​Berdasarkan Rangkaian Farmakologi Dan Eksperimen Haiwan Untuk Meneroka Kesan Phenylethanoid Glycoside Of Cistanche Tubulosa Pada Kesan Nefropati Diabetik

Abstrak: Objektif Meneroka kesan daripadaCistanchephenylethanol glycosides(CPhGs) dihidupkanpenyakit buah pinggang kencing manis(DKD) berdasarkan farmakologi rangkaian dan eksperimen haiwan. Kaedah Kaedah UHPLC-QE-MS digunakan untuk menganalisiskomponen kimia CPhGs. Pangkalan data TCMSP dan Swiss Target Prediction telah digunakan untuk menyaring komponen teras. Pangkalan data OMIM dan GeneCards digunakan untuk mendapatkan sasaran berkaitan DKD. Selepas mendapat sasaran biasa, laman web STRING telah digunakan untuk membina rangkaian interaksi protein. Pangkalan data DAVID digunakan untuk GO, analisis laluan KEGG dan perisian Cytoscape digunakan untuk membina rangkaian "laluan sasaran komponen teras CPhGs". Sepuluh ekor tikus dipilih secara rawak sebagai kumpulan biasa, dan tikus yang tinggal diberi makan dengan makanan bergula tinggi dan tinggi lemak dan diberi suntikan STZ intraperitoneal tunggal untuk mewujudkan model DKD. Mereka dibahagikan kepada kumpulan model, kumpulan dapagliflozin (1 mg/kg) dan CPhG tinggi dan Dos Sederhana dan rendah (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) kumpulan, 10 haiwan dalam setiap kumpulan, campur tangan ubat selama 6 minggu, keadaan umum diperhatikan, berat badan ditentukan dan glukosa darah diuji setiap minggu; Air kencing 24 jam dikumpul selepas dos terakhir. Kesan 24-jam jumlah protein air kencing (24-UTP); kumpulkan darah dari aorta abdomen dan korbankannya, serum asingkan, dan mengesan nitrogen urea (BUN), asid urik (UA), jumlah kolesterol (TC), trigliserida (TG), dan tekanan darah tinggi. Tahap lipoprotein berketumpatan tinggi (HDL) dan lipoprotein berketumpatan rendah (LDL), pewarnaan HE dan pewarnaan Masson digunakan untuk melihat perubahan patologi dalam tisu buah pinggang, ELISA digunakan untuk mengesan IL serum-1 , IL{{17} }, dan tahap TNF-, dan Western blot digunakan untuk mengesan tisu buah pinggang. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, ekspresi protein SOCS3. Keputusan Sebanyak 699 komponen telah dikesan oleh teknologi UHPLC-QE-MS. Selepas saringan, 16 komponen teras CPhG dan 323 sasaran berkaitan diperolehi. CPhG dan DKD berkongsi 99 sasaran. Sasaran utama ialah STAT3, SRC, EGFR, dsb. Analisis laluan KEGG menyaring 151 laluan isyarat, menunjukkan bahawa laluan isyarat IL{33}}, laluan isyarat PI3K/Akt, laluan isyarat TNF, dsb. mungkin memainkan peranan penting dalam rawatan DKD oleh CPhGs. CPhG boleh meningkatkan berat badan tikus DKD (P＜0.01), mengurangkan penggunaan air (P＜0.01), mengawal metabolisme glukosa dan lipid, mengurangkan 24-paras UTP dan BUN (P＜0.01), dan memperbaiki tisu buah pinggang . Kerosakan patologi mengurangkan ekspresi protein p-JAK2/JAK2 dan p-STAT3/STAT3 dalam tisu buah pinggang (P＜0.01) dan meningkatkan ekspresi protein SOCS3 (P＜0.01). Kesimpulan CPhGs campur tangan dalam DKD melalui berbilang komponen, berbilang sasaran dan berbilang laluan, mungkin dengan menghalang JAK2/

Laluan isyarat STAT3.

Kata kunci: Cistanche phenylethanol glycoside; nefropati diabetik; UHPLC-QE-MS; farmakologi rangkaian; eksperimen haiwan; Laluan isyarat JAK2 / STAT3

BERAPA LAMA UNTUK CISTANCHE BERFUNGSI UNTUK PESAKIT BUAH PINGGANG?

Penyakit buah pinggang kencing manis (DKD), sebagai salah satu komplikasi mikrovaskular diabetes yang paling penting, bukan sahaja faktor utama yang membawa kepadapenyakit buah pinggang yang kroniktetapi juga punca utama penyakit buah pinggang peringkat akhir (ESRD) di seluruh dunia. Sebab [1-2]. Rawatan klinikal DKD terutamanya melibatkan kawalan gula darah, tekanan darah dan lipid darah, dan kedua melindungi fungsi buah pinggang, mengelakkan penggunaan ubat nefrotoksik dan memperbaiki gaya hidup [3-4]. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh patogenesis DKD yang kompleks dan kekurangan sasaran intervensi khusus, pilihan rawatan semasa mempunyai had dan tidak berkesan. Insiden DKD peringkat akhir masih meningkat. Oleh itu, adalah sangat penting untuk mencari ubat semulajadi yang berkesan.

Cistanche Deserticola Y. C. Ma atauCistanche C.Batang berdaging keringCistanche tubulosa (Schenk) Wightdengan daun bersisik [5] pertama kali direkodkan dalam "Shen Nong's Materia Medica" dan disenaraikan sebagai gred teratas. Mereka dikenali sebagai "ginseng padang pasir" [6]. Mereka manis, masin, dan hangat. , kembali ke buah pinggang dan meridian usus besar, dan mempunyai kesan buah pinggang yang berkhasiat, menambah pati dan darah, melembapkan usus, dan julap. Penyelidikan menunjukkan bahawa phenylethanoid glycosides (CPhGs) adalah salah satu bahan aktif utamanya dan bertanggungjawab untuk pembangunannya.

Asas material untuk memberikan kesan farmakologi; Ekstrak cistanche mempunyai anti-diabetes [7-8], anti-kanser hati [9], perlindungan buah pinggang [10-11], neuroprotektif [12-13] dan kesan farmakologi lain, tetapi pada masa ini, CPhGs tidak berkesan dalam merawat DKD. Kesan dan mekanismenya tidak jelas.

Kajian ini menggunakan kaedah rangkaian farmakologi dan dok molekul [14], mengambil CPhG sebagai objek penyelidikan, meramal dan menganalisis bahan aktif utamanya dan sasaran yang berpotensi untuk rawatan DKD, dan kemudian mewujudkan gabungan streptozocin (STZ) yang tinggi disebabkan. Model tikus DKD yang diberi suapan lipid digunakan sebagai subjek penyelidikan in vivo, untuk menyediakan rujukan untuk pengembangan klinikal dan aplikasi rawatan yang berkaitan dan penyelidikan lanjut mengenai mekanisme tindakan.

1 bahan

1.1 Haiwan

70-Tikus SD jantan berumur seminggu dengan tahap SPF, berat badan (240±20) g, telah dibeli daripada Pusat Eksperimen Haiwan Universiti Perubatan Xinjiang [No. Lesen Penggunaan Haiwan Eksperimen SYXK (baru) {{4} }], pada Haiwan-haiwan tersebut diternak secara adaptif selama 1 minggu pada suhu (22 ±2) darjah, kelembapan relatif 50% hingga 70%, dan kitaran cahaya dan gelap berselang seli selama 12 jam/12 jam. Percubaan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Pusat Haiwan Eksperimen Perubatan Universiti Perubatan Xinjiang (nombor etika IACUC-20220127-19).

1.2 Reagen dan ubat

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) telah disediakan oleh Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (nombor kelompok NB2248) telah dibeli dari AstraZeneca, UK. Makanan tinggi gula dan tinggi lemak (Cat. No. Boaigang-B1135DM) dan STZ (Batch No. 2021110307) telah dibeli daripada Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; mikroalbumin air kencing (No. Batch 20220611), nitrogen urea (No. Batch 20220626), asid urik (No. Kumpulan 20220613), Jumlah kolesterol (nombor kelompok 20220615), trigliserida (nombor kelompok 20220616), lipoprotein ketumpatan tinggi 2020616 ), dan lipoprotein berketumpatan rendah (nombor kelompok 20220615) telah dibeli daripada Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng; interleukin-6 (IL-6, nombor Lot JL20896), interleukin-1 (IL-1 , nombor lot JL20884) dan faktor nekrosis tumor- (TNF- , nombor lot 13202 ) telah dibeli daripada Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; Antibodi poliklonal arnab JAK2 (nombor lot 22v9316), antibodi poliklonal arnab p-JAK2 (nombor lot 78g9360), antibodi poliklonal arnab STAT3 (nombor lot 15x8824), antibodi poliklonal arnab p-STAT3 (nombor lot 74m3478 arnab), nombor 31d4841) semuanya dibeli daripada Jiangsu Qianke Biotechnology Research Centre Co., Ltd.; Antibodi poliklonal IgG kambing berlabel HRP (nombor kelompok 20000758) telah dibeli daripada Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -antibodi monoklonal arnab aktin (nombor kelompok AC230205001), penimbal lisis RIPA (nombor kelompok 20220416), kit penentuan kepekatan Protein BCA (nombor kelompok 20230401) telah dibeli daripada Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrumen

Kromatografi cecair berprestasi ultra tinggi, Q Exactive Focus spektrometer jisim resolusi tinggi, emparan Heraeus Fresco17, pembaca plat mikro automatik FC (Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24 pengisar (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Meter air tulen UV Mingche D24 (Syarikat Merck Millipore Jerman); ACQUITY UPLC BEH C18 lajur (1. 7 μm, 2. 1 mm×100 mm) (American Waters Company); meter glukosa darah Accu Chek Performa (Syarikat Roche Switzerland); Cryostat CM1850UV, mikroskop pendarfluor tegak DM300 (Syarikat Leica, Jerman); Meter pusaran GL-88B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); imbangan analitikal elektronik (Syarikat Bio-Rad, Amerika Syarikat).

2 kaedah

2. 1 analisis UHPLC-QE-MS

2.1.1 Penyediaan larutan ujian

Timbang 100 mg CPhGs, tambahkan 500 μL 80% metanol, pusaran selama 30 s, ultrasonik dalam tab mandi air ais selama 1 jam, biarkan berdiri pada -40 darjah selama 1 jam, sentrifuge pada 4 darjah , 12 000 r/min selama 15 minit, aspirasikan supernatan, 0. Tapis melalui membran mikroporous 22μm dan simpan dalam peti sejuk -80 darjah.

2.1.2 Keadaan kromatografi

ACQUITY UPLC BEH C18 lajur (1. 7 μm, 2. 1 mm × 100 mm); asetonitril fasa mudah alih (A) -1% asid formik (B), elusi kecerunan (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 hingga 12 min, 75% hingga 98% A; 12 hingga 14 min, 98% A; 14 hingga 14. 1 min, 98% hingga 15% A; Kadar aliran isipadu 0 . 5 mL/min; suhu lajur 35 darjah; isipadu suntikan 5 μL.

2.1.3 Keadaan spektrometri jisim

mod imbasan penuh ddMS2 imbasan penuh; kadar aliran isipadu gas sarung 45 arb; kadar aliran isipadu gas tambahan 15 arb; suhu kapilari 400 darjah ; tenaga perlanggaran dalam mod NCE 15% ~ 30% ~ 45% kitaran; voltan semburan ± 4. 0 kV.

2.2 Penyelidikan Farmakologi Rangkaian

2. 2. 1 CPhGs

Penyaringan sasaran komponen: Isih komponen kimia yang dianalisis oleh UHPLC-QE-MS mengikut kandungan relatif, dan padam komponen yang struktur kimianya masih belum ditentukan. Masukkan nombor siri InChIKey bagi ramuan yang disaring ke dalam pangkalan data TCMSP untuk mendapatkan parameter farmakokinetik setiap ramuan. Berdasarkan syarat bioavailabiliti oral (OB) > 30% dan keserupaan dadah (DL) > 0.18, calon yang memenuhi keperluan akan disaring. Masukkan nombor SMILES setiap komponen dalam pangkalan data Ramalan Sasaran Swiss untuk meramalkan sasaran dan dapatkan sasaran komponen kimia CPhGs.

2. 2. 2 DKD

Pemeriksaan sasaran penyakit Gunakan "nefropati diabetik" sebagai istilah carian untuk mencari sasaran penyakit dalam pangkalan data OMIM, GeneCards dan NCBI.

2. 2. 3 Pembinaan rangkaian komponen-sasaran-penyakit

Sasaran silang komponen dan penyakit CPhGs diperoleh melalui pemetaan perisian R, dan perisian Cytoscape 3.7.2 digunakan untuk membina sistem rangkaian sasaran komponen, di mana pemalam analisis mengesan sasaran teras.

2. 2. 4 Pembinaan rangkaian interaksi protein-protein (PPI)

Import protein sasaran persimpangan komponen dan penyakit ke dalam pangkalan data STRING, bina rangkaian interaksi protein-protein (PPI), padam protein tanpa nod yang disambungkan dalam rangkaian dan tetapkan tahap keyakinan skor interaksi protein terendah kepada {{1} }.700. Bina rangkaian PPI, muat turun keputusan format TSVnya, importnya ke dalam perisian Cytoscape 3.7.2 dan gunakan pemalam analisis untuk sasaran teras skrin selanjutnya.

2. 2. 5 GO, analisis KEGG

Gunakan bahagian Anotasi Fungsian dalam pangkalan data DAVID untuk melaksanakan analisis pengayaan pada sasaran persimpangan penyakit komponen. Mula-mula tetapkan parameter analisis, masukkan sasaran persimpangan dalam kotak Senarai Gen, pilih simbol-gen rasmi sebagai pengecam sasaran, pilih Senarai Gen sebagai jenis data (Jenis Senarai), dan pilih "Homo Sapiens (Spesies)" sebagai sumber sasaran (Spesies). Race)", mulakan analisis selepas mengesahkan parameter analisis, dapatkan keputusan analisis GO dan KEGG, dan kemudian gunakan platform lukisan dalam talian ImageGP untuk melukis gambar rajah gelembung keputusan analisis KEGG dan GO. Perisian Cytoscape 3.7.2 membina komponen -gambar rangkaian laluan sasaran.

2. 2. 6 Pelabuhan molekul

Mula-mula muat turun gambar rajah struktur 3D bahan aktif dalam format SDF daripada pangkalan data PubChem, kemudian muat turun gambar rajah struktur 3D sasaran persimpangan dalam format PDB daripada Pangkalan Data Protein Global (PDB) AS, dan akhirnya muat naik ke CB-Dock laman web untuk dok molekul. Skrin konformasi dok yang dominan dan gambarkan dengan Pymol.

2.3 Eksperimen haiwan

2.3.1 Pemodelan, pengelompokan, dan pentadbiran dadah

10 ekor tikus telah dipilih secara rawak sebagai kumpulan biasa dan diberi makanan biasa, dan tikus yang selebihnya diberi makanan tinggi gula dan tinggi lemak. Selepas 6 minggu, mereka diberi suntikan intraperitoneal sekali sebanyak 30 mg/kg STZ (0. 1 mmol/L STZ dibubarkan dalam pH 4. 5 penimbal natrium sitrat), dan 72 jam kemudian, darah diambil dari urat ekor. untuk mengesan glukosa darah puasa (FBG). Jika FBG Lebih besar daripada atau sama dengan 16. 7mmol/L, model diabetes telah berjaya ditubuhkan [15]; teruskan Mereka diberi makanan tinggi gula dan tinggi lemak selama 2 minggu. Pemodelan DKD ditentukan untuk berjaya berdasarkan kepositifan glukosa air kencing dan 24-jam jumlah protein air kencing (24-UTP) Lebih daripada atau sama dengan 20 mg. Antaranya, 3 mati semasa proses pemodelan dan 7 tidak berjaya. , seramai 50 orang berjaya. Tikus yang berjaya dimodelkan dibahagikan secara rawak kepada kumpulan model, kumpulan dapagliflozin (1 mg/kg), dan kumpulan CPhGs tinggi, sederhana dan rendah (500, 250, 125 mg/kg). Setiap kumpulan pentadbiran ditadbir secara intragastrik. Tikus dalam kumpulan normal dan kumpulan model diberi ubat yang sepadan, dan tikus dalam kumpulan normal dan kumpulan model diberi jumlah garam biasa yang sama secara gavage, sekali sehari selama 6 minggu. Dalam tempoh pemberian, tikus dalam setiap kumpulan kecuali kumpulan normal terus diberi makanan tinggi lemak.

2.3.2 Pengesanan Penunjuk Biokimia

Selepas 6 minggu campur tangan CPhG, 24-jam air kencing dikumpulkan daripada tikus dan 24-jam jumlah protein air kencing (24-UTP) diukur; darah dikumpulkan dari urat ekor puasa untuk mengesan tahap FBG; darah dikumpulkan dari aorta abdomen, 4 darjah, 1500 r/min. Sentrifuge selama 10 minit untuk memisahkan serum dan mengesan nitrogen urea serum.

BUN), asid urik (UA), jumlah kolesterol (TC), trigliserida (TG), lipoprotein berketumpatan tinggi (HDL), lipoprotein berketumpatan rendah (lipoprotein berketumpatan rendah LDL).

2.3.3 Pemerhatian morfologi patologi tisu buah pinggang

Tikus telah dibius dengan natrium pentobarbital dan dikorbankan. Buah pinggang telah dikupas, ditimbang, dibetulkan dengan 4% paraformaldehyde, dehidrasi, lutsinar, dicelup dalam lilin, tertanam, dan dipotong untuk pewarnaan hematoxylin-eosin (HE).

Selepas pewarnaan Masson, morfologi tisu diperhatikan di bawah mikroskop dan perisian Image-Pro Plus 6.0 digunakan untuk menganalisis ketumpatan optik bersepadu dan mengukur luas gentian kolagen relatif.

2. 3. 4 ELISA

Kaedah ini digunakan untuk mengesan tahap faktor keradangan serum dalam tikus. Tahap IL-6, IL-1 , dan TNF- telah dikesan mengikut arahan kit.

2. 3. 5 Kaedah Western blot untuk mengesan ekspresi protein yang berkaitan

Tisu buah pinggang tikus diambil, RIPA lysate ditambah untuk mengekstrak jumlah protein, dan kepekatan ditentukan oleh kaedah BCA.

Selepas elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide, pindahkan ke membran PVDF, dan selepas menyekat, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1: 2000), Antibodi SOCS3 (1:2000), -actin (1:2000), inkubasi pada 4 darjah semalaman, tambah antibodi sekunder IgG berlabel HRP (1:5000), dan inkubasi pada suhu bilik selama 1 jam, dibangunkan dengan kit electroluminescence, terdedah oleh pengimej gel protein, menggunakan perisian Image J

Analisis kuantitatif kepingan. Menggunakan -actin sebagai rujukan dalaman, nisbah nilai kelabu jalur sasaran dan jalur rujukan dalaman ialah ungkapan protein relatif.

2.4 Analisis statistik

Data telah diproses oleh perisian SPSS 25.0 dan data dinyatakan sebagai (x±s). Analisis varians sehala digunakan untuk perbandingan antara kumpulan. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.