Minyak Pati Camellia Japonica Menghalang -Penghasilan Melanin Terinduksi MSH Dan Aktiviti Tirosinase dalam Sel Melanoma B16F10

Kenalan: ali.ma@wecistanche.com

Si Young Ha , Ji Young Jung, dan Jae-Kyung Yang

Minyak pati ialah minyak aromatik yang diekstrak daripada daun, batang, kulit, kelopak, dan akar tumbuhan aromatik yang ditanam secara semula jadi yang tumbuh dalam kaedah organik dan mempunyai pelbagai kesan perubatan sebagai bahan semula jadi. Minyak pati yang diekstrak daripada biji Camelliajaponica mempamerkan pelbagai sifat berfungsi; namun, iatyrosinaseaktiviti perencatan belum disiasat secara meluas. -adalah kajian dilakukan untuk menyiasat komposisi kimia dan aktiviti perencatan tyrosinaseMinyak pati Camellia japonicaseed(CJS-EO). Hexamethylcyclotrisiloxane (42.36 peratus ) dan octamethylcyclotetrasiloxane (23.28 peratus ) ialah dua komponen utama CJS-EO, seperti yang dikenal pasti melalui spektrometri jisim kromatografi gas.The aktiviti menghalangCJS-EOdan arbutin kawalan positif dinilai selanjutnya terhadap tyrosinase cendawan.ThKeputusan menunjukkan bahawa CJS-EO dan arbutin menghalangtyrosinaseaktiviti. Selain itu, CJS-EO dengan ketara menghalang melanogenesis dalam kumpulan yang dirawat hormon merangsang -melanocyte, dan jumlah melanin yang ketara ditindas. Untuk memastikan punca CJS-EOtyrosinasekesan perencatan dan kesan pengurangan melanin, analisis genetik dan protein dilakukan. Berdasarkan keputusan kami, kami membuat kesimpulan sementaraCJS-EOboleh menghalang melanosit daripada faktor berbahaya seperti protein berkaitan tyrosinase. Keputusan ini menunjukkan bahawa CJS-EO mempunyai aktiviti potentantityrosinase dan mungkin merupakan kulit yang baik-pemutihanejen.

Klik untukCistanche UK untuk perencat tyrosinase.

pengenalan

Warna kulit dipengaruhi oleh pigmen seperti melanin dalam epidermis, hemoglobin dalam saluran darah dermis, dan karotena dalam tisu subkutan. Antaranya, warna kulit luaran ditentukan oleh jumlah dan pengedaran pigmen melanin [1]. Enzim yang terlibat dalam sintesis melanin dikenali sebagaityrosinase, protein berkaitan tyrosinase-1 (TRP-1), dan tautomerase dopachrome(DCT, TRP-2) [2]. Antaranya, tyrosinase ialah enzim yang bertindak dalam tindak balas awal, yang merupakan langkah penentu kadar sintesis melanin, dan mengoksidakan tyrosinase kepada DOPA quinone [3]. Oleh itu, bahan yang menghalangtyrosinase,TRP-1, dan TRP-2 boleh menghalang sintesis melanin dan dengan itu mempunyai kulit-pemutihanfungsi [4]. Melanin memainkan peranan penting dalam melindungi kulit daripada sinaran UV dan faktor luaran berbahaya dalam kulit manusia. Walau bagaimanapun, apabila ia dihasilkan secara berlebihan dan terkumpul pada kulit, ia boleh menyebabkan melasma, jeragat, bintik-bintik kulit, dan lain-lain, dan boleh menyebabkan kematian sel akibat ketoksikan prekursor melanin dan penyakit seperti kanser kulit [5-7].

Asid L-askorbik, arbutin dan asid laktik telah dibangunkan sebagai perencat pengeluaran melanin yang mewakili, tetapi penggunaannya dikawal ketat disebabkan oleh kerengsaan kulit atau masalah keselamatan. Oleh itu, penyelidikan sedang giat dijalankan untuk mencari agen pemutih semulajadi yang selamat dan berkesan [8].

Minyak pati tumbuhan diketahui mempamerkan pelbagai sifat berfungsi, seperti aktiviti antibakteria yang kuat dan kesan antipenuaan dan penjanaan semula kulit [9, 10]. Minyak pati Cinnamomum cassia [4], minyak pati Polygonum odoratum [11], dan minyak pati daun Vitex negundo Linn [12] telah dilaporkan mempunyaityrosinaseaktiviti menghalang.

Camellia japonica (nama Jepun "tsubaki") adalah pokok yang popular sebagai tumbuhan taman dan sumber bahan minyak dan perubatan rakyat di Jepun [13]. Di Korea, C. japonica ialah pokok malar hijau kepunyaan keluarga Theaceae dan genus Camellia [14]. Minyak biji C. japonica mempunyai sejarah penggunaan yang panjang sebagai pelindung kosmetik untuk memastikan kesihatan kulit dan rambut serta sebagai agen penenang [15]. Minyak C. japonicaseed telah dilaporkan mempamerkan pelbagai aktiviti biologi, termasuk aktiviti antioksidan [16], antibakterialaktiviti [17], aktiviti anti-radang [18], dan fungsi penghalang kulit [19]. Walaupun penggunaannya meluas, beberapa kajian telah mengkaji kesan minyak biji C. japonica pada kulit-pemutihan-berkaitantyrosinaseaktiviti.

Oleh itu, dalam kajian ini, komposisi kimia C. minyak pati biji japonica (CJS-EO) telah disiasat menggunakan kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS), dantyrosinaseaktiviti perencatan minyak pati ini telah diperiksa. Untuk menangani aktiviti perencatan ini, kesan daripadaCJS-EOpada melanogenesis yang dirangsang MSH dan perencatan tyrosinase dalam sel melanoma B16F10 telah dinilai.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Bahan Tumbuhan.

Benih C. japonica dibeli pada Mac 2021 daripada Seohyeon Herbal Medicine FarmingAssociation, Nonsan, Korea Selatan. Bahan tumbuhan telah dikenal pasti oleh Hee-Gon Kang, wakil dari hutan eksperimen Universiti Kebangsaan Gyeongsang.

Cistanche adalah salah satu ubat tradisional Cina

2.2. Reagen.

cendawantyrosinasetelah dibeli daripada T-3824 (Sigma–Aldrich, USA) dan tetikus B16F10 mela noma telah dibeli daripada CRL-6475 (AmericanType Culture Collection, Manassas, VA, USA). Media danreagen yang diperlukan untuk kultur sel telah dibeli daripada Invitrogen (AS), Sigma (AS), dan Nunc (AS). Forwestern blotting, kit western blot dan sistem pemindahan separa kering (Bio-Rad, USA) telah digunakan, dan keputusan telah disahkan menggunakan sistem analisis imej (Bio-Rad, USA). Antibodi telah dibeli daripada Santa Cruz Biotech (USA).Dimetil sulfoxide (DMSO) telah dibeli daripada Sigma-–Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.3. Pengekstrakan dan Penyediaan Sampel.

Pengekstrakan dilakukan menggunakan kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan sedikit pengubahsuaian [4]. Secara ringkas, biji C. japonica (500 g) dimasukkan ke dalam bekas dan diekstrak melalui penyulingan menggunakan 2000 mL air selama 4 jam. -ewap yang dihasilkan disejukkan menggunakan sistem penyejukan tertutup, dan cecair yang terhasil dikumpulkan dalam bekas. -e minyak terapung ke arah bahagian atas cecair suling, manakala air mendap ke dalam fasa bawah cecair; oleh itu,CJS-EOdiperoleh dengan mengeluarkan fasa atas cecair, yang mengandungi minyak yang diingini, dan kemudian disimpan pada -20 darjah sehingga digunakan. Penyelesaian 500 ppmstock CJS-EO dalam DMSO telah digunakan untuk eksperimen sel.

2.4. Analisis GC-MS.

Komponen yang tidak menentu bagiCJS-EOtelah dianalisis menggunakan GC-MS (Clarus 600 GC-MS, PerkinElmer, Shelton, CT, USA). Lajur analisis yang digunakan ialahPerkinElmer Elite-5 ms (3{{10}} mm × 0.3 mm × 0.25 μm). Gas helium (1.0 mL/min) digunakan sebagai fasa bergerak. Suhu ketuhar dinaikkan daripada 40 darjah kepada 100 darjah pada kadar 10 darjah/min dan kemudian dikekalkan selama 1.0 minit. Seterusnya, suhu dinaikkan kepada 230 darjah pada kadar 10 darjah/min dan kemudian dikekalkan selama 5 minit. -e suhu penyuntik telah ditetapkan kepada 200 darjah, dan suhu pengesan telah ditetapkan kepada 250 darjah. Keputusan yang dianalisis telah dikenal pasti menggunakan Program Carian Spektrum Massa NIST (Versi 2.0 g, Institut Piawaian dan Teknologi Kebangsaan, Gaithersburg, MD, Amerika Syarikat).

2.5. Kultur sel.

Sel melanoma tikus B16F10 telah dibeli daripada Bank Talian Sel Korea. Kultur sel dilakukan menggunakan DMEM (WELGENE, Daegu, Korea) ditambah dengan 10 peratus FBS (serum lembu janin, WEL GENE, Daegu, Korea) dan 1 peratus penicillin-streptomycin(Gibco BRL) pada 37 darjah dan 5 peratus keadaan CO2. Untuk menyelesaikan fenomena overdensity yang disebabkan oleh percambahan nombor sel, sel B16F10 yang dikultur dikekalkan pada nombor yang sesuai menggunakan trypsin (Hyclone, USA).

2.6. Ujian Daya Tahan Sel.

Sel melanoma B16F10 disemai pada 3 ×104/mL dalam 6-plat perigi untuk kultur sel.CJS-EOtelah dirawat pada kepekatan yang sesuai (31.25 ppm hingga 500 ppm) setiap telaga. -e medium telah dikeluarkan selepas 72 jam, dan 200 μL 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-larutan Diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Promega, Madison, WI, USA) telah dirawat. Reagen MTT dikeluarkan dengan bersih selepas pengeraman dalam inkubator CO2 37 darjah selama 2 jam. Untuk sel yang bernoda, 2 mL DMSO telah dirawat untuk melarutkan semua formazan yang dihasilkan dalam telaga. Daya tahan sel diukur dengan penyerapan pada 540 nm dengan pembaca ELISA (SpectraMax190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA).

2.7. Ujian Aktiviti Tirosinase.

Tirosinaseaktiviti dianggarkan dengan mengukur kadar pengoksidaan L-DOPA [20]. Sel B16F10 (2 ×105 sel/telaga) telah dirawat dengan hormon perangsang -melanocyte (-MSH) danCJS-EOdan dibiakkan selama 3 hari. Sel-sel telah dituai, penimbal lisis(1 peratus Triton X-100, 0.1 M PMSF) telah ditambah, dan kemudian sel-sel itu dilisiskan dengan bertindak balas pada 4 darjah selama 1 jam. -e supernatan dikumpul melalui sentrifugasi pada 12,000×g selama 15 minit. Selepas pengiraan protein dalam supernatan yang dikumpul, 10 mmol/mL L-DOPA telah ditambah. Seterusnya, sel diinkubasi dalam inkubator CO2 pada 37 darjah selama 30 minit dan penyerapan pada 490 nm direkodkan menggunakan pembaca plat mikro penyerapan (SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA). -e data yang diperolehi dikira menggunakan formula berikut: aktiviti tyrosinase ( peratus ) � (OD 490 sampel/OD490 kawalan) ×100.

2.8. Ujian Kandungan Melanin.

Sel B16F10 telah disemai dalam plat asix-well (2 × 105 sel/telaga) selama 12 jam selepas memperbaharui medium kultur sel yang dirawat dengan kepekatan CJS-EO dan -MSH yang berbeza selama 48 jam dan mencuci dengan PBS dua kali [21]. Sel B16F10 telah dirawat dengan -MSH danCJS-EObersama-sama, dikultur selama 3 hari, dan sel-sel dituai dan dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS). Selepas itu, ia dirawat dengan 1N NaOH yang mengandungi 10 peratus DMSO dan bertindak balas pada 80 darjah selama 1 jam. Untuk analisis kandungan melanin, penyerapan diukur pada 475 nmusing pembaca plat mikro penyerapan (SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA). -e peratusan nilai sel yang dirawat CJS-EO telah dikira berkenaan dengan kawalan negatif. Secara terperinci, Kit Ujian Protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, AS) telah digunakan untuk menentukan kepekatan protein setiap sampel. -kandungan emelanin telah dinormalkan kepada kepekatan protein selular (menyerap melanin/protein ug).

2.9. Penyiasatan Gen.

Sel melanoma B16F10 telah diinokulasi dalam hidangan 100 mm pada ketumpatan 1 × 106 sel dalam DMEM (GIBCO, USA) ditambah dengan 10 peratus bovineserum dan 1 peratus antibiotik; kemudiannya, mereka diinkubasi dalam 5 peratus CO2 pada 37 darjah . Selepas menukar kepada medium DMEM 10 peratus baharu,CJS-EOtelah ditambahkan pada plat kultur dan dikultur selama 3 hari, dan 1 peratus Amisoft sebagai surfaktan telah ditambah dalam jumlah yang sepadan dengan 1/1,000 isipadu sederhana. Selepas 3 hari, 1 mL TRIzol (Invitrogen, USA ) telah ditambahkan pada sel untuk menyiasat tahap ekspresi mRNA bagipemutihangen yang berkaitan, dan RNA telah diasingkan menggunakan kaedah pengasingan RNA Invitrogen. Selepas mengukur jumlah RNA pada 260 nm menggunakan pengesan ultraviolet, tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik (RT-PCR) telah dilakukan. Untuk RT-PCR, kit RT-PCR semua-dalam-satu (Super Bio, Korea) telah digunakan, eksperimen dilakukan berdasarkan arahan pengilang, dan keadaan primer dan tindak balas adalah seperti berikut: jujukan ofactin ialah 5'- GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3';antisense, 5′-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3';transkripsi terbalik pada 50 darjah selama 30 minit; transkripase terbalik dinyahaktifkan pada 96 darjah selama 3 minit, 94 darjah selama 30 s, dan 62 darjah selama 1 minit, diikuti oleh 25 kitaran pada 72 darjah selama 1 minit. Urutantyrosinaseialah 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT 3'; antisense, 5′-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3';didenaturasi pada 90 darjah selama 30 saat; transkripsi terbalik pada 60 darjah selama 30 minit; transkripase terbalik dinyahaktifkan pada 94 darjah selama 1 minit. Selepas itu, PCR dilakukan selama 30 kitaran pada 94 darjah selama 30 saat, 56 darjah selama 30 saat, dan 72 darjah selama 1 minit. -e jujukan protein berkaitan tyrosinase 1 (TRP-1) ialah 5′-GCT GCA GGAGCC TTC TTT CTC-3'; antisense, 5′-AAG ACG CTG CACTGC TGG TCT-3'; denaturasi pada 90 darjah selama 30 saat; transkripsi balik pada 60 darjah selama 30 minit; transkripase terbalik tidak diaktifkan pada 94 darjah selama 1 minit. Selepas itu, PCR dilakukan selama 30 kitaran pada 94 darjah selama 30 saat, 56 darjah selama 30 saat, dan 72 darjah selama 1 minit. -e urutan daripadatyrosinase-protein berkaitan 2 was5′-TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'; antisense, 5′-CGGTTG TGA CCA ATG GGT GCC-3'; transkripsi terbalik pada 50 darjah selama 30 minit; penyahaktifan transkripase terbalik pada 96 darjah selama 3 minit, 94 darjah selama 1 minit, dan 60 darjah selama 1 minit. Selepas itu, 72 tindak balas PCR dilakukan dalam 25 kitaran selama 1 minit.

2.10. Penyiasatan Ekspresi Protein.

Sel B16F10melanoma tikus telah diinokulasi dalam hidangan 100 mm pada ketumpatan 5 × 105 sel dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus antibiotik dan kemudian dibiakkan dalam 5 peratus CO2 pada 37 darjah selama 1 hari. Selepas itu, mereka ditukar dengan medium baru, danCJS-EOtelah dirawat pada kepekatan yang berbezadan dikultur selama 3 hari. Larutan berair 1 peratus Amisoft sebagai asurfaktan telah ditambahkan pada isipadu yang sepadan dengan 1/1{13}}00 daripada isipadu sederhana. -e sel kultur dibasuh dengan PBS dan dipindahkan ke tiub mikro 1.5 mL dan kemudian ke penimbal gangguan sel (40 mM Tris-Cl [pH 7.4], 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0.1 peratus NP-40, 1 mM PMSF, dan koktel proteaseinhibitor). Selepas sel dimusnahkan dengan penambahan, sentrifugasi dilakukan pada 15,000 rpm pada 4 darjah selama 10 minit, dan supernatan telah diperoleh semula untuk memisahkan protein. -e protein terpencil dikira menggunakan kaedah Sigma'sBCA, dan SDS-PAGE telah dilakukan. Selepas memindahkan gel SDS-PAGE ke membran PVDF, protein dilabelkan menggunakan antibodi sekunder yang digabungkan dengan antibodi primer dan peroksidase dan kemudian didedahkan kepada filem sinar-X menggunakan kit pengesan blot barat (Intron, Korea). Selepas itu, tahap ekspresi dianalisis.

3. Keputusan

3.1. Komposisi Kimia CJS-EO.

CJS-EO diperolehi pada hasil 18 peratus b/b. -e komposisi kimia CJS-EO telah dianalisis menggunakan GC-MS (Jadual 1). -e puncak dikelaskan dalam GC, dan 17 sebatian telah dikenal pasti melalui MS, yang membentuk 90 peratus daripada jumlah kawasan puncak (Jadual 1). -emain komponen kimiaCJS-EOialah hexamethylcyclotrisiloxane (42.36 peratus), octamethylcyclotetrasiloxane (23.28 peratus), decamethylcyclopentasiloxane (5.81 peratus), asid heksanedoik (5.56 peratus), dan vanillin (2.96 peratus). Dalam kajian terdahulu, analisis GC-MS mengesan hexamethylcyclotrisiloxane dalam ekstrak daun dan batang Bauhinia acuminataLinn [22]. Komponen meruap dalam Moringa oleifera terutamanya terdiri daripada ester, asid, aldehid, dan hidrokarbon, dan hidrokarbon terutamanya heksametilsiklotrisiloxane [23]. Begitu juga, dalam kajian kami, hexamethylcyclotrisiloxane telah disahkan sebagai komponen kimia utama CJS-EO. Salah satu komponen kimia utama CJS-EO, vanillin, dikesan dalam minyak pati Eugenia caryophyllata dan Ocimum basilicum[24], minyak pati Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae) [25], dan minyak pati Calea clematidea [26]. Dalam kajian terdahulu, kesan perencatan vanillin terhadap aktiviti mono phenolase dan diphenolase yang terkandung dalamtyrosinasetelah dilaporkan sebelum ini [27]. Menariknya, sebatian metilsiloksana meruap kitaran berat molekul rendah termasuk heksametilsiklotrisiloksana telah digunakan dalam pelbagai produk kosmetik dan penjagaan diri dan banyak produk pengguna yang lain [28]. Pada masa hadapan, sebatian yang bertanggungjawab untuk menghalang pengeluaran melanin dan aktiviti tyrosinase akan diekstrak dan boleh digunakan dalam kosmetik semula jadi atau perubatan.

3.2. Daya Tahan Sel Sel Melanoma Disebabkan oleh CJS-EO.

Keputusan kami menunjukkan bahawa sel murine melanoma B16F10 dirawat dengan kepekatan 31.25 hingga 500 ppmCJS-EOselama 24 jam tidak menyebabkan sebarang perubahan dalam daya maju sel. Pada kepekatan 31.25 hingga 500 ppm, daya maju sel adalah 90 peratus hingga 100 peratus, yang menunjukkan sitotoksisiti rendah (Rajah 1).-Oleh itu, semua kepekatan (31.25 hingga 500 ppm) adalah sesuai untuk menilai selanjutnya kesan CJS-EO padatyrosinaseaktiviti dan sintesis melanin dalam sel B16F10.

3.3. Perencatan Aktiviti Tirosinase Intraselular CJS-EO.

Kesan daripadaCJS-EOpada pengoksidaan L-DOPA yang dimangkinkan oleh bytyrosinase, serta arbutin, yang terkenaltyrosinaseperencat, telah disiasat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, CJS-EO andarbutin mempamerkan kesan perencatan yang kuat pada aktiviti pengoksidaan L-DOPA dalam cara yang bergantung kepada dos. -e keputusan menunjukkan bahawa CJS-EO dan arbutin mempamerkan aktiviti perencatan tyrosinase yang serupa. Berdasarkan analisis statistik, arbutin mempunyai aktiviti perencatan tyrosinase yang jauh lebih tinggi daripada CJS-EO pada 125 dan 500 ppm. Walau bagaimanapun, pada 31.25, 32.50, dan 250 ppm, kesan perencatan yang serupa (tidak ketara) ditunjukkan pada tyrosinase apabila dibandingkan dengan aktiviti perencatan tyrosinase CJS-EO pada arbutin perencat tyrosinase yang terkenal.

3.4. Kesan CJS-EO pada Kandungan Melanin dalam Sel B16F10.

Untuk mengesahkan sama ada CJS-EO menyumbang kepada perencatan pengeluaran melanin, perbezaan dalam rembesan melanin selepas rawatan dengan setiap kepekatan CJS-EO telah dianalisis di bawah persekitaran yang menggalakkan pengeluaran melanin oleh rangsangan -MSH.CJS-EOtelah dirawat pada kepekatan 31.25, 62.5, 125, 250, dan 500 ppm, dengan cara yang sama seperti untuktyrosinaseaktiviti. CJS-EO dengan ketara menghalang melanogenesis dalam kumpulan yang dirawat -MSH, dan jumlah melanin yang ketara telah ditindas (Rajah 3(b)).-adalah serupa dengan pemerhatian dalam kawalan positif, arbutin (Rajah 3(a)). Khususnya, pada kepekatan terendah 32.25 ppm dalam kumpulan yang dirawat, kandungan melanin berkurangan dengan ketara berbanding dengan kumpulan yang tidak dirawat (0 ppm). Oleh itu, disimpulkan bahawa CJS EO berkesan menghalang sintesis atau rembesan sel melaninin B16F10. Dalam kumpulan 31.25, 62.5, 125, 250, dan 500 ppm CJS-EO yang dirawat, kandungan melanin masing-masing menurun sebanyak 1.1, 1.5, 2.6, 2.7 dan 4.3 kali, berbanding dengan kumpulan yang tidak dirawat, menunjukkan rembesan melanin yang menonjol. kesan. -e ujian sitotoksisiti, ujian tyrosinaseinhibition dan keputusan ujian kandungan melanin menunjukkan bahawa CJS-EO sangat berharga sebagai bahan semula jadi dalampemutihankosmetik.

3.5. Penyiasatan Genetik.

Untuk menentukan gen dalamCJS-EOyang menghalang biosintesis melanin dengan menjejaskan ekspresi gen yang terlibat dalam laluan biosintesis melanin, percubaan dilakukan menggunakan kaedah RT-PCR, dan keputusan ditunjukkan dalam Rajah 4. -MSH digunakan sebagai kawalan anegatif, dan CJS-EO menunjukkan kesan perencatan pada ungkapan tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2 pada semua kepekatan. Khususnya, CJS-EO menghalang ekspresi oftyrosinase lebih daripada 50 peratus pada 125 ppm atau lebih tinggi. Kami mendapati bahawa keberkesanan menghalangtyrosinaseEkspresi , TRP-1 dan TRP-2 menurun apabila kepekatan CJS EO meningkat. -e hasil percubaan ini mencadangkan bahawa kesan perencatan themelanogenesis CJS-EO menyumbang kepada perencatan ekspresi tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2.

3.6. Penyiasatan Ekspresi Protein.

Kesan CJS-EO terhadap ekspresi protein yang terlibat dalam biosintesis melanin telah disahkan menggunakan western blotting, dan hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 5. Apabila CJS-EO dibandingkan dengan kumpulan yang dirawat -MSH, yang merupakan kumpulan kawalan negatif, ia adalah mengesahkan ituCJS-EOmempamerkan kesan perencatan; sebenarnya, CJS-EO mempamerkan kesan perencatan yang paling menonjol pada tyrosinase dan TRP-2. -e darjah perencatan ialah 46.6 peratus dan 40.7 peratus pada 500 ppm tyrosinase dan TRP-2, masing-masing, berbanding dengan kumpulan yang dirawat -MSH. Walaupun TRP-1menunjukkan kesan perencatan paling sedikit, ia menunjukkan penurunan yang ketara berbanding kumpulan yang dirawat -MSH. Oleh itu, analisis protein menunjukkan trend yang sama seperti analisis gen, dan telah disahkan bahawa CJS-EO merangsangtyrosinase, TRP-1 dan TRP-2 untuk mendorong pengurangan melanin.

4. Perbincangan

Tirosinaseadalah enzim yang terlibat dalam pengeluaran melanin melalui laluan oksidatif enzimatik, yang menentukan warna kulit, rambut, dan mata, serta keperangan makanan tertentu [29]. Ejen kimia yang menunjukkan aktiviti antityrosinase telah digunakan dalam perubatan klinikal untuk rawatan gangguan dermatologi yang berkaitan dengan hiperpigmentasi melanin [30]. Pengeluaran melanin boleh menyumbang kepada beberapa ciri histopatologi eksklusif kepada kanser malignan [31]. Oleh itu, bahan antityrosinase boleh memudahkan rawatan kanser kulit. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penggunaan produk semula jadi dan bukannya sebatian kimia atau sintetik telah mendapat minat yang semakin meningkat kerana ia lebih menjimatkan, mesra alam dan selamat [32]. Selain itu, penyelidikan dan pembangunan teknologi hijau dan bahan mentah kos rendah adalah penting untuk industri serta untuk menambah baik penggunaan sumber tumbuhan. Baru-baru ini, aktiviti antitirosinase tumbuhan tertentu telah dilaporkan [33]. Walau bagaimanapun, data yang berkaitan dengan minyak pati tumbuhan semula jadi adalah terhad. Oleh itu, pengenalpastian minyak pati tumbuhan yang mempunyai aktiviti antitirosinase tinggi telah menarik minat yang ketara. -etiologi pigmentasi tidak difahami dengan baik. Biosintesis melanin dimangkinkan oleh enzim khusus melanosit seperti TRP-1 dan TRP-2 [34].Tirosinaseadalah penting untuk melanosit melaninbiosintesis dan telah diketahui selama beberapa dekad [34]. Oleh itu, tyrosinase adalah indeks penting untuk rawatan pigmentasi. Dalam kajian kami, CJS-EO menurunkan melaninsintesis dan menjejaskan aktiviti antityrosinase; oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa antilanogenesis oleh CJS-EO mungkin dikaitkan dengan enzim lain (TRP-1 dan TRP-2). Bahan meruap telah dilaporkan menunjukkan aktiviti antioksidan yang tinggi [35]. Sebagai tidak menentu, CJS-EO dicirikan oleh bau yang menyengat. Ia disintesis oleh tumbuhan sebagai metabolit sekunder dan telah digunakan secara meluas kerana aktiviti bakteria, virucidal, fungicidal, antikanser, antioksidan, dan antidiabetiknya [36]. -e CJS-EO yang disiasat dalam kajian ini terutamanya terdiri daripada hexamethylcyclotrisiloxane, yang membentuk 42.36 peratus daripada jumlah kandungan kimia. Toxicodendron vernicifluum yang mengandungi hexamethylcyclotrisiloxane telah ditunjukkan untuk mempamerkan pelbagai aktiviti biologi dan farmakologi, termasuk aktiviti pusat, antimikrobial [37]. Dalam kajian kami, kepekatan tinggi CJS-EO menunjukkan hanya sedikit kesan sitotoksik pada melanosit. Oleh itu, kesan perencatan CJS-EO pada pembiakan sel B16F10 yang disebabkan oleh -MSH diperhatikan. -hasil menunjukkan bahawa prarawatan dengan CJS-EO mengurangkan pembiakan sel yang disebabkan oleh MSH dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 3), dan keputusan ini adalah serupa dengan purearbutin yang digunakan sebagai kawalan positif. Dalam kebanyakan minyak pati semulajadi yang digunakan dalam perubatan tradisional, ekstrak yang mengandungi sebatian kompleks digunakan dan bukannya sebatian tulen. Minyak pati semulajadi ini biasanya tidak mengandungi sebatian volatiliti dengan bioaktiviti yang sangat spesifik tetapi sebatian volatiliti dengan interaksi yang lebih luas [38]. Oleh itu, adalah sukar untuk CJS-EO, yang mengandungi banyak komponen, mempunyai kesan antitimelanogenesis yang lebih tinggi daripada arbutin tulen. Pada masa hadapan, adalah perlu untuk mengasingkan komponen yang tidak menentu yang terkandung dalamCJS-EOdan mengkaji kesan antilanogenesis pada komponen tunggal yang dipisahkan. Berdasarkan keputusan kami, secara wetentatif membuat kesimpulan bahawa CJS-EO boleh menghalang melanosit daripada faktor berbahaya seperti TRP-1 (Rajah 4 dan 5).Tholeh itu, kami mengandaikan bahawa heksametilcyclotrisiloxane adalah sebatian aktif biologi utama dalam CJS-EO. Kajian sedia ada berkenaan denganpemutihanharta CJS-EO tidak mencukupi; oleh itu, ia boleh digunakan sebagai data asas dalam kajian masa hadapan yang berkaitan dengan bahan utama yang menunjukkan keberkesanan pemutihan.

5. Kesimpulan

Untuk pengetahuan terbaik kami, ini adalah kajian pertama yang melaporkan keberkesanan CJS-EO dalam menghalang pengeluaran melanin dalam sel B16F10melanoma. Pemerhatian kami menunjukkan bahawa CJS-EOinhibited -MSH-induced melanogenesis melaluityrosinasepenyahaktifan dan penindasan serentak ekspresi protein yang terlibat dalam biosintesis melanin dalam sel melanoma B16F10.CJS-EOdiketahui selamat, dan kami mengesahkan bahawa ia bukan sitotoksik dalam kajian ini.Tholeh itu, CJS-EO berpotensi boleh digunakan sebagai kulit yang berkesan-pemutihanagen untuk pembangunan masa depan aromaterapi berasaskan perubatan pelengkap dan alternatif.