Penyakit Buah Pinggang Kronik Meningkatkan Pendarahan Mikro Serebrum pada Tetikus Dan Manusia

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7

Diterima: 25 Ogos 2018 /Semakan: 28 Januari 2019 /Diterima: 22 Februari 2019 /Diterbitkan dalam talian: 4 Mei 2019

# Pengarang 2019

Cistancheboleh melegakanpenyakit buah pinggang

Abstrak

Pendarahan mikro otak meningkatkronikbuah pinggangpenyakit(CKD) dan kehadiran mereka meningkatkan risiko penurunan kognitif dan strok. Kami mengkaji interaksi antara CKD dan microhemorrhages otak (substrat neuropatologi mikrobleeds) dalam model tetikus dan kultur sel dan mengkaji perkembangan beban microbleed pada pengimejan otak bersiri daripada manusia. Kajian tetikus: Dua model CKD telah disiasat: nefritis tubulointerstitial yang disebabkan oleh adenine dan nefrectomy 5/6 pembedahan. Kajian kultur sel: bEnd.3 sel endothelial otak tetikus telah ditanam kepada pertemuan, dan integriti monolayer diukur selepas terdedah kepada 5–15 peratus serum uremik manusia atau peningkatan kepekatan urea. Kajian manusia: Kemajuan pendarahan mikro otak dinilai pada MRI bersiri daripada kawalan, CKD pra-dialisis, dan pesakit dialisis. Pendarahan mikro meningkat 2–2.5-kali ganda pada tikus dengan CKD bebas daripada tekanan darah yang lebih tinggi dalam model nefrektomi 5/6. Pewarnaan IgG telah meningkat pada haiwan CKD, selaras dengan peningkatan kebolehtelapan penghalang darah-otak. Pengeraman sel bEnd.3 dengan serum uremik atau urea tinggi menghasilkan penurunan rintangan elektrik trans-endothelial yang bergantung kepada dos. Kecelaruan sitoskeleton aktin disebabkan oleh urea yang tinggi dan ekspresi claudin{16}} berkurangan. Dalam subjek manusia, prevalens microbleeds adalah 50 peratus dalam kedua-dua kohort CKD berbanding dengan 10 peratus dalam kawalan padanan umur. Lebih ramai pesakit dalam kohort dialisis telah meningkatkan pendarahan mikro pada MRI susulan selepas 1.5 tahun. CKD mengganggu penghalang darah-otak dan meningkatkan pendarahan mikro otak pada tikus dan pendarahan mikro pada manusia. Urea yang tinggi mengubah sitoskeleton aktin dan protein simpang ketat dalam sel endothelial berbudaya, menunjukkan bahawa mekanisme ini menerangkan (sekurang-kurangnya sebahagiannya) pendarahan mikro dan pendarahan mikro yang diperhatikan dalam kajian haiwan dan manusia.

Kata kunci Penyakit buah pinggang kronik. Microbleeds. Model tetikus. Kultur sel endothelial. BrainMRI

untuk melegakankronikbuah pinggangpenyakit dengancistanche

pengenalan

Salah satu penemuan neurologi strok yang paling ketara dalam beberapa tahun kebelakangan ini ialah kemunculankronikbuah pinggangpenyakitmempunyai kesan yang melampaui faktor risiko tradisional seperti hipertensi dan diabetes [10, 11]. Memandangkan prevalens yang tinggi (kira-kira 50 peratus) pendarahan mikro serebrum dan gangguan kognitif pada pesakit dengan CKD lanjutan [2-4, 6, 7], hubungan ini patut dikaji lebih lanjut.

Pendarahan mikro serebrum adalah fokus kecil hemosiderin-besi yang boleh ditunjukkan pada pengimejan resonans magnetik (MRI), dipercayai mencerminkan pendarahan mikro serebrum yang mendasari [12, 13], dan menunjukkan peningkatan risiko strok, kedua-dua hemoragik dan iskemia [9, 14]. Urutan MRI khusus (gema kecerunan dan pengimejan berwajaran kerentanan) menunjukkan kawasan tumpuan kehilangan isyarat dalam parenchyma otak berukuran Kurang daripada atau sama dengan 10 mm [12, 15]. Pendarahan mikro serebrum bergantung kepada usia, dengan prevalens menghampiri 20 peratus pada usia 65 tahun [16]. Sebagai tambahan kepada umur, hipertensi dan angiopati amiloid serebrum adalah faktor risiko yang paling diterangkan untuk perkembangan microbleeds [13, 17]. Dalam CKD peringkat akhir, pendarahan mikro terdapat sehingga 50 peratus daripada populasi [2-4].

Pada masa yang sama, kemerosotan kognitif adalah lebih berleluasa dan lebih teruk pada tahap yang lebih rendahbuah pinggangfungsi[18], mencapai prevalens 30-70 peratus dalam pesakit dialisis kronik [6, 7]. Dalam analisis keratan rentas 338 pesakit hemodialisis berumur 55 tahun dan lebih tua dengan kawalan padanan umur, 34 peratus pesakit dialisis mengalami gangguan kognitif yang teruk berbanding dengan 12 peratus kawalan [6]. 35 peratus lagi daripada kohort dialisis mengalami gangguan kognitif sederhana [6].

Beberapa kajian dalam kohort bukan CKD telah menunjukkan hubungan yang kuat antara pendarahan mikro serebrum dan penurunan fungsi kognitif [19-22]. Data epidemiologi menyokong kewujudan bersama beban microbleed MRI dan disfungsi kognitif dalam pesakit penyakit buah pinggang peringkat akhir (ESRD) [8, 23]. Lebih-lebih lagi, laporan terbaru 28 pesakit dialisis kronik dengan MRI otak bersiri menunjukkan hubungan antara pendarahan mikro baru dan penurunan dalam skor pemeriksaan keadaan mental mini (MMSE) [4]. Selanjutnya, pesakit ESRD mempunyai 3- hingga 4-kali ganda kadar insiden kedua-dua strok iskemia dan hemoragik yang lebih tinggi berbanding dengan populasi umum [5]. Dalam kohort pesakit hemodialisis Jepun yang bebas strok pada peringkat awal, kehadiran pendarahan mikro serebrum adalah peramal bebas pendarahan intracerebral semasa 5-tempoh susulan tahun [9].

Di sini kami melaporkan hasil daripada kajian pada tikus dan pesakit CKD. Kami mendapati peningkatan mikrohemorrhages otak dalam tikus CKD dan menggambarkan persimpangan ketat endothelial terjejas dan gangguan sitoskeleton aktin sebagai mekanisme yang berpotensi untuk pembentukan mikrohemorrhage dalam lingkungan CKD. Analisis retrospektif MRI otak bersiri daripada subjek bukan CKD, pra-dialisis, dan hemodialisis kronik mengesahkan ESRD sebagai faktor risiko yang ketara untuk perkembangan beban microbleed.

Kaedah

Eksperimen tikus

Haiwan Eksperimen dan Kumpulan Rawatan

Dua model tetikus CKD telah disiasat. (1) Model nefritis tubulointerstitial adenine: Tikus C57BL/6J jantan dari Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) berumur 10– 12 minggu diberi diet yang mengandungi 0.2 peratus adenine selama 18 hari untuk mendorong nefropati interstisial kronik, diletakkan kembali pada chow biasa selama 2 minggu, dan kemudian terdedah semula kepada diet adenine selama 1 minggu untuk mengekalkan CKD (Rajah 1a). Tikus kawalan dikekalkan pada chow biasa. (2) Model nefrektomi 5/6: Tikus C57BL/6J jantan berumur 10 minggu menjalani pembedahan dua peringkat di Makmal Jackson yang melibatkan nefrektomi separa kiri diikuti dengan nefrektomi total kanan 1 minggu kemudian. Haiwan dihantar ke makmal 1 minggu selepas

pembedahan kedua. Kedua-dua model ini digunakan untuk menentukan kesan hipertensi; hipertensi adalah ciri utama model nefrektomi 5/6, manakala adenine-CKD adalah bukan hipertensi [24].

Haiwan CKD telah rawak kepada tiada lipopolysaccharide (LPS) atau suntikan LPS. (Dalam kajian rintis, kami menentukan bahawa tempoh uremia yang lebih lama diperlukan untuk mengesan beban mikrohemorrhages spontan yang lebih tinggi dalam haiwan CKD yang tidak dirawat; tikus yang menggunakan diet adenine untuk hanya 10 hari selepas 18 hari awal pendedahan mempunyai 3.0 ± 0.4 mikrohemorrhages setiap cm2.)

Lima minggu selepas induksi CKD awal dan pada umur yang setara dalam kawalan, tikus diberi suntikan LPS intraperitoneal (ip) (Salmonella enterica serotype Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) untuk mendorong pendarahan mikro otak. LPS ditadbir dalam tiga dos, 1 mg/kg pada 0, 6, dan 24 jam [25]. Tikus yang dirawat LPS diberi penghidratan dengan suntikan salin subkutaneus dua hingga tiga kali sehari selama 3 hari selepas rawatan LPS. Tekanan darah (BP) diukur 2 hari sebelum suntikan LPS melalui plethysmography cuff ekor (berbilang saluran CODA-S2, Kent Scientific). Semua eksperimen telah diluluskan oleh Universiti California, Penjagaan Haiwan Institusi Irvine, dan Jawatankuasa Penggunaan.

Penuaian Tisu dan Kimia Darah

Tikus disingkirkan 1 minggu selepas suntikan LPS atau pada usia yang setara pada haiwan yang tidak dirawat dengan exsanguination menggunakan tusukan jantung di bawah anestesia isoflurane yang disedut. Jarum pengukur 26-digunakan sebagai kanula dan dimasukkan ke dalam ventrikel kiri, dan larutan PBS ais sejuk digunakan pada kadar aliran 7–8 ml/min. Selepas

perfusi selama 5 minit, hemisfera otak kiri dibekukan untuk Western blot. Hemisfera otak kanan dan kedua-dua buah pinggang telah ditetapkan semalaman dalam 4 peratus paraformaldehid dan kemudian disimpan dalam PBS sejuk sebelum pemotongan. Serum telah diambil alih untuk kimia darah. Nitrogen urea darah (BUN) diukur menggunakan kit kolorimetrik dari Sistem BioAssay (Hayward, CA). Kreatinin serum diukur menggunakan elektroforesis kapilari di Pusat Teras Penyelidikan Buah Pinggang O'Brien (UT Southwestern, Dallas, TX).

Pengesanan Microhemorrhages

Otak telah dipasang pada 1.5 peratus agarose dan dibelah dengan vibratom untuk menghasilkan bahagian koronal (40 μm). Setiap bahagian ke-5 dikumpulkan untuk pewarnaan biru Prusia untuk mengesan pendarahan mikro [26]. Pewarnaan biru Prusia dilakukan menggunakan 5 peratus potassium hexacyanoferrate-tri hidrat dan 10 peratus asid hidroklorik yang baru disediakan. Dua puluh minit kemudian, bahagian dibilas di dalam air dan diwarnai balas dengan nuklear cepat merah, dehidrasi, dan tergelincir. Microhemorrhages dikenal pasti pada pembesaran × 20 sebagai deposit ungu-biru yang dikira dengan tiga suntikan diberikan pada 0,6 dan 24h. Penghidratan garam subkutan diberikan selama 3 hari selepas suntikan LPS. Tekanan darah ekor (BP) diukur sebelum suntikan LPS. Tikus dikorbankan 1 minggu selepas suntikan LPS. b Wakil bahagian buah pinggang bernoda H&E menunjukkan tikus CKD kecederaan tubulointerstitial akibat adenine (panel kanan) berbanding dengan buah pinggang normal daripada haiwan CTL (panel kiri), × 20 pembesaran. Bar skala=100 μm

pemerhati bebas, dan kemudian min dikira. Imej bahagian bernoda positif yang diperhatikan telah ditangkap menggunakan fotomikroskop (Nikon Eclipse, Jepun) untuk tiga haiwan setiap kumpulan untuk mengira kawasan mikrohemorrhage. Imej slaid keseluruhan telah diimbas dan perisian ImageJ percuma (versi 10.2) daripada Institut Kesihatan Nasional (www.imagej.nih.gov/ij/) digunakan untuk

kira jumlah luas permukaan otak. Bilangan mikrohemorrhages telah dinormalkan kepada jumlah luas permukaan otak setiap haiwan.

Western Blotting

Hemisfera otak untuk analisis protein dibekukan pada masa pengumpulan tisu dan dihomogenkan dalam Reagen Pengekstrakan Tisu sejuk ais I (Thermo Fisher Scientific) ditambah dengan koktel perencat protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Kepekatan protein diukur dengan kit ujian protein BCA (Thermo Fisher Scientific). Elektroforesis gel SDS-PAGE dilakukan dengan 100 ug protein setiap sampel. Protein dipindahkan ke membran PVDF dan kemudian disekat untuk

1 jam dalam 5 peratus susu skim kering tanpa lemak yang disediakan dalam penimbal TBS-T(10 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl dan 0.1 peratus Tween-20) ​​dan diinkubasi dengan antibodi utama yang menyasarkan claudin -5 (dicairkan 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (dicairkan 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) dan dinormalkan kepada kawalan dalaman GAPDH (dicairkan 1:10,000, Abcam, Cambridge, MA) dalam 5 peratus susu tanpa lemak TBS-T semalaman pada 4 darjah . Blot kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder anti-arnab atau anti-tikus masing-masing selama 2 jam pada suhu bilik. Selepas mencuci dengan TBS-T, jalur dikesan menggunakan Penganalisis Imej Luminescent LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).

Imunohistokimia

Untuk mengesan kebocoran penghalang darah-otak (BBB), bahagian diinkubasi dengan antibodi sekunder IgG anti-tikus biotinilasi pada 1:100 selama 1 jam pada suhu bilik (Vector Laboratories, Burlingame, CA, Amerika Syarikat). Selepas mencuci dengan PBS, bahagian diinkubasi selama 30 minit dengan kompleks avidin-biotin-peroksidase (Makmal Vektor) pada pencairan 1:200. Pewarnaan telah dibangunkan menggunakan 3′,3′- diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories) sebagai kromogen. Peratusan kawasan yang diwarnai dengan IgG dianalisis menggunakan perisian ImageJ dalam otak bukan LPS CTL dan CKD. Ambang untuk pewarnaan IgG positif telah dipilih dengan menilai secara manual haiwan kawalan untuk pewarnaan IgG, dan ambang ini kemudiannya dikekalkan sama untuk semua haiwan yang disertakan [27].

Cistanche deserticola mencegah penyakit buah pinggang

Eksperimen Kultur Sel

Kultur Sel Endothelial Otak dan Rawatan Serum

Sel bEnd.3 tetikus yang diabadikan telah dibeli daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (ATCC, Manassas, VA). Fenotip sel endothelial telah disahkan melalui imunostaining untuk faktor von Willebrand.

Kultur sel telah diinkubasi dalam medium Helang yang diubah suai Dulbecco lengkap glukosa tinggi (DMEM, ATCC 30-2002) yang mengandungi 25 mM glukosa ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS) dan 1 peratus penisilin-streptomisin dalam inkubator lembap pada 37 darjah dalam suasana 5 peratus CO2 dan 95 peratus udara. Sel telah digunakan pada laluan 5 untuk semua eksperimen. Sel-sel telah disemai pada ketumpatan 5 × 106 pada 12-telaga poliester sisipan Transwell (0.4 μm liang, Costar) dan pertemuan dicapai pada 24-48 jam. Medium kultur kemudiannya ditukar untuk mendedahkan sel kepada kepekatan FBS yang berbeza, serum normal manusia (HNS), atau serum uremik (CKD) daripada pesakit dialisis. Bacaan TEER diukur menggunakan EVOM2 volt/Ohm Meter (Instrumen Ketepatan Dunia, Sarasota, FL) di tiga lokasi setiap telaga untuk mendapatkan purata. Eksperimen diteruskan selama 21 hari, dan medium kultur disegarkan setiap 3-4 hari. NHS dan serum uremik adalah daripada sampel yang disimpan sebelum ini yang diperolehi selepas kelulusan LHDN dan persetujuan yang dimaklumkan.

Eksperimen Kultur Sel Urea

Untuk mengkaji kesan urea (toksin tertahan paling banyak dalam CKD), sel bEnd.3 diinkubasi dalam DMEM glukosa tinggi dengan 10 peratus FBS sahaja atau dalam medium ditambah dengan 42 atau 72 mg/dL (70 atau 120 μm) urea ( Sigma- Aldrich). Kepekatan urea ini menghampiri nilai pra-dan selepas hemodialisis yang biasanya ditemui pada pesakit ESRD, dan dianggap relevan secara klinikal [28]. Pada akhir tempoh inkubasi 24-h, TEER telah diukur dan sel telah dituai dan diproses untuk analisis Western blot. Untuk visualisasi sitoskeleton aktin, sel bEnd.3 telah ditanam pada slip penutup kaca dan terdedah kepada kepekatan urea di atas selama 24 jam, ditetapkan selama 10 minit dalam formalin/PBS 4 peratus sejuk, dan kemudian diproses untuk pewarnaan imunofluoresensi menggunakan actistain 488 pendarfluor. phalloidin dengan pewarnaan nuklear DAPI (katalog# PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Slaid tiga kali ganda dilakukan setiap kumpulan, dan tiga bingkai telah diimejkan setiap slaid pada perisian ImageJ untuk mengira kawasan pewarnaan phalloidin yang dinormalkan ke kawasan DAPI.

Western Blotting

bEnd.3 sel daripada eksperimen urea telah dipel, kemudian dilisiskan dalam Tissue Extraction Reagent I (Thermo Fisher Scientific) ditambah dengan koktel perencat protease (Roche Applied Science). Kepekatan protein diukur dengan kit ujian protein BCA dan Western blotting dilakukan seperti yang diterangkan di atas dengan claudin-5 (dicairkan 1:500) dan okludin (dicairkan 1:500) dinormalkan kepada kawalan dalaman GAPDH (dicairkan 1:20 ,000). Western blot diulang sekurang-kurangnya tiga kali untuk setiap sampel.

Kajian Manusia

Semakan Carta MRI Otak Retrospektif

Rekod perubatan elektronik antara 1 Januari 2008 dan 31 Disember 2014, di Pusat Perubatan Universiti California-Irvine telah disaring menggunakan sistem Honest Broker dan UCReX (University of California Research Exchange) selepas kelulusan LHDN. CKD pra-dialisis (n =8) dan pesakit hemodialisis kronik (n =9) yang mempunyai sekurang-kurangnya dua imbasan MRI otak pada titik masa yang berasingan telah dikenal pasti (daripada 10 pesakit hemodialisis yang mula dikenal pasti, 1 telah dikeluarkan daripada analisis akhir kerana imej yang hilang dalam sistem PACS radiologi). Kawalan dengan fungsi buah pinggang normal (n=10) dipadankan secara manual dengan pesakit CKD hemodialisis mengikut jantina dan umur ± 5 tahun.

Kajian MRI untuk Pendarahan Mikro Serebrum

Microbleeds dikira oleh pakar neuroradiologi (DF) yang hadir dan dianalisis untuk perkembangan dari semasa ke semasa. MRI otak dengan imej pengimejan berwajaran T2* dan berwajaran kerentanan (SWI) dan FLAIR (pemulihan penyongsangan dilemahkan cecair) telah dilakukan pada pengimbas MRI 1.5T dan 3T. Ketebalan lapisan untuk jujukan SWI dilakukan pada 2 mm, dengan selang antara lapisan 0. Pendarahan mikro dikira berdasarkan 2-mm SWI paksi. FLAIR adalah per-

dibentuk untuk mengesan lesi jirim putih pada ketebalan kepingan 3 mm, juga dengan selang antara lapisan 0.

Analisis statistik

Tiada data outlier semasa saringan dengan ujian Grubbs (kaedah penyimpangan pelajar yang melampau, http://graphpad. com/quick calls/grubbs1/). Perbezaan antara kumpulan dalam tikus dan dalam manusia telah dibandingkan dengan ujian khi kuasa dua (Fisher's exact) untuk pembolehubah kategori dan ujian-t dan ANOVA untuk pembolehubah berterusan. Data berterusan dilaporkan sebagai min ± SEM. Untuk data tetikus, kami melakukan kedua-dua Kruskal-Wallis bukan parametrik dan ANOVA sehala dengan ujian Tukey HSD. ANOVA dua hala (CKD-ya/tidak dan LPS-ya/tidak) digunakan untuk menguji interaksi CKD. Perbezaan antara kumpulan dianggap signifikan jika P < 0.05.="" angka="" telah="" dijana="" menggunakan="" perisian="" graphpad="" prism="" 4="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Keputusan

Hidup dengan Rawatan LPS

Tikus CKD yang dirawat dengan LPS mempunyai kadar survival 80 peratus. Hanya tikus yang bertahan hingga 1 minggu selepas rawatan LPS adalah

dimasukkan dalam analisis akhir. Semua tikus dalam kumpulan lain terselamat sehingga akhir eksperimen.

CKD Meningkatkan Pendarahan Mikro Otak Dengan Ketara

Beban Selepas Rawatan LPS

Haiwan dengan adenine-induced dan 5/6 nephrectomy CKD menunjukkan nilai nitrogen urea darah (BUN) dan kreatinin serum yang meningkat dengan ketara berbanding dengan haiwan CTL (Jadual 1). Tail BP adalah jauh lebih tinggi dalam haiwan nefrectomy-CKD berbanding dengan haiwan CTL dan adenine-CKD (Jadual1); walau bagaimanapun, kiraan microbleed dalam dua kumpulan CKD adalah serupa. Pewarnaan H&E mengesahkan kecederaan tubulointerstitial akibat adenine dalam buah pinggang daripada tikus CKD (Rajah 1b).

Purata beban mikrohemorrhage otak ialah 2.0 ± 0.5 setiap cm2 dalam tikus CTL bukan LPS dan dinaikkan 2–2.5-kali ganda dalam haiwan CKD bukan LPS (adenine- Tikus CKD 4.5 ± 0.9 setiap cm2;

nephrectomy-CKD tikus 4.2 ± 1.1 per cm2) (Jadual 1; Rajah 2a). Bagi kumpulan bukan LPS, peningkatan dalam microhemorrhages adalah ketara untuk adenine-CKD berbanding dengan CTL tetapi bukan untuk nefrectomy-CKD. Rawatan LPS meningkatkan pembentukan mikrohemorrhage ke tahap yang sama dalam haiwan CTL dan CKD oleh