Mengedarkan MiRNA dalam Pesakit Diabetes Jenis 2 Dengan Albuminuria Dan Tanpa Albuminuria di Malaysia

Abstrakpengenalan: Penyakit buah pinggang kencing manis(DKD) kekal sebagai punca utama penyakit buah pinggang kronik. Disregulasi miRNA yang beredar telah dilaporkan, mencadangkan peranan patologi mereka dalam DKD. Kajian ini bertujuan untuk menyiasat miRNA yang dinyatakan secara berbeza dalam sera pesakit diabetes mellitus jenis 2 (T2DM) dengan dan tanpa albuminuria dalam populasi Malaysia terpilih.Kaedah:Empat puluh satu pesakit T2DM pada susulan di klinik komuniti dibahagikan kepada kumpulan normal-(NA), mikro (MIC), dan makroalbuminuria (MAC). Tahap pembezaan miRNA dalam 12 sampel ditentukan menggunakan tatasusunan miScript miRNA qPCR yang berfokus pada laluan (fibrosis manusia) dan telah disahkan dalam 33 sampel, menggunakan susunan qPCR tersuai miScript (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hilden, Jerman).Keputusan:Trend peningkatan regulasi 3 miRNA dalam serum, iaitu, miR-874-3p, miR-101-3p dan miR-145-5p pesakit T2DM dengan MAC berbanding mereka yang mempunyai NA. Kawal selia yang ketara secara statistik bagi miR- 874-3p (p= 0.04) dan miR-101-3p (p= 0.01) dilihat dalam kohort pengesahan. Korelasi negatif yang ketara antara anggaran kadar penapisan glomerular (eGFR) dan miR-874-3p (p= 0.05), miR-101-3p (p= 0.03), dan miR-145-5p (p= 0.05) serta korelasi positif antara miR-874-3p dan umur (p= 0.03) ditunjukkan oleh analisis pekali korelasi Pearson.Kesimpulan:Penyelarasan miRNA yang diketahui sebelum ini, iaitu, miR-145-5p, dan mungkin yang baru, iaitu, miR-874-3p dan miR-101-3p dalam serum pesakit T2DM, ditemui dalam kajian ini . Terdapat korelasi yang signifikan antara eGFR dan miRNA ini. Penemuan kajian ini telah memberikan bukti yang menggalakkan untuk menyiasat lebih lanjut peranan yang diduga miRNA yang dinyatakan secara berbeza ini dalamDKD.

Klik untuk cistanche herba untuk penyakit buah pinggang

pengenalan

Penyakit buah pinggang diabetes (DKD) menyumbang 39% daripada kejadian penyakit buah pinggang peringkat akhir di Amerika Syarikat [1]. Begitu juga, DKD terus menjadi punca utama penyakit buah pinggang kronik (CKD) di Malaysia, menyumbang kepada 69% pesakit dialisis baharu pada 2018 [2]. Patologi DKD dianggap didorong terutamanya oleh hiperglikemia, mengakibatkan pengaktifan laluan isyarat intraselular dan akhirnya fibrosis buah pinggang [3]. Walaupun kemajuan dalam pengurusan, biomarker dan terapi semasa gagal menghalang perkembangannya kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir [3]. Oleh itu, pemahaman yang lebih baik tentang pengantara dan mekanisme DKD amat diperlukan.

Asid mikroribonukleik (miRNA) ialah keluarga RNA bukan pengekodan kecil yang telah muncul sebagai pengawal selia pasca-transkrip penting bagi ekspresi gen [4]. Ekspresi aber miRNA dan penglibatan mereka dalam mekanisme selular DKD telah diperhatikan [3]. Kajian ini bertujuan untuk mengenal pasti corak ekspresi miRNA terpilih dalam sera pesakit diabetes mellitus jenis 2 (T2DM) dengan dan tanpa albuminuria. Di seluruh dunia, kajian serupa telah dilakukan dalam pelbagai populasi, seperti yang dikaji sebelum ini [5-7]. Kami berhasrat untuk menyiasat corak ekspresi pembezaan pemilihan miRNA yang dikaitkan dengan laluan fibrotik dalam pesakit T2DM, beberapa daripadanya telah dikaji sebelum ini dalam DKD. Kajian terdahulu telah mencadangkan perbezaan berkaitan etnik dalam ekspresi miRNA [8, 9]. Oleh itu, selain dapat mengesahkan penemuan terdahulu, kajian ini mungkin berpotensi mendedahkan miRNA novel, mungkin secara unik dinyatakan dalam populasi Malaysia.

Bahan dan Kaedah

Populasi Kajian

Kajian keratan rentas ini melibatkan 41 pesakit T2DM sedia ada pada susulan di klinik komuniti, dari Januari hingga April 2019. Kajian ini melibatkan 2-prosedur langkah: (1) miRNA dalam sera 12 pesakit (kohort saringan ) telah diprofilkan dan (2) miRNA yang paling relevan telah disahkan dengan sera daripada 33 pesakit (dirujuk sebagai kohort pengesahan). Ini termasuk 4 pesakit daripada kohort pemeriksaan. Persetujuan bertulis diperoleh daripada pesakit individu. Kelulusan etika untuk kajian ini diperoleh daripada Jawatankuasa Penyelidikan dan Etika Perubatan (MREC), Kementerian Kesihatan Malaysia. Kriteria kemasukan adalah pesakit T2DM dan maklumat klinikal dan makmal yang tersedia. Pesakit dengan DM jenis 1; bukan DKD; komorbiditi seperti kanser, penyakit demam akut, atau jangkitan baru-baru ini; kehamilan; dan selepas bersalin dikecualikan.

Maklumat mengenai perkara berikut telah diambil daripada rekod perubatan pesakit: (1) data demografi termasuk umur dan jantina; (2) data klinikal seperti tekanan darah, berat badan, tempoh T2DM, rawatan, dan komplikasi diabetes yang lain; (3) data makmal termasuk glukosa plasma puasa, hemoglobin terglikasi A1c (HbA1c), nisbah albumin kepada kreatinin, dan kreatinin serum. Pesakit dibahagikan kepada 3 kumpulan mengikut tahap albuminuria mereka, normoalbuminuria (NA), mikroalbuminuria (MIC), dan makroalbuminuria (MAC).

Definisi

Dalam kajian ini,

NA, MIC, dan MAC ditakrifkan sebagai nisbah albumin kepada kreatinin daripada<30, between 30 and 300 and >300 mg/g kreatinin, masing-masing, dalam sekurang-kurangnya 2 daripada 3 pengumpulan air kencing tempat [10]. Anggaran kadar penapisan glomerular (eGFR) dikira berdasarkan persamaan kreatinin Penyakit Buah Pinggang Kronik-Epidemiologi.

Penyediaan Serum

Vacutainer Sampel darah puasa yang dikumpul ( Kurang daripada atau sama dengan 8 jam) seluruh darah dalam 10-mL BD ®SSTTM tiub (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) dibiarkan pada suhu bilik selama 30-min pembekuan sebelum 10- min sentrifugasi pada 1.900 g. Fasa atas telah dituai, ditapis dengan penapis Minisart®PES 0.22-μm (Sartorius, Göttingen, Jerman) dan diasingkan ke dalam tiub microcentrifuge untuk penyimpanan pada −80 darjah sehingga analisis.

Jumlah miRNA

Pengasingan Jumlah miRNA telah diasingkan menggunakan Kit Serum/Plasma miRNeasy (Qiagen GmbH) mengikut protokol pengeluar. Secara ringkasnya, Reagen Lysis Qiazol telah ditambah kepada aliquot 200 μL serum untuk denaturasi diikuti oleh miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNA mimic (Qiagen GmbH) untuk memantau pemulihan RNA dan membalikkan kecekapan transkripsi. Kloroform telah ditambah untuk pengasingan fasa diikuti dengan penambahan etanol 100% kepada fasa akueus atas. Langkah-langkah bilas dicapai oleh Penampan RWT, Penampan RPE, dan 80% etanol. RNA telah dielusi dengan menambahkan 14 μL air bebas RNase ke membran lajur spin RNeasy MinElute. Kuantiti dan kualiti RNA ditentukan oleh spektrofotometer NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA), sebelum disimpan pada -80 darjah sehingga digunakan. Transkripsi terbalik (RT) miRNA kepada cDNA dan preamplifikasi dilakukan dengan kit miScript RTII (Qiagen GmbH) dan Kit PCR PreAMP miScript (Qiagen GmbH), mengikut protokol pengeluar, menggunakan 6 μL template RNA dan 5 μL yang dicairkan. cDNA, masing-masing

Analisis Tindakbalas Rantaian Polimerase Masa Nyata Kuantitatif

MiRNA yang beredar dalam serum kohort saringan telah dikenal pasti oleh tatasusunan miRNA qPCR miScript (Qiagen GmbH) yang tertumpu pada laluan (fibrosis manusia), dan miRNA terpilih kemudiannya disahkan dalam kohort pengesahan dengan susunan miRNA qPCR miScript tersuai (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) mengikut arahan pengilang. Setiap tindak balas termasuk templat cDNA, 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, dan air bebas RNase, dan templat cDNA yang dicairkan untuk membentuk jumlah keseluruhan 25 μL. PCR masa nyata kuantitatif telah dilakukan pada Eppendorf Mastercycler ep realplex 4, yang telah diprogramkan seperti berikut: 15 minit pada 95 darjah, 15 saat pada 94 darjah, 30 saat pada 55 darjah, dan 30 saat pada 70 darjah dengan 40 kitaran.

Kuantifikasi relatif miRNA

Analisis data PCR masa nyata dilakukan menggunakan perisian Pusat Analisis Data Qiagen Gene Globe (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Ekspresi relatif (RE) diperolehi oleh kaedah 2−∆Ct, di mana ekspresi setiap miRNA dinormalisasikan kepada gen pengemasan SNORD95 atau Global Ct Mean. Perubahan lipatan dikira daripada ekspresi miRNA yang dinormalisasi dalam setiap kumpulan (MIC atau MAC) dibahagikan dengan ekspresi miRNA yang dinormalisasi dalam kumpulan kawalan (NA). nilai p dikira berdasarkan ujian-t sampel tidak bergantung bagi nilai RE (2−∆Ct) replika untuk setiap gen dalam kumpulan kawalan dan kumpulan ujian. Pengesahan selanjutnya analisis data qPCR dilakukan secara manual menggunakan Microsoft Excel dan IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp, Ar monk, NY, USA) keluaran 25 untuk perisian Microsoft Windows.

Pemilihan miRNA dalam Kohort Saringan untuk Pengesahan

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 dianggap sebagai ungkapan negatif, seperti yang disyorkan oleh Pusat Analisis Data Qiagen GeneGlobe (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Jadual tambahan dalam talian 1 (untuk semua bahan bekalan dalam talian, lihat www.karger.com/doi/10.1159/000518866) menunjukkan RE sebanyak 84 miRNA dalam kohort saringan dinormalkan kepada purata Ct global. MiRNA dengan perubahan ±2.0-kali ganda yang ketara dan kualiti yang baik telah dipilih untuk pengesahan, seperti yang ditakrifkan oleh perisian. Di samping itu, miRNA lain dipilih berdasarkan kedudukan nilai p mereka dan penglibatan mereka dalam kajian terdahulu dalam laluan berkaitan DKD dan DKD, di mana miRNA dengan bilangan sasaran RNA messenger tertinggi telah dipilih. Jadual tambahan dalam talian 2 menunjukkan kriteria tambahan yang digunakan untuk pemilihan miRNA untuk pengesahan. Dalam analisis pengesahan, ekspresi miRNA telah dinormalisasi kepada SNORD95 kerana kaedah purata Ct global tidak sesuai dan Ct> 35 dianggap sebagai ungkapan negatif. Untuk menyeragamkan, kami menganalisis semula RE miRNA yang dipilih dalam kohort pemeriksaan berdasarkan normalisasi SNORD95, dan ini digunakan untuk analisis seterusnya berbanding dengan kohort pengesahan.

Analisis statistik

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >2 kumpulan bebas telah dilakukan menggunakan sampel bebas ujian Kruskal-Wallis (Jadual 1). Perbandingan pembolehubah kategori dilakukan menggunakan sama ada ujian χ2 bagi kontingensi atau ujian tepat Fisher (Jadual 1). Korelasi antara RE miRNA terpilih dan pembolehubah berterusan (data demografi dan klinikal) dilakukan menggunakan pekali korelasi Pearson. Ujian Regresi Berganda digunakan untuk menganalisis hubungan linear antara miRNA RE terpilih dan peramal pentingnya. Pengiraan statistik dilakukan menggunakan IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp) keluaran 25 untuk Microsoft Windows dan pakej program perisian statistik Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, USA). Kepentingan statistik ditakrifkan sebagai p < 0.05.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

DAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK JANGKITAN BUAH PINGGANG