Carvedilol, Penyekat Adrenergik, Menekan Sintesis Melanin Dengan Menghalang Laluan Isyarat CAMP/CREB dalam Melanosit Manusia Dan Budaya Kulit Manusia Ex Vivo

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ dan Sung Eun Chang 1

Abstrak:Katekolamin berfungsi melalui reseptor yang digabungkan dengan protein G, mencetuskan peningkatan paras intraselular sebanyak 30, 50-adenosin monofosfat (cAMP) kitaran dalam pelbagai sel. Katekolaminbiosintesis dan reseptor -adrenergik wujud dalammelanosit; Oleh itu, katekolamin boleh memainkan peranan penting dalam pigmentasi kulit. Walau bagaimanapun, tindakan dan mekanisme mereka yang mengantara melanogenesis kulit tidak manusiawi belum lagi disiasat. Oleh itu, kami mengkaji potensi kesan anti-melanogenetik carvedilol, penyekat tidak selektif dengan aktiviti penyekatan 1-yang lemah. Carvedilol mengurangkan kandungan melanin dan aktiviti tyrosinase selular tanpa menjejaskan daya maju selular dalam manusia biasamelanositserta dalam Mel-Ab melanosit tikus yang diabadikan. Carvediloldownregulated microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase, tyrosinase-related protein (TRP)-1 dan TRP-2. Rawatan Carvedilol membawa kepada pengurangan pengawalseliaan protein pengikat unsur fosfor-cAMPresponse (CREB). Lebih-lebih lagi, peningkatan tahap cAMP selepas rawatan dengan forskolin membalikkan tindakan anti-melanogenik carvedilol. Di samping itu, carvedilol sangat mengurangkan indeks melanin dalam kultur kulit manusia yang disinari ultraungu. Diambil bersama, keputusan kami menunjukkan bahawa carvedilol berkesan menyekat melanogenesis pada manusiamelanositdan kulit ex vivohuman dengan menghalang isyarat cAMP/protein kinase A/CREB. Kesan anti-melanogenik carvedilol mempunyai potensi kepentingan untuk kulitpemutihanejen.

Kata kunci:carvedilol; penyekat adrenergik;sintesis melanin; isyarat cAMP/CREB

Cistanchemampu menghalang sintesis melanin

1. Pengenalan

Pelbagai gangguan kulit berpigmen mempunyai kesan psikologi dan sosial yang ketara kepada pesakit. Pelbagai kaedah rawatan, termasuk agen sistemik dan topikal serta terapi laser, telah dibangunkan [1-3]. Walau bagaimanapun, keputusan selalunya tidak memuaskan dan tindak balas buruk, seperti hiperpigmentasi selepas keradangan (PIH) dan hipopigmentasi, daripada rawatan adalah perkara biasa. Selain itu, rawatan adalah mahal dan memakan masa [4-6].

Katekolamin, yang termasuk dopamin, epinefrin, dan norepinefrin, adalah molekul isyarat yang bertindak sebagai neurotransmitter dan hormon endokrin. Dalam kulit, biosintesis dan degradasi katekolamin berlaku dalam keratinosit manusia, tetapi sintesis katekolamin dalam melanosit agak berbeza [7-9]. Katekolamin berfungsi melalui reseptor G protein-coupled (GPCRs). Pengikatan katekolamin pada GPCR mencetuskan pengaktifan adenylatecyclase intraselular, yang mensintesis 30, 50-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) daripada ATP [10]. Kem secondmessenger menjalankan aktivitinya dengan mengikat subunit R protein kinase A (PKA), menghasilkan fosforilasi protein pengikat unsur tindak balas cAMP (CREB). GPCR diaktifkan oleh amina dan peptida, termasuk glukagon, hormon paratiroid, sekretin, dan kalsitonin [10].

Antagonis reseptor adrenergik termasuk antagonis -reseptor dan -reseptor. -Reseptorantagonis subkategori kepada bukan selektif, 1-selektif, dan 2-ejen selektif, manakala -reseptor antagonis disubklasifikasikan sebagai bukan selektif, 1-selektif dan 2-selektif ejen berdasarkan aktiviti penyekatan terpilih mereka. Tidak seperti antagonis reseptor bukan selektif generasi pertama, seperti propranolol, timolol dan nadolol, carvedilol ialah penyekat bukan selektif generasi ketiga yang memaparkan tindakan vasodilator dengan menyekat 1-adrenoreceptor ( 1-AR) [11]. Oleh itu, carvedilol adalah penyekat anonselective dengan 1-aktiviti menyekat yang lemah [12]. Ia digunakan terutamanya sebagai ubat oral untuk mengawal tekanan darah tinggi dan penyakit jantung kongestif, sama seperti penyekat lain [12]. Walau bagaimanapun, penyekat generasi ketiga mempamerkan aktiviti angiogenik, antioksidan, anti-proliferatif, anti-hipertropik, dan anti-apoptosis yang memerlukan penjelasan lanjut [11]. Dalam bidang dermatologi, kerana tindakan antioksidan dan anti-radangnya, carvedilol sering digunakan dalam formulasi oral untuk merawat rosacea thematotelangiectatic [13,14]. Selain itu, aktiviti antioksidan carvedilol menghasilkan pencegahan karsinogenesis kulit yang disebabkan oleh ultraviolet (UV), menjadikannya agen menarik untuk menguruskan penyakit kulit yang berkaitan dengan UV [15-18]. Walau bagaimanapun, kesan chemopreventive carvedilolare tidak dimediasi secara langsung melalui AR. [19] Walaupun mekanisme yang tepat agak tidak diketahui, laluan isyarat cAMP/PKA dan PKC-δ boleh dikaitkan dengan sifat carvedilol terhadap metastasis kulit [20].

Pada peringkat awal menyiasat pigmentasi, manusiamelanositdidapati mengekspresikan -1-isyarat AR selepas induksi ekstraselular dengan norepinephrine. Walau bagaimanapun, -AR tidak dijumpai selepas rangsangan dengan isyarat adrenergik masukmelanosit[8]. Sebaliknya, Cillbro et al. kemudiannya menunjukkan bahawa isyarat AR 2-berfungsi tertentu wujud dalam melanosit manusia dan 2-stimulasi AR membawa kepada pigmentasi melalui 2-laluan AR/cAMP [7]. Oleh itu, peranan katekolamin dalam kawalan pigmentasi telah dicadangkan, dan cAMP dianggap sebagai paksi utama untuk kawalan katekolamin melanogenesis.

Melanogenesis adalah proses kompleks yang melibatkan banyak laluan. Tyrosinase, protein berkaitan tyrosinase 1 (TRP-1), dan TRP-2, juga dipanggil dopachrome tautomerase (DCT), ialah tiga enzim khusus melanosit utama yang terlibat dalamsintesis melanin[21]. Melanogenesis diinduksi atau dihalang oleh banyak faktor, termasuk hormon, sitokin, neurotransmitter, faktor pertumbuhan, dan mikromolekul [21-23].

Pengawal selia positif yang paling penting ialah reseptor melanocortin-1 dan ligannya, melanokortin dan hormon adrenokortikotropik [23]. Walau bagaimanapun, pelbagai faktor yang terlibat dalam melanogenesis ialah -endorfin, estrogen, androgen, vitamin D3, dan katekolamin [23]. Bukti kumulatif telah mencadangkan bahawa L-tirosin dan L-DOPA, yang merupakan substrat dan perantaraan melanogenesis, bertindak sebagai pengasin dan pengawal selia positif laluan melanogenik, sebagai tambahan kepada pengawal selia fungsi selular yang lain [24]. Selain itu, Jeff Howe et al. mencadangkan bahawa induksi dan peraturan melanogenesis oleh L-tirosin dimediasi oleh pengaktifan langsung reseptor adrenergik oleh L-tirosin, dan bukannya disebabkan oleh produk metaboliknya seperti katekolamin [25]. Dalam kajian mereka, norepinephrine dan epinephrine merangsang aktiviti tyrosinase, tetapi kesan induktifnya terhadapsintesis melaninadalah secara perbandingan lebih rendah daripada L-tirosin [25].

Katekolamin mungkin memainkan peranan penting dalam sistem pigmentasi kulit; Walau bagaimanapun, kesannya terhadap melanogenesis berkenaan dengan tindakan penyekat bukan selektif generasi ketiga masih belum diterokai. Oleh itu, dalam kajian ini, kami berhasrat untuk menyiasat sama ada carvedilol mempengaruhi melanogenesis dan meneroka mekanisme tindakannya dalam manusia.melanositdan kulit manusia ex vivodan potensi penggunaannya sebagai apemutihanproduk.

menghalang pembentukan melanin denganherba cistanches

2. Keputusan

2.1. Carvedilol Menekan Melanogenesis

Sitotoksisiti carvedilol terhadap manusia biasamelanosit(NHMs) dan sel Mel-ab dinilai oleh ujian proliferasi sel WST. Kepekatan carvedilol sebanyak 10 µM mula menunjukkan sitotoksisiti terhadap kedua-dua sel NHM dan Mel-ab (Rajah 1A, B). Oleh itu, dalam penilaian lanjut, kami menggunakan 8 µM carvedilol, yang tidak sitotoksik kepada NHM.

Rawatan dengan carvedilol mengurangkan kandungan melanin dalam cara yang bergantung kepada dos tanpa menjejaskan daya maju NHM (Rajah 1C). Kandungan melanin telah menurun sebanyak 28.36 peratus selepas 96 hof 8 µM rawatan carvedilol (Rajah 1C). Penambahan 100 mg/mL arbutin mengurangkan kandungan melanin kepada tahap yang lebih rendah daripada carvedilol (Rajah 1C). Selepas 4 hari rawatan carvedilol, kandungan melanin menurun mengikut cara yang bergantung pada masa (Rajah 1D). Walau bagaimanapun, rawatan dengan forskolin (FSK) selama 4 hari selepas pra-rawatan dengan carvedilol menyebabkan peningkatan kandungan melanin (Rajah 1E). FSK meningkatkan transkripsi MITF ke tahap yang paling tinggi pada 2 jam dalam NHM dan dipercayai berfungsi melalui cAMP. Laluan /PKA/CREB (Rajah 1F).

2.2. Carvedilol Menghalang Ekspresi MITF dan Gen Sasarannya serta Mengurangkan Tahap Fosfo-CREB dalam NHMs

Kerana carvedilol mengurangkan pengumpulan melanin, kami menyiasat aktiviti tyrosinase selular. Rawatan dengan carvedilol mengurangkan aktiviti tyrosinase selular dalam cara yang bergantung kepada dos dalam NHMs (Rajah 2A). Aktiviti tyrosinase menurun sebanyak 28.48 peratus selepas 96 jam rawatan carvedilol 8 µM (Rajah 2A). Kami seterusnya menentukan sama ada carvedilol mempengaruhi ekspresi MITF, yang memainkan peranan penting dalam pengawalan tyrosinase dan gen melanogenik hiliran. Rawatan FSK meningkatkan tahap cAMP intraselular dan membalikkan tindakan anti-melanogenik carvedilol. Carvedilol secara signifikan mengurangkan tahap protein MITF, faktor transkripsi pusat melanogenesis, pada 72 jam (Rajah 2B). Tambahan pula, ekspresi gen sasarannya, seperti tyrosinase dan TRP-1, telah dikurangkan selepas rawatan carvedilol (Rajah 2B). Keputusan ini menunjukkan bahawa carvedilol menghalang melanogenesis dengan merendahkan isyarat MITF.

Seterusnya, kami menyiasat laluan isyarat intraselular melanogenesis, yang mengawal MITFtranskripsi, dengan mengukur tahap ekspresi fosfo-CREB dan fosfo-ERK. Tahap Phospho-ERK tidak berubah dari semasa ke semasa selepas rawatan carvedilol; bagaimanapun, tahap fosfo-CREB telah berkurangan (Rajah 2B). Selaras dengan pemerhatian sebelumnya, keputusan kami mendedahkan bahawa carvedilolin menghalang melanogenesis dengan menghalang laluan isyarat cAMP/PKA/CREB. Selain itu, rawatan FSK membalikkan tindakan anti-melanogenik carvedilol dengan meningkatkan tahap cAMP.

2.3. Indeks Melanin dan Pewarnaan Imunohistokimia dalam Budaya Kulit Manusia Ex Vivo

Ketumpatan melanosit epidermis dan indeks melanin dalam bahagian tisu kultur kulit manusia ex vivo telah dikesan oleh pewarnaan Melan-A dan Fontana-Masson, masing-masing. Carvedilol tidak menjejaskan bilangan Melan-A ( tambah )melanositdalam spesimen yang dirawat dengan carvedilol ditambah sinaran UV (UVR) berbanding dengan spesimen yang dirawat dengan UVR sahaja (Rajah 3A). HMB45(tambah)melanosit mungkin menunjukkan bahawa aktiviti melanocytic meningkat apabila rawatan UVR dan dikurangkan secara terbalik selepas rawatan carvedilol (Rajah 3B). Walau bagaimanapun, kandungan melanin telah dikurangkan dengan ketara dalam spesimen yang dirawat dengan carvedilol ditambah UVR berbanding dengan spesimen yang dirawat dengan UVR sahaja (Rajah 3C). Untuk mengira indeks melanin, pecahan pewarna Fontana–Masson ke atas jumlah kawasan antara spesimen yang terdedah kepada UVR dan yang kepada carvedilol ditambah UVR telah dikira dan dibandingkan (Rajah 3D). Lisat sel setiap spesimen telah dianalisis oleh blotassay Barat, yang mendedahkan bahawa tyrosinase, TRP1, dan DCT telah meningkat oleh UVR dan dikurangkan oleh rawatan carvedilol (Rajah 3E). Akibatnya, carvedilol telah mengurangkan indeks melanin dan protein berkaitan melanogenesis, menunjukkan kesan anti-melanogeniknya pada kulit manusia yang dirawat dengan UVR.

3. Perbincangan

Melanin adalah pigmen yang bertanggungjawab untuk warna kulit dan rambut dan disintesis dalam melanosom olehmelanosit. Walaupun melanin epidermis memainkan peranan perlindungan yang penting terhadap UVR, pengeluaran melanin berlebihan dan pengumpulan dalam kulit menyebabkan gangguan hiperpigmen kulit yang menyusahkan, seperti PIH, dispigmentasi yang berkaitan dengan fotopenuaan, melasma, dan lentigin solar [18,26]. Oleh itu, perencatan melanogenesis telah menjadi tumpuan rawatan perubatan dan kosmetik untuk kecantikan dan kesihatan kulit. Usaha yang besar telah dibuat untuk mengenal pasti agen anti-pigmentasi yang baru dan berkesan. Walau bagaimanapun, mekanisme anti-melanogenesis agen tertentu pada masa ini tidak pasti dan secara amnya telah dinilai dalam sel tikus, yang menghasilkan keputusan yang tidak selalu konsisten dengan ujian kulit manusia [27,28]. Selain itu, memandangkan melanogenesis melanosit dikawal ketat oleh keratinosit dan sel-sel jiran yang lain, sel-sel manusia yang dikultur atau kulit manusia ex vivo adalah tetapan eksperimen yang lebih dipercayai untuk penerokaan yang berkesan.pemutihanejen [29]. Kebanyakan agen pemutihan kulit, sama ada secara semula jadi atau secara kimia, boleh menyebabkan ketoksikan atau kerengsaan kulit, yang boleh diramalkan pada tahap tertentu menggunakan ujian daya maju sel in vitro dengan melanosit. Dalam kajian kami, carvedilol tidak menunjukkan sitotoksisiti apabila digunakan dalam dos sederhana.

cistanche bienfaits

Krim topikal hidrokuinon boleh mengakibatkan gangguan hipopigmentasi yang tidak diingini dan ketoksikan kulit [30-32]. Tambahan pula, beberapapemutihankosmetik mempunyai akibat yang buruk dengan mendorong hipopigmentasi melalui degradasi protein tyrosinase [33-35]. Ejen pemutih boleh digunakan pada dos yang lebih tinggi bergantung kepada pengguna untuk memaksimumkan pemutihan lesi hiperpigmen. Oleh itu, usaha untuk mencari agen pemutih kulit yang selamat dan sihat sedang diterokai secara berterusan.

Oleh itu, kajian ini direka untuk dijalankan dalam sel manusia normal dan kulit ex vivohuman. Tambahan pula, berdasarkan mekanisme tindakan isyarat G yang ditetapkan oleh katekolamin, yang meningkatkan tahap cAMP selular, kami percaya bahawa penyekat adrenergik boleh menurunkan tahap cAMP dan menghalang laluan isyarat UVR/cAMP/CREB, yang merupakan mekanisme utama untuk hiperpigmentasi kulit yang disebabkan oleh UV. [36,37]. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa penyekat adrenergik yang menurunkan tahap cAMP mengurangkansintesis melanin.

Di samping itu, untuk membangunkan selamatpemutihanagen, mekanisme anti-melanogenesis yang boleh dipercayai dan boleh dihasilkan semula harus dilakukan secara selari. Rangsangan yang paling ketara secara fisiologi ialah UV, dan antara isyarat UVR kepada epidermismelanosit, paksi CREB adalah laluan yang paling mantap untuk pengawalan melanogenesis dalam epidermis manusia [29]. Pendedahan kepada UV secara berturut-turut mengaktifkan pengeluaranscAMP, PKA, dan faktor transkripsi CREB, yang seterusnya, mendorong ekspresi MIF dan gen melanogenik sasaran hiliran [38,39]. Sebagai tambahan kepada fosforilasi CREB oleh PKA, kajian terkini telah menunjukkan bahawa pengambilan coactivator transkripsi terkawal CREB (CRTC) 3 ke kompleks transkripsi CREB juga diperlukan untuk MITF yang dirangsang cAMP. MITFmelaksanakan peranan paling penting dalam pengawalseliaansintesis melanindan hasil transkripsi enzim melanogenik [26,40,41]. Semasa proses isyarat intraselular ini, melanogenesis dikawal oleh enzim utama, tyrosinase, dan protein enzimatik tambahan, seperti TRP-1 dan DCT [1–4]. Dalam kajian ini, carvedilol berkesan mengurangkan fosforilasi CREB, yang menunjukkan bahawa ia mengurangkan MITF dan protein tyrosinase dengan menghalang transkripsi MITF (Rajah 4). Memandangkan peraturan gen mRNA MITF dikawal dengan teliti dan diselamatkan oleh molekul isyarat intraselular dan koaktivator lain, peraturan tahap transkrip MITF adalah strategi yang menjanjikan untuk mencari bahan pemutihan kulit yang sihat kerana fungsi kelangsungan hidup MITF dipelihara dan diselamatkan [1,38,40]. Sesungguhnya, apabila kami menyiasat transkripsi MITF yang disebabkan oleh FSK, MITF mRNA didapati mempunyai keluk tindak balas puncaknya sendiri untuk melanogenesis dan kelangsungan hidup selular untuk cellularhomeostasis. Fungsi biologimelanositnampaknya dikawal secara intrinsik oleh isyarat maklum balas lain dalam melanosit manusia. Lebih-lebih lagi, carvedilol mempunyai risiko kejadian buruk hipopigmentasi yang lebih rendah kerana ia melemahkan aktiviti tyrosinase selular dari semasa ke semasa, dan bukannya secara tiba-tiba.

Katekolamin termasuk dopamin, epinefrin, dan norepinefrin dan disintesis daripada tirosin pemakanan oleh tindakan enzim [42]. Biosintesis dan degradasi katekolamin berlaku dalam pelbagai sel, termasuk neuron saraf simpatetik dan otak, sel adrenomedullary, sel endothelial, neutrofil, dan sel mononuklear [43-45]. Dalam kulit manusia, katekolamin sintesis berlaku dalam keratinosit. Sebaliknya, melanosit juga mengekspresikan mRNA dan enzim untuk sintesis theautokrin norepinephrine tetapi bukan epinefrin [7,42]. Pada manusiamelanosit, -1-AR mungkin penting dalam tindak balas kepada norepinephrine, tetapisintesis melaninjuga dipengaruhi oleh 2-ARsignaling [7,8]. Menariknya, pesakit dengan vitiligo telah meningkatkan 2-ketumpatan AR dalam keratinosit [46]. Peningkatan tahap norepinephrine didapati dalam air kencing dan plasma pesakit dengan non-segmentalvitiligo, membayangkan bahawa metabolisme katekolamin mungkin dikaitkan dengan perkembangan dan perkembangan vitiligo. [47]. Selain itu, sebagai tambahan kepada neurotransmitter tekanan klasik, melanosit menghasilkan neuropeptida dan hormon, seperti faktor pelepas kortikotropin dan proopiomelanocortin. Pengeluaran ini dirangsang oleh UVR dan agen lain yang bertindak dalam sistem neuroendokrin kulit [48]. Oleh itu, tindakan katekolamin dan fungsi melanositik berkait rapat dalam pelbagai laluan kompleks. Tambahan pula, carvedilol boleh mengganggu tindak balas kimia dalam laluan melanogenik dan kemungkinan ini perlu dikaji lebih lanjut. Carvedilol mungkin mempunyai kelebihan kerana ia mempunyai kesan anti-radang serentak, kerana kebanyakan gangguan hiperpigmen adalah PIH secara klinikal atau sub-klinikal pada pesakit berkulit gelap. Oleh kerana resapan carvedilol melalui kulit telah dikaji secara in vitro dan ex vivo, carvedilol boleh dibangunkan sebagai topikalpemutihanejen pada masa hadapan [49–51].

Pentadbiran carvedilol sistemik boleh menyebabkan bradikardia, pening, hipotensi, sakit kepala, dan pening. Penggunaan topikal carvedilol biasanya tidak menyebabkan simptom sistemik; walau bagaimanapun, kita harus memberi perhatian yang teliti kepada simptom-simptom ini apabila memohon kepada pesakit yang mempunyai halangan kulit yang rosak, seperti mereka yang mengalami dermatitis atopik. Selain itu, ekzema, pruritus, dan letusan lichenoid dilaporkan dalam kes yang jarang berlaku apabila mengambil carvedilol. Kesan sampingan dermatologi ini serta contactdermatitis juga harus diambil kira apabila menggunakan carvedilol sebagai topikal.pemutihanejen.

Kesimpulannya, kami menunjukkan bahawa carvedilol berkesan mengurangkan melanogenesis pada manusiamelanositdan kulit manusia ex vivo dengan menghalang laluan cAMP/CREB/MITF, yang mencadangkan potensi kegunaannya sebagai agen pemutih yang berkesan. Penyiasatan lanjut mengenai penglibatan fungsi reseptor adrenergik oleh carvedilol dalam melanosit manusia harus diikuti.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan

Carvedilol, 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), toksin kolera (CT) dan 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, Amerika Syarikat).Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) dan salin penampan fosfat Dulbecco telah dibeli daripada WelGENE (Daegu, Korea). Fetal bovine serum (FBS), antibiotik-antimikotik, dan trypsin-EDTA dibeli dari Gibco (Grand Island, NY, USA). Sederhana 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, USA) dan FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(Acetyloxy)-3-ethenyldodecahydro{ {24}},10,10b-trihydroxy-3,4a,7,7,10a-pentamethyl-1H-naphtho[2,1-b]pyran-1-satu ) telah dibeli daripada Tocris Bioscience (Bristol, UK).

4.2. Garis Sel dan Kultur Sel

NHM utama yang diperoleh daripada Invitrogen (Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) dikekalkan dalam Sederhana 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, Amerika Syarikat) ditambah dengan Tambahan Pertumbuhan Melanocyte Manusia (Thermo Fisher). Sel Mel-ab, garisan sel melanosit yang diabadikan secara spontan yang diperoleh daripada tetikus, diperoleh daripada Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) dan dikekalkan dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS, penicillin-streptomycin, 100 nM TPA, dan 1 nM CT. Semua sel dikekalkan secara rutin pada suhu 37 ◦C dalam persekitaran lembap sebanyak 5 peratus CO2.

4.3. Antibodi dan Western Blots

Sel-sel telah dibasuh sekali dengan PBS sejuk dan dilisekan dalam penimbal lisis protein (1 peratus SDS dalam 10 mMTris dan 5 mM EDTA, pH 7.4), diikuti dengan pengeraman pada 98 ◦C selama 10 minit. Sampel protein dipisahkan oleh 8 peratus elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, disapu pada membran nitroselulosa (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA), dan kemudian disekat dengan garam penampan Tris yang mengandungi 0.5 peratus Tween 20 dan 5 peratus BSA, dan tertakluk kepada immunoblotting. Antibodi Tyrosinase dan TRP{14}} telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA) dan MITF dibeli daripada Abcam(Cambridge, UK). -tubulin (Gentex, Holland, MI, USA) digunakan sebagai kawalan pemuatan dalaman.

4.4. Kandungan Melanin

Kesan sitotoksik carvedilol telah dinilai menggunakan Kit Ujian Viability Sel Ez-Cytox (Dogen-Bio Co., Ltd., Seoul, Korea) mengikut arahan pengilang. Sel Mel-Ab dan NHM telah disemai dalam plat enam telaga pada ketumpatan 6 × 105 dan 3 × 105sel/telaga, masing-masing. Sel telah dirawat dengan carvedilol, seperti yang ditunjukkan dalam rajah, selama 3 atau 5 hari (d). Sebelum mengukur kandungan melanin, sel-sel telah diperhatikan di bawah mikroskop fasa kontras dan difoto (Olympus, Tokyo, Jepun). Sel telah dilarutkan dalam 550 µL 1 N NaOH pada 100 ◦C selama 30 minit dan emparan pada 13,000 rpm selama 5 minit. Penyerapan supernatan diukur pada 405 nm oleh pembaca plat mikro. Kandungan melanin intraselular dibentangkan sebagai peratusan relatif kepada kawalan sel yang tidak dirawat. Arbutin (100 mg/mL) digunakan sebagai kawalan positif.

4.5. Aktiviti Tirosinase Selular

Aktiviti tyrosinase dinilai dengan mengukur kadar pembentukan dopachrome L-DOPA. Selepas pengeraman dengan carvedilol, sel-sel telah dibasuh dalam PBS ais sejuk dan dilisekan dalam penimbal lisis tyrosinase (penampan fosfat, pH 6.8, mengandungi 1 peratus Triton X{ {5}}) dengan kitaran pembekuan/pencairan berulang. Lisat telah dijelaskan dengan sentrifugasi pada 15,000 rpm pada 4 ◦C selama 10 minit. Selepas mengukur tahap protein lisat dan melaraskan kepekatan protein dengan penimbal lisis, 90 µL supernatan dicampur dengan 10 µL 10 mM L-DOPA dalam penimbal lisis tyrosinase diinkubasi pada 37 ◦C. Aktiviti tyrosinase selular diukur dengan membaca penyerapan 475 nm menggunakan microplatereader setiap 10 minit selama sekurang-kurangnya 1 jam. Arbutin (100 mg/mL) digunakan sebagai agen kawalan positif.

herba cistanches

4.6. Analisis Imunohistokimia

Tisu kulit manusia yang dibenamkan parafin dipotong menjadi bahagian setebal 6-µm dan diwarnakan dengan Melan-A (Novocastra, Newcastle, UK), kit Fontana-Masson (makmal ID, London, ON, Kanada) danHMB45 (Santa Clara , CA, USA), mengikut arahan pengeluar. Indeks melanin ditentukan dengan mengukur peratusan kawasan bernoda kepada jumlah kawasan tisu menggunakan perisian ImageJ 1.52 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.7. Analisis statistik

Data dibentangkan sebagai min ± ralat piawai bagi min (SEM), dan kesignifikan statistik ditentukan oleh ujian-t Pelajar yang tidak berpasangan menggunakan perisian GraphPad Prism5 (San Diego, CA, Amerika Syarikat). Dalam kajian ini, p < 0.05,="" p="">< 0.01,="" dan="" p="">< 0.001="" dianggap="" signifikan="" secara="" statistik="" dan="" diwakili="" oleh="" *,="" **="" dan="" ***,="">

Rujukan

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ Melanogenesis dan mekanisme agen pencerah kulit—Pendekatan sedia ada dan baharu. Int. J. Kosmet. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; Tidak, TK; Choi, KH; Chang, SE Rawatan Melasma dan Hiperpigmentasi Selepas Radang oleh Laser Alexandrite 755-nm Picosecond dalam Pesakit Asia. Ann. Dermatol. 2017, 29,779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, YJ; Park, JH; Lee, DY; Lee, JH Memperoleh Dispigmentasi Dua Hala pada Muka dan Leher: Pendekatan yang Sesuai Secara Klinikal. J. Med Korea. Sci. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Hiperpigmentasi pascaradang yang dikaitkan dengan rawatan lentigin solar menggunakan Q-Switched 532-nm Nd: YAG laser: Tinjauan berbilang pusat.J. Dermatologi. Rawat. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Kajian terkawal prospektif secara rawak bagi asid traneksamik oral untuk mencegah hiperpigmentasi pascaradang selepas laser ruby ​​bertukar Q. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Rawatan tidak berkesan melasma refraktori dan hiperpigmentasi selepas keradangan oleh laser ruby ​​Q-switched. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592–597. [CrossRef]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU Autocrine catecholamin biosintesis dan isyarat thebeta-adrenoceptor menggalakkan pigmentasi dalam melanosit epidermis manusia. J. Menyiasat. Dermatol.2004, 123, 346–353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML Induksi sistem transduksi isyarat thealpha-1-adrenoseptor pada melanosit manusia. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23.[CrossRef]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.;Peavy, TR; et al. Cedera akut mengubah laluan2-beta adrenergik dan sintetik katekolamin dalam keratinosit. J. Menyiasat. Dermatol. 2014, 134, 2258–2266. [CrossRef]

10. Emery, reseptor AC Catecholamine: Prototaip untuk penemuan ubat berasaskan GPCR. Adv. Pharmacol. 2013, 68,335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Tiga Generasi penyekat beta:Sejarah, Perbezaan Kelas dan Kebolehgunaan Klinikal. Curr. Hipertensi. Wahyu 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: Kajian semula sifat farmakodinamik dan farmakokinetiknya, dan keberkesanan terapeutik. Dadah 1993, 45, 232–258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Menyatakan kemerahan muka dan eritema berterusan rosacea yang dirawat dengan berkesan olehcarvedilol, penyekat beta-adrenergik tidak selektif. J. Am. Acad. Dermatol. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Pengurusan jangka panjang pembilasan muka yang berbeza dan eritema rosacea yang berterusan dengan rawatan dengan carvedilol. J. Dermatologi. Rawat. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Jackson, EK; Andresen, BT; et al. Pencegahan karsinogenesis kulit oleh beta-blocker carvedilol. KanserPrev. Res. 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. Carvedilol Penyekat beta Mencegah Kerosakan Pengantaraan Ultraviolet Sel Epidermis Murine dan Kulit Dibina Semula Manusia 3D. Int. J.Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.;Andresen, BT; Huang, Y. Carvedilol Gunaan Topi Melemahkan Kulit Berpunca Sinaran Ultraviolet SuriaKarsinogenesis. Kanser Sebelumnya Res. 2017, 10, 598–606. [CrossRef]

18. Brenner, M.; Pendengaran, VJ Peranan perlindungan melanin terhadap kerosakan UV pada kulit manusia. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolin menghalang JB6 P yang dimediasi EGF serta pembentukan koloni melalui mekanisme yang bebas daripada adrenoceptors.PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol menyekat penghijrahan dan pencerobohan sel payudara malignan dengan menyahaktifkan Src yang melibatkan laluan isyarat cAMP/PKA dan PKCdelta. J. Kanser Re. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. Daripada tirosin kepada melanin: Laluan isyarat dan faktor yang mengawal melanogenesis. Postepy Hig. Med. Dosw. Dalam talian 2016, 70, 695–708. [CrossRef]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Oh, SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Taman, YS; Lee, J. Adiponektin globular bertindak sebagai isyarat melanogenik dalam melanosit epidermis manusia. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

23. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melanin pigmentasi dalam kulit mamalia dan peraturan hormonnya. Fisiol. Wahyu 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosin, dan L-dihydroxyphenylalanine sebagai pengatur seperti hormon bagi fungsi melanosit. Sel Pigmen Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Costantino, R.; Slominski, A. Mengenai mekanisme induksi dan pengawalseliaan melanogenesis oleh L-tirosin. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Laluan Isyarat dalam Melanogenesis. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Awak, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Park, SH; Kim, DW Kesan Perlindungan Toksin Botulinum terhadap Pigmentasi Kulit Berpunca Ultraviolet. Plast. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Oh, WK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglycone of Rh4menghalang sintesis melanin dalam sel melanoma B16: Kemungkinan penglibatan laluan protein kinase A.Biosci. Bioteknol. Biokim. 2013, 77, 119–125. [CrossRef]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Yoo, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. Potensi Terapeutik Rottlerin untuk Gangguan Hiperpigmen Kulit dengan Menghalang Aktiviti Transkripsi Coactivators Transkripsi Dikawal CREB. J. Menyiasat. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Kimia leukoderma akibat hidrokuinon: Fenomena luar biasa. J.Dermatol India. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Jow, T.; Hantash, BM Hydroquinone-induced depigmentation: Laporan kes dan kajian literatur. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitiligo dan pendedahan pekerjaan kepada hidrokuinon daripada menservis mesin mengambil gambar sendiri. Hubungi Dermat. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, sebatian fenolik yang mendorong depigmentasi, memberikan sitotoksisiti melanosit melalui mekanisme yang bergantung kepada tyrosinase. Sel Pigmen Melanoma Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.;Sato, Y.; et al. Analisis klinikal dan epidemiologi dalam 149 kes leukoderma yang disebabkan oleh rhododendron.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Vitiligo Akibat Kimia. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151–161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Kesan rawatan carvedilol pada ekspresi protein pengikat unsur cAMPresponse jantung dan fosforilasi dalam miokarditis akibat coxsackievirus B3-akut. BMC Cardiovasc. Kecelaruan. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Polimorfisme Steinberg, SF S49G dan R389G bagi isyarat pengaruh reseptor beta(1)-adrenergik melalui laluan cAMP-PKA dan ERK. Fisiol. Genom. 2013, 45, 1186–1192. [CrossRef]

38. Lee, AY; Noh, M. Peraturan melanogenesis epidermis melalui laluan isyarat cAMP dan/atau PKC: Pandangan untuk pembangunan agen hipopigmentasi. Gerbang. Pharm. Res. 2013, 36, 792–801. [CrossRef]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, laluan kem dan tindak balas terhadap UV suria: Memperluaskan ufuk melangkaui pigmentasi. Sel Pigmen Melanoma Res. 2014, 27, 699–720.[CrossRef]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; Harga Roydon, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M.Modulation of microphthalmia-related transcription factor ekspresi gen mengubah pigmentasi kulit.J. menyiasat. Dermatol. 2002, 119, 1330–1340. [CrossRef]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Yoo, H.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK menyekat melanogenesis dengan mengganggu ekspresi MITF yang bergantung kepada pengaktif transkripsi terkawal CREB 3-. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

42. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S.Catecholamine sintesis dimediasi oleh tyrosinase tanpa kehadiran tyrosine hydroxylase. J. Neurosci. 1999,19, 3519–3526. [CrossRef] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Marino, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Sintesis katekolamin endogen, metabolisme, penyimpanan dan pengambilan dalam neutrofil manusia. Life Sci. 1999, 64, 975–981. [CrossRef]

44. Marino, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Sintesis katekolamin endogen, penyimpanan metabolisme, dan pengambilan dalam sel mononuklear darah periferi manusia. Exp. Hematol.1999, 27, 489–495. [CrossRef]

45. Sorrento, D.; Santolli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Sel endothelial boleh mensintesis dan membebaskan katekolamin baik secara in vitro dan in vivo. Hipertensi 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Frattini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Katekolamin meningkat dalam air kencing vitiligo bukan segmen terutamanya semasa fasa aktifnya. Sel Pigmen Sel. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Penyiasatan struktur keperibadian pada pesakit dengan vitiligo dan kemungkinan persatuan dengan metabolisme katekolamin terjejas. Dermatologi 1995, 190, 109-115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Aktiviti neuroendokrin melanosit. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [CrossRef]

49. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kishan, V.; Rao, YM Penyerapan in vitro carvedilol melalui kulit babi: Kesan kenderaan dan penambah penembusan. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Pembangunan dan penilaian sistem penghantaran ubat transdermal yang dimuatkan carvedilol: Kajian pencirian in-vitro dan in-vivo. Pembangun Dadah. Ind. Pharm. 2012,38, 1530–1537. [CrossRef]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Pembangunan dan penilaian tompok transdermal carvedilol.Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]