Tindak Balas Biokimia Dan Histopatologi Biomphalaria Alexandrina Kepada RIPEX (Pengawal Pertumbuhan Tumbuhan)Ⅰ

Abstrak

Latar belakang

Pengawal selia pertumbuhan tumbuhan digunakan secara meluas dalam pertanian untuk meningkatkan pertumbuhan dan pematangan tumbuhan, tetapi ia membahayakan ekosistem akuatik. Kajian semasa menilai kesan pendedahan sublethal kepada RIPEX 48 peratus kepekatan EC (8 dan 16 µL/L) pada parameter tekanan oksidatif, hormon seks, enzim potensi imun, kiraan hemosit berbeza, dan histopatologi kelenjar pencernaan dan ovotestis dalam Siput Biomphalaria alexandrina.

Klik untuk cistanche herba untuk testosteron

Keputusan

Pendedahan RIPEX menyebabkan peningkatan keseluruhan aktiviti Superoxide dismutase dan Glutathione-S-Transferase di B. Alexandrina. Walau bagaimanapun, pendedahan RIPEX yang melampau menghalang aktiviti SOD dalam siput. Aktiviti malondialdehid menunjukkan peningkatan dalam B. Alexandrina yang terdedah kepada kedua-dua kepekatan selepas semua tempoh pendedahan. RIPEX juga menyebabkan peningkatan ketara dalam testosteron dalam siput yang terdedah kepada 16 µL/L, namun ia mengurangkan tahap hormon dalam siput yang terdedah kepada 8 µL/L pada 7 hari. Mengenai estradiol, terdapat peningkatan yang ketara selepas 3 hari pendedahan kepada 16 µl/L dan 7 hari pendedahan kepada 8 µL/L. Pendedahan RIPEX juga meningkatkan aktiviti enzim Myeloperoxidase dan Adenosine deaminase dalam kelenjar pencernaan siput. Ia meningkatkan jumlah bilangan hemosit siput terdedah serta bilangan granulosit. Kelenjar pencernaan siput dan ovotestis menunjukkan perubahan patologi selepas 7 hari pendedahan RIPEX.

Kesimpulan

Penemuan ini menunjukkan bahawa RIPEX adalah toksik kepada B. Alexandrina dan siput ini boleh digunakan sebagai bioindikator untuk pencemaran alam sekitar dengan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan.

Kata kunci

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testosteron, Estradiol, Myeloperoxidase, Adenosine deaminase, Histopatologi

1 Latar Belakang

Pencemaran agrokimia air permukaan adalah kebimbangan alam sekitar global yang semakin meningkat, terutamanya di kawasan di mana pertanian berkembang pesat dan semakin giat. Pelbagai bahan kimia sintetik, seperti racun perosak atau baja, digunakan untuk mengubahsuai kuantiti dan kualiti tanaman untuk memenuhi keperluan pelanggan [7, 40]. Penggalak pertumbuhan tumbuhan adalah agrokimia biasa di banyak negara [18].

Apabila bahan kimia ini dihidu secara langsung atau dimakan bersama sayur-sayuran yang tercemar, ia menjejaskan kesihatan manusia [39]. Racun perosak organophosphorus, ethephon (2-asid klooetil fosfonik) ialah bahan kimia sintetik pembebas etilena yang biasanya digunakan sebagai pengawal selia pertumbuhan tumbuhan (PGR) untuk menggalakkan aruhan fower, pematangan buah dan tindak balas fisiologi yang lain. Ia diluluskan untuk digunakan pada pelbagai makanan, makanan, bukan makanan, stok semaian rumah hijau, dan tumbuhan hiasan yang ditanam di luar rumah [3, 50]. Penilaian makmal ketoksikan ethephon menunjukkan bahawa ethephon menyebabkan kecacatan morfometrik antena kedua, bulu deria, tulang belakang ekor, dan mimbar Daphnia magna yang membawa kepada kehilangan fungsi dan kematian [54].

Abd-El Azeem [1] merekodkan pengurangan kadar pertumbuhan, kerosakan DNA, dan kesan apoptosis dalam sel kelenjar pencernaan slug Deroceras reticulatum selepas terdedah kepada ethephon. Ramai pengarang meluluskan ketoksikan Ethephon pada tikus dan burung [2, 17, 55]. Tambahan pula, pendedahan ethephon menyebabkan genotoksisiti, tekanan oksidatif, dan ketoksikan pembiakan pada tikus [16]. Teratogenisiti dan disfungsi sistem gonad pada tikus juga telah dikaitkan dengan pendedahan ethephon [2, 16]. Ethephon juga telah ditunjukkan sebagai imunotoksik, mempunyai kesan mutagenik [26], meningkatkan tekanan oksidatif, dan menurunkan kepekatan asid deoksiribonukleik dan Ribonukleik [4].

Ethephon dalam badan air boleh membahayakan fauna akuatik; namun, data tentang kesannya terhadap organisma akuatik adalah terhad. Beberapa spesies akuatik telah digunakan untuk mengesan hormon pertumbuhan tumbuhan dalam sistem akuatik. Walau bagaimanapun, sesetengah organisma ini mencabar untuk memanipulasi dan menyelenggara dalam makmal, menjadikannya lebih sukar untuk digunakan dalam penilaian ekotoksikologi [54]. Moluska akuatik, termasuk siput, baru-baru ini mendapat perhatian sebagai organisma ujian kerana keperluan untuk membangunkan model invertebrata untuk pemantauan alam sekitar terhadap bahan cemar akuatik [21, 45]. Siput adalah kumpulan moluska yang paling banyak dalam sistem akuatik. Siput memberikan alternatif yang kurang eksploitatif kepada vertebrata yang lebih tinggi sebagai bioindikator kerana ia boleh digunakan dalam pelbagai eksperimen tanpa mendapatkan kelulusan etika, dan pemerolehan dan penyelenggaraannya adalah murah [13].

Dalam hal ini, siput Biomphalaria alexandrina telah digunakan secara meluas sebagai organisma penunjuk pencemaran air tawar dengan racun perosak [29, 30]. Di luar potensinya sebagai bioindikator, siput ini bertindak sebagai perumah perantaraan untuk penghantaran Schistosoma mansoni [35]. Oleh itu, kepekatan agrokimia dalam persekitaran boleh mempengaruhi penghantaran schistosomiasis melalui kesan langsung dan tidak langsung pada hos perantaraan dan kepadatan parasit [27]. Penyiasatan ini bertujuan untuk menyiasat kesan pendedahan sublethal kepada pengawal selia pertumbuhan tumbuhan, RIPEX 48 peratus EC (nama dagangan ethephon, 2-asid chloroethyl phosphonic) ke atas pelbagai aspek biokimia, imunologi dan histologi B. alexandrina siput sebagai organisma bioindikator.

2 Kaedah

2.1 Menguji organisma

Siput biomphalaria alexandrina dikumpul dari Tasik Manzalah yang terletak di El-Matareya, Gabenor Dakahlia, Mesir (31 darjah 11′ N 32 darjah 2′ E) dan dikekalkan dalam air paip berudara baik pada suhu malar 20 darjah . Mereka diberi makan daun salad segar setiap hari. Selepas penyelenggaraan selama 4 minggu di bawah keadaan makmal, siput matang yang sihat (10-12 mm diameter cangkerang) digunakan dalam eksperimen seterusnya.

2.2 Bahan eksperimen dan keadaan pendedahan

Pengawal selia pertumbuhan tumbuhan, RIPEX (bentuk penyelesaian yang mengandungi 48 peratus etefon [2- asid kloroetil fosfonik (C2H6ClO3P)] dan 52 peratus bahan lengai) telah dibeli daripada Chema Industries (bandar New Nubaria, Behira, Mesir; lesen pendaftaran No 1840). Satu siri kepekatan telah disediakan. Replika pokok dengan sepuluh ekor setiap satu telah terdedah. Selepas 1-hari pendedahan, siput mati dikira dan dikeluarkan serta LC50 dan LC90 dikira oleh perisian statistik sains sosial (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Reka bentuk eksperimen

Dua kepekatan sublethal yang mewakili LC10 dan LC20 telah digunakan (8 dan 16 µL/L). 90 ekor siput dibahagikan kepada tiga kumpulan, setiap kumpulan dengan tiga replika (sepuluh ekor siput/replika): kumpulan kawalan, kumpulan 8 μL/L-terdedah, dan kumpulan 16 µL/L-terdedah. Pada selang 1-, 3- dan 7-hari, biomarker tekanan oksidatif dan enzim potensi imun telah dinilai dalam kelenjar pencernaan. hormon steroid dinilai dalam Ovotestis. Kiraan hemosit yang berbeza, dan histologi kelenjar pencernaan dan ovotestis telah dinilai. Untuk penyiasatan biokimia, 0.5 g tisu (kelenjar pencernaan atau ovotestis) daripada setiap kumpulan dihomogenkan dalam 0.5 mL penimbal fosfat (pH 6.5) menggunakan homogenizer kaca dan disentrifugasi pada 10,000×g, 4 darjah selama 10 minit . Supernatan yang terhasil digunakan untuk ujian seterusnya.

2.4 Penentuan penanda tegasan oksidatif

2.4.1 Superoksida dismutase (SOD, EC 1.15.1.1)

Aktiviti SOD ditentukan menggunakan EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (Cat. No: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) mengikut arahan pengilang. Tisu homogenat menggunakan penimbal lisis sejuk (50 mM kalium fosfat, 0.1 mM EDTA dan 0.5 peratus Triton X-100) telah disentrifugasi pada 12,000g selama 5 minit pada 4 darjah , dan supernatan dikumpul untuk penentuan SOD [43]. Aktiviti SOD diukur pada ketumpatan optik (OD) pada 440 nm.

2.4.2 Glutathione‑S‑Transferase (GST, EC 2.5.1.18)

Enzim ini memangkinkan konjugasi GSH dengan {{0}}chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). Ia diukur secara spektrofotometri pada 340 nm. Campuran tindak balas mengandungi penimbal Kalium fosfat 0.1 M, pH 6.5, GSH terlarut dalam penimbal kalium fosfat (140 mg/100 mL), dan CDNB 4 mg/ml dalam etil alkohol. Satu unit aktiviti enzim ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang memangkinkan pembentukan 1 μmol S-konjugat seminit [11].

2.4.3 Malondialdehid (MDA)

Malondialdehid dalam homogenat keseluruhan ditentukan sebagai bahan reaktif asid thiobarbituric (TBARS) mengikut kaedah piawai Ohkawa et al. [37]. Campuran tindak balas termasuk 0.1 mL homogenat tisu, isipadu larutan Sodium Dodecyl Sulfate yang sama, 0.75 mL asid asetik, 0.75 mL asid tiobarbiturik, dan 0.3 mL air suling. Komponen ini dicampur dalam pusaran dan diinkubasi dalam mandi air mendidih selama 1 jam kemudian disejukkan ke suhu bilik. Sepuluh 0.5 mL air suling dan 2.5 mL n-butanol telah ditambah pada setiap tiub dan bercampur kuat dengan pusaran kemudian diputar dalam emparan pada 2,500×g selama 10 minit. Penyerapan dibaca pada 532 nm.

2.5 Penentuan hormon

2.5.1 Testosteron

Testosteron ditentukan menggunakan testosteron Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Cat. No: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA), Testosteron ialah androgen utama yang memberi kesan kepada perkembangan seksual primer dan sekunder sebagai dorongan seks. 100 µL pencair piawai (penampan ujian 3 atau media kultur tisu) telah dipipet ke dalam perigi pengikatan tidak khusus dan pengikatan maksimum (piawaian 0 pg/mL). Selepas itu 100 µL standard #1 hingga #5 ke dalam telaga yang sesuai. Sampel (100 µL) telah dipipet ke dalam telaga yang sesuai dan 50 µL penimbal ujian 3 ke dalam telaga pengikat tidak spesifik. Juga, 50 µL antibodi kuning telah ditambah ke dalam setiap telaga, kecuali kosong, jumlah aktiviti, dan telaga pengikat tidak spesifik. Pengeraman plat pada suhu bilik pada penggoncang plat selama 1 jam pada 500 rpm. Selepas itu, 50 µL konjugat biru dimasukkan ke dalam setiap telaga, kecuali untuk jumlah aktiviti dan telaga kosong. Selepas mengosongkan telaga daripada kandungannya, pencucian dilakukan dengan menambahkan 400 µL larutan pencuci ke setiap telaga sebanyak 3 kali. Konjugat biru (5 µL) telah ditambah kepada jumlah telaga aktiviti dan 200 µL larutan p-nitrofenil fosfat telah ditambah ke setiap telaga dan diinkubasi pada 37 darjah selama 1 jam tanpa goncang. Pembacaan plat pada 405 nm telah dijalankan selepas menambah 50 µL larutan henti kepada setiap telaga [12, 48].

2.5.2 Estradiol

Estradiol ditentukan menggunakan kit estradiol ELIZA (Cat. No: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) mengikut protokol pengeluar. Prinsip tindak balas ini adalah berdasarkan kepekatan pengesan estradiol acetylcholinesterase (AChE) adalah malar, tetapi kepekatan estradiol asli berbeza-beza oleh itu jumlah pengesan estradiol acetylcholinesterase (AChE) yang mengikat kepada antiserum estradiol adalah berkadar songsang dengan kepekatan estradiol asli. dalam perigi. Penampan ELISA 100 µL telah ditambahkan pada telaga pengikat tidak spesifik dan pengikat maksimum. Penambahan 50 µL dari tiub #8 kepada kedua-dua telaga piawai terendah (Standard 8) dan 50 µL dari tiub #7 kepada setiap telaga piawai seterusnya (Standard 7). Satu sampel (50 µL) telah ditambah kepada setiap telaga. Estradiol AChE Tracer (50 µL) telah ditambah kepada setiap jumlah aktiviti dan telaga kosong. Selepas itu antiserum Estradiol ELISA (50 µL) telah ditambah kepada setiap telaga kecuali untuk jumlah aktiviti, pengikatan tidak spesifik, dan telaga kosong. Selepas pengeraman shaker orbital (2 jam pada suhu bilik), penyerapan diukur pada 414 nm [52].

2.6 Penentuan enzim potensi imun

2.6.1 Myeloperoxidase (MPO, EC 1.11.2.2)

Satu unit aktiviti MPO ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang menghidrolisiskan substrat dan menjana taurin kloramin untuk menggunakan 1.0 μmol TNB seminit pada 25 darjah . MPO ditentukan menggunakan kit ujian aktiviti kolorimetrik myeloperoxidase (Cat. No: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA). Penyerapan diukur pada 412 nm.

2.6.2 Adenosine deaminase (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA ialah enzim yang memangkinkan penukaran adenosin dan 2'-deoxyadenosine kepada inosin dan 2'-deoxyinosine. ADA ditentukan mengikut prinsip buletin teknikal kit ujian aktiviti adenosine deaminase (No. Cat.: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Jerman). Satu unit adenosin deaminase ialah jumlah enzim yang menghidrolisis adenosin untuk menghasilkan 1.0 μmol inosin seminit pada 37 darjah. Reagen ialah penimbal ujian 1×ADA (41 μL), Penukar ADA (2 μL), pembangun ADA (2 μL), dan substrat ADA (5 μL).

2.7 Kiraan hemosit yang berbeza

Hemolimfa dikumpulkan dari siput (kawalan, terdedah) menurut Sminia [47]. Selepas disentuh pada bahagian kepala-kaki dengan pipet Pasteur, siput itu terpaksa menarik balik jauh ke dalam cangkerangnya dan mengeluarkan hemolimfa, yang dikumpulkan untuk kiraan hemosit yang berbeza. Hemolymph disapu pada slaid mikroskop untuk merebak. Selepas penetapan dalam 99.8 peratus metanol selama 5 minit, slaid diputar pada sudut 45 darjah untuk pengeringan pada suhu bilik dan diwarnakan dengan pewarnaan Giemsa selama 20 minit. Pembezaan hemosit ditentukan untuk berkadar dengan mengira 100.

2.8 Penyiasatan histologi

Pemeriksaan histologi telah dijalankan selepas 7 hari pendedahan kepada 8 dan 16 µL/L RIPEX. Kelenjar pencernaan dan ovotestis telah dibedah dan serta-merta dipasang dalam cecair Bouin᾿s. Selepas 1 hari penetapan, sampel kemudiannya didehidrasi melalui beberapa siri alkohol dan dibersihkan dalam xilena. Blok lilin parafin telah dibuat [42]. Sepuluh Mazhab. (ketebalan 5-7 μm) dipotong dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (Mayer's H dan E). Pewarnaan diikuti dengan basuhan yang baik dengan air paip. Bahagian histologi diambil gambar menggunakan kamera automatik foto (Optika, Itali).

2.9 Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai dan dianalisis oleh perisian statistik sains sosial (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). Analisis varians ANOVA dua hala digunakan untuk mengenal pasti perbezaan antara kumpulan kawalan dan terdedah, antara kepekatan yang berbeza dan titik masa pendedahan. Tahap keertian telah ditetapkan pada p Kurang daripada atau sama dengan 0.05.

Mekanisme Cistanche meningkatkan kesan testosteron

Cistanche telah didapati untuk meningkatkan tahap testosteron dalam beberapa cara. Pertama, ia mengandungi sebatian yang dikenali sebagai echinacoside dan acteoside, yang telah ditunjukkan dapat meningkatkan pengeluaran hormon luteinizing (LH) dalam kelenjar pituitari. LH merangsang sel Leydig dalam testis untuk menghasilkan testosteron. Cistanche juga mengandungi polisakarida dan glikosida phenylethanoid, yang telah terbukti mempunyai sifat antioksidan dan anti-radang. Ini boleh membantu mengurangkan tekanan oksidatif dan keradangan dalam testis, yang boleh menjejaskan pengeluaran testosteron Selain itu, Cistanche telah didapati meningkatkan ekspresi gen yang terlibat dalam sintesis testosteron dan mengurangkan aktiviti enzim yang memecahkan testosteron, seperti {{1} }alfa-reduktase. Secara keseluruhan, gabungan mekanisme ini dianggap menyumbang kepada kesan peningkatan testosteron Cistanche.

Hoda H. Abdel‑Azeem1*, Azza H. Mohamed1 dan Mohamed R. Habib2