit, 4 darjah selama 10 minit. PCR masa nyata telah dijalankan menggunakan MonAmp ChemoHS qPCR Mix dengan kayuhan berikut: 95 darjah 10 min; kemudian 40 kitaran 95 darjah 15 s, 60 darjah 1 min. Lengkung cair: 95 darjah 15 s, 60 darjah 15 s, 95 darjah 15 s. GAPDH berfungsi sebagai rujukan dalaman, dan kuantifikasi relatif menggunakan kaedah 2^-ΔΔCt. Primer dibeli daripada Promega. Urutan primer ditunjukkan dalam Jadual 1.

 

2.6 Pewarnaan imunofluoresensi untuk ekspresi ZO-1.

Tisu ileal telah ditetapkan dalam 4% paraformaldehid dan parafin-sectioned pada 5 μm. Bahagian telah telap dengan 0.3% Triton X-100 selama 15 minit dan disekat dengan 10% serum kambing selama 1 jam pada suhu bilik. Antibodi utama terhadap ZO-1 (1:200) telah digunakan semalaman pada 4 darjah . Selepas mencuci PBS, antibodi sekunder konjugasi Cy3 (1: 500) diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dalam gelap. Nukleus telah diwarnai balas dengan DAPI selama 5 minit. Slaid telah dipasang dengan medium antiludar dan diimejkan oleh mikroskop confocal. Keamatan pendarfluor dikira menggunakan perisian Image-Pro.

2.7 Imunohistokimia untuk ekspresi Ki67 dan Lgr5

Bahagian ileal diinkubasi dengan antibodi primer Ki67 (1:1000) dan Lgr5 (1:200) semalaman pada 4 darjah mengikut protokol kit IHC, kemudian dengan antibodi sekunder yang sepadan. DAB digunakan untuk pembangunan kromogenik. Keputusan telah diperhatikan oleh mikroskop cahaya. Purata ketumpatan optik dikira menggunakan perisian Image-Pro.

 

2.8 ELISA untuk tahap LPS

Piawaian dan sampel (100 μL setiap telaga) telah ditambah ke dalam plat dan diinkubasi pada suhu bilik selama 1.5 jam. Larutan streptavidin konjugasi HRP (100 μL setiap telaga) kemudian ditambah dan diinkubasi selama 30 minit. Substrat ditambah di bawah keadaan terlindung cahaya dan bertindak balas selama 30 minit. Tindak balas telah ditamatkan dengan larutan henti, dan penyerapan diukur pada 450 nm.

 

2.9 Western blot untuk NLRP3, Caspase-1 dan ASC

Kira-kira 30 mg tisu ileal dikisar dalam nitrogen cecair. Penampan lisis RIPA yang mengandungi perencat protease/fosfatase telah ditambah; lisat diinkubasi pada ais selama 30 minit dan disentrifugasi pada 12,000 × g, 4 darjah selama 15 minit untuk mengumpul supernatan. Kepekatan protein ditentukan oleh ujian BCA dan diselaraskan kepada 2 ug/μL. Jumlah protein yang sama (20-40 ug) dipisahkan oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF. Membran disekat dengan 5% susu tanpa lemak selama 1 jam pada suhu bilik, diinkubasi dengan antibodi primer (NLRP3 1:1000, Caspase-1 1:500, ASC 1:1000) semalaman pada 4 darjah , kemudian dengan antibodi sekunder konjugasi HRP (1:5000 bilik) selama 1 jam. Selepas mencuci TBST, isyarat telah dibangunkan. Keamatan jalur telah dinormalisasi kepada GAPDH.

 

2.10 Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Analisis statistik dan graf dilakukan masing-masing menggunakan SPSS 26.0 dan GraphPad Prism 8.0.2. ANOVA sehala digunakan untuk menilai perbezaan antara kumpulan, diikuti dengan ujian post hoc Tukey. Kepentingan statistik ditetapkan pada P <0.05.

 

Nota praktikal untuk pembaca yang berminat dengan motilitas usus dan pembangunan suplemen

 

Fokus fungsi Cistanche deserticola: Digunakan secara tradisional untuk melembapkan usus dan melegakan sembelit; sokongan halangan sokongan data moden, modulasi keradangan (TLR4/NF-κB), dan fungsi mitokondria melalui AMPK/SIRT1.

Mekanisme usus anti-penuaan yang berpotensi diterokai di sini: Penindasan pengaktifan inflammasom NLRP3; pengurangan keradangan gred rendah yang didorong oleh LPS; pemeliharaan persimpangan ketat (cth, ZO-1); penyelenggaraan penanda percambahan epitelium/batang (Ki67, Lgr5).

Dos oral percubaan biasa pada tikus: 2.5–5.0 g·kg−1 CDP selama 2 bulan; NMN 200 mg·kg−1 sebagai kawalan positif.

Awas translasi: Dos tetikus bukan cadangan manusia langsung. Kajian ini menggunakan penskalaan kawasan permukaan badan; perumusan dan keselamatan yang setara dengan manusia, ujian identiti dan pembuatan GMP adalah perlu sebelum pembangunan produk.