Autofluorescence Sebagai Biomarker Noninvasive Senescence Dan Produk Akhir Glycation Termaju dalam Caenorhabditis Elegans

Untuk menilai kegunaan autofluoresensi sebagai biomarker noninvasif penuaan dalam Caenorhabditis elegans, kami mengukur autofluoresensi nematod individu menggunakan spektrofluorimetri. Pendarfluor setiap cacing meningkat dengan usia. Haiwan dengan intensiti pendarfluor yang lebih rendah menunjukkan jangka hayat yang lebih lama. Apabila protein yang diekstrak daripada cacing diinkubasi dengan gula, keamatan pendarfluor dan kepekatan produk akhir glikasi lanjutan (AGEs) meningkat dari semasa ke semasa. Ribose meningkatkan perubahan ini bukan sahaja secara in vitro tetapi juga dalam vivo. Penghalang glikasi rifampisin menghalang peningkatan pendarfluor ini. Spektrometri jisim resolusi tinggi mendedahkan bahawa vitellogenin terkumpul dalam cacing lama, dan vitellogenin terglikasi memancarkan pendarfluor enam kali ganda lebih tinggi daripada vitellogenin naif.Peningkatan dalam pendarfluor dengan penuaan berasal daripada bahan terglikasidan oleh itu boleh berfungsi sebagai penanda bio noninvasif yang berguna bagi AGEs.Cistancheboleh berfungsi sebagai model baharu untuk mencari faktor anti-AGEdan untuk mengkaji hubungan antara AGE dan penuaan.

Cistancdia Herba Untuk Faktor Anti-UMUR

PENGENALAN

Purata jangka hayat manusia telah diperluaskan secara dramatik di negara maju selama setengah abad yang lalu. Walau bagaimanapun,kerosakan progresif dengan penuaan menyebabkan kesan buruk pada fungsi fisiologi, dikenali sebagaipenuaan, danpenyakit yang berkaitan dengan penuaanjuga semakin meningkatperkadaran dengan umur panjang. Lanjutan daripada"jangka kesihatan" kini perlu dan bukannya memanjangkan jangka hayat sahaja. Intervensi yang melambatkan penuaan dan memanjangkan tempoh kesihatan adalah diingini. Brenner et al. diperkenalkanCaenorhabditis elegans, yang merupakan nematod tanah kecil yang hidup bebas yang memakan bakteria, untuk digunakan dalamkajian genetik molekul tentang pembezaan dan perkembangan.

Selepas itu, cacing telah digunakan secara meluas sebagai sistem eksperimen untuk kajian biologi, termasuk penyelidikan tentang penuaan, kerana haiwan ini'kesederhanaan, ketelusan, kemudahan penanaman, jangka hayat yang singkat dan kesesuaian untuk analisis genetik2. Dalam cacing, penuaan boleh diperiksa dengan pengecilan keupayaan lokomotif, rintangan tekanan, keupayaan kognitif, dan pengepaman pharyngeal, dan dengan pengumpulan apa yang dipanggil pigmen umur lipofuscin.3–5 .

Pelbagai bahan kimia, termasuk antioksidan dan beberapa ubat, adalah calon untuk mencegah penuaan6,7. Tambahan pula, kerana kami melaporkan bahawa jangka hayat dan jangka hayat nematod boleh dilanjutkan dengan memakan bakteria probiotik.8,9, kesan jangka hayat bakteria berfaedah juga telah ditunjukkan oleh beberapa makmal10–12. Kesan jangka hayat telah diperiksa oleh lengkung kelangsungan hidup, tetapi kajian sedemikian dalam cacing memerlukan lebih daripada 3 minggu, walaupun jangka hayat yang agak pendek.C. elegans. Untuk menilai kesan intervensi terhadap penuaan, penunjuk penuaan yang mudah dan tidak invasif dikehendaki untuk mengesan pengaruh dalam cacing individu dan (akhirnya) pada manusia sebagai sasaran akhir.

Lipofuscin, yang dipanggil pigmen umur, telah digunakan secara meluas sebagai penunjuk penuaan. Walau bagaimanapun, hubungan tepat antara autofluoresensi, penuaan, dan jangka hayat dalam cacing masih tidak jelas. Gerstbrein et al. melaporkan bahawa pigmen umur adalah pelapor yang sah untuk jangka hayat nematod13, manakala Coburn et al. melaporkan bahawa pendarfluor biru (panjang gelombang pengujaan / pelepasan berpusat pada 340/430 nm) berfungsi sebagai penanda kematian selama beberapa jam sebelum dan selepas kematian dalamC. elegans14. Telah dicadangkan bahawa peningkatan autofluoresensi biru dari masa ke masa diperhatikan dalam populasi penuaanC. elegansmungkin tidak mencerminkan kadar penuaan atau keadaan kesihatan populasi itu sendiri, tetapi sebaliknya pecahan individu mati atau hampir mati dalam sampel15.

Produk akhir glikasi lanjutan (AGEs) telah menarik perhatian saintifik16 kerana ia terbentuk dalam jumlah yang tinggi dalam kes diabetes, tetapi juga semasa penuaan fisiologi, dan membawa kepada tekanan oksidatif. AGE ialah sebatian kompleks yang dibentuk oleh tindak balas bukan enzimatik antara gula penurun dan kumpulan amino dalam protein, lipid, atau asid nukleik; Bes Schiff dan produk Amadori kemudiannya terbentuk melalui tindak balas Maillard, menghasilkan AGE. Kandungan AGE adalah tinggi pada pesakit diabetes, rheumatoid arthritis, Alzheimer'penyakit s, dan penyakit lain17–19. Pada pesakit diabetes, pengumpulan AGE berkorelasi baik dengan keterukan penyakit mikrovaskular dan meningkat dengan usia. Walau bagaimanapun, sama ada AGE mewakili punca patogenesis atau hanya produk sekunder masih perlu dijelaskan. AGEs juga dianggap sebagai kemungkinan penyebab penuaan20,21, seperti yang dicadangkan daripada penemuan dalam aC. elegansmodel ketoksikan gula22,23.

Kaedah ujian imunosorben berkaitan enzim sistematik (ELISA) telah dibangunkan dengan menggunakan antibodi dengan kekhususan untuk beberapa sebatian AGE24–26. Walau bagaimanapun, kaedah bukan invasif untuk membenarkan anggaran kasar tahap AGE juga diperlukan. Oleh kerana beberapa AGEs dilaporkanfluorescent dan yang berkaitanflkeamatan uorescence menunjukkan tandafifihubung kait dengan tahap yang diukur oleh ELISA27, kami meneliti sama ada inifluorescence boleh digunakan sebagai penanda alternatif untuk mengesan status AGEs dan penuaan dalamC. elegansmodel.

Untuk mengesahkan sama ada yang diperhatikanpendarfluorhanya mencerminkan kematianpendarfluordilaporkan oleh Coburn et al., cacing telah diperiksa dengan mengesanfluorescence cacing individu manakalamenentukan masa kematian haiwan masing-masing. Tambahan pula,kesan perencat pembentukan AGE padapendarfluordan pengumpulan AGE juga disiasat untuk mengesahkan kegunaanC. eleganssebagai haiwan model untuk penyelidikan AGE.

KEPUTUSAN

Autofluoresensi protein yang diekstrak sebagai biomarker penuaan dan AGE dalam cacing

Spektrofotometri pendarfluor protein yang diekstrak menunjukkan bahawa pengujaan pada 325–365 nm menjadikan 17-cacing berumur seharifluoresce dengan pelepasan tertinggi dalam 400–Selang 430 nm (puncak 420 nm) (Gamb.1a). Birufluorescence secara perbandingan lebih rendah semasa dewasa muda (3-usia sehari hingga 5-hari) tetapi meningkat dari semasa ke semasa (dalam 7-haiwan berumur sehari) (Gamb.1b). Lipofuscin, pigmen umur yang dipanggil, mengeluarkan merahfluorescence (pengujaan pada 530–560 nm, pelepasan pada 585–645 nm)15; dalam kajian terdahulu kami, penanda ini dikesan dalam cacing lewat hayat (lebih daripada 13-hari)9. 

Sejak keretafluorescence yang ditemui dalam kajian ini muncul pada peringkat awal dan meningkat dari semasa ke semasa, auto birufluorescence dijangka menjadi biomarker yang lebih baik untuk mengesan penuaan. Oleh kerana beberapa sebatian AGE dikenali sebagai auto-pendarfluor27, kami mengkaji hubungan antara kandungan AGE dan birufluorescence oleh western blotting di mana antibodi kepada Nε- (carboxymethyl) lysine (CML), wakil AGE, telah digunakan. Penghapusan menunjukkan bahawa jalur yang luar biasa telah dikuatkan dari masa ke masa (Rajah 1).1c dan Rajah Tambahan 1). Sesungguhnya, kuantifikasi rantau menunjukkan peningkatan AGE (Rajah 1).1d), walaupun CML bukan autoflunjuran.

Untuk menentukan sama ada autofluorescence secara tidak langsung menunjukkan anpeningkatan dalam AGE yang dibentuk oleh tindak balas Maillard, proteinyang diekstrak daripada homogenat cacing diinkubasi secara aseptik sehingga 4 minggu dengan gula penurun seperti glukosa, ribosa, dan fruktosa. TheflUorescence protein meningkat dari semasa ke semasa dengan kehadiran gula, sementara tiada peningkatan yang ketara dalamfluorescence dalam tindak balas yang dilakukan tanpa gula (Gamb.2a). Protein cacing menjadiflunjuran melalui glikasi walaupun secara in vitro. Antara tindak balas yang dilakukan dengan setiap tiga gula, yang mempunyai ribosa menghasilkan yang paling tinggifluorescence, diikuti oleh dua gula lain. inifiIni boleh dijelaskan oleh laporan oleh Bunn dan Higgins di mana kereaktifan setiap monosakarida dengan kumpulan amino untuk membentuk hubungan asas Schiff adalah bergantung kepada sejauh mana ia wujud dalam struktur terbuka (karbonil) dan bukannya dalam cincin ( hemiacetal atau hemiketal), dan kadar kereaktifan meningkat dalam susunan ribosa (10.0), fruktosa (4.5), dan glukosa (0.6) (×10−3 mM−1 h−1 ), masing-masing28.

Rajah 1 Spektrofotometri pendarfluor dan AGEs sampel protein cacing. anPlot matriks pelepasan pengujaan (EEM) autofluoresensi daripada cacing terlisis pada 3-usia hari dan 17-usia hari. Thefltahap uorescence pada panjang gelombang pelepasan dalam plot EEM dipaparkan sebagai peta haba berwarna. Seratus cacing (jenis liar N2) setiap satu daripada 3-hari dan 17-hari telah dilisekan dalam 3 µL penimbal lisis dan 4 µL 15 peratus SDS. Protein dibebaskan oleh kitaran beku-cair, dan spektrum photoluminescent dikumpulkan denganflspektrofotometer uorescence (Hitachi FL-4500). Sifat pendarfluor nematod terlisis dianalisis menggunakan EEMflspektroskopi uorescence. Keterujaan pada 325–365 nm menjadikan 17-cacing berumur seharifluoresce dengan pelepasan tertinggi dalam 400–430 nm selang trajektori sepadan sebagai satu siriflintensiti uorescence, manakala 3-cacing muda berumur sehari tidakfluoresce. Analisis multivariate (pengujaan panjang gelombang tunggal dengan pelepasan berbilang panjang gelombang, dan pengimbasan segerakfluorometry) menghasilkan plot EEM yang terdiri daripada pengujaan imbasan tunggal.b Tahap autofluorescence (cth 340/em 360–600) oleh sampel protein cacing yang diekstrak daripada haiwan setiap kumpulan umur (3–berumur 13 hari). Cacing (jenis liar N2) dikumpulkan dalam tiub, dibasuhlimakali, dan dilisiskan dalam setiap tiub. Sampel kemudian dikisar menggunakan Pengisar Tanpa Kord Mini (Fnakoshi, Tokyo, Jepun) untuk membebaskan protein. Kandungan protein diukur secara kuantitatif seperti yang diterangkan dalam Kaedah. Aflspektrum uorescence telah ditentukan untuk setiap 30-µL sampel (mengandungi 1.5μg jumlah protein) menggunakan model pembaca plat mikro parut berbilang mod SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Jepun). Setiap pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali.c Analisis Western blotting AGE CML dalam sampel yang diekstrak daripada populasi cacing (jenis liar N2) yang berbeza umur. Gambar perwakilan tiga eksperimen yang boleh dibuat semula ditunjukkan. Blot diperolehi daripada bahagian berlainan gel yang sama (ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1) dan diproses secara selari.d Kuantifikasidaripada AGEs dalam tompok barat menggunakan densitometri. Jalur yang dikelilingi oleh bingkai segi empat tepat dalam Rajah.1c telah dikuantifikasi, dan data daripada tiga eksperimen yang boleh dihasilkan semula ditunjukkan sebagai min ± SE.

masing-masing.

Untuk menilai secara langsung sama ada peningkatan dalamflUorescence dengan kehadiran gula adalah disebabkan oleh pembentukan AGE, ELISA digunakan untuk mengesan wakil AGE compound CML. CML meningkat dalam tindak balas ini, dan tahap dalam sampel yang diinkubasi dengan ribosa adalah sehingga hampir tujuh kali ganda lebih tinggi daripada yang dalam kawalan yang diinkubasi tanpa gula selama 4 minggu (Rajah 1).2b). Berbanding dengan ribosa, jumlah CML yang dihasilkan dengan glukosa atau fruktosa adalah rendah, serupa dengan CML dalam kawalan; inimencariadalah selaras dengan laporan sebelumnya29.

Autofluoresensi sebagai biomarker penuaan dan AGE dalam vivo

Kami seterusnya menguji sama adafluorescence boleh dikesan bukan sahaja daripada protein yang diekstrak tetapi juga dalam cacing hidup. Apabila autofluoresensi cacing individu dibaca pada filem bungkus plastik yang diregangkan pada 384-plat perigi dengan pembaca plat mikro parut berbilang mod, keputusan spektrofotometri adalah serupa dengan protein yang diekstrak (Gamb.3a). Keamatan individu birufluorescence meningkat dari semasa ke semasa (Rajah.3b dan Rajah Tambahan 2), manakala tiada merahfluorescence dikesan dengan kaedah ini. Sejak birufluorescence (340/430 atau 350/460 nm) telah dilaporkan sebelum ini dikaitkan dengan kematian14,15, analisis dilakukan dengan mengecualikan data yang diperolehi dalam masa 2 hari sebelum haiwan's kematian. Walau bagaimanapun, birufluorescence cacing masih meningkat dari semasa ke semasa: peningkatan sebanyakflOleh itu, anda mesti bebas sebahagian daripada kematianflkecemerlangan. Untuk menguji sama ada autopendarfluor boleh menjadi biomarker penuaan, kami memeriksa berapa hari cacing boleh hidup selepas autofluoresensi diukur pada 13-cacing berumur sehari. Jangka hayat setiap cacing berkait songsang dengan keamatan autofluoresensi (Rajah 1).3c).

Theflkeamatan uorescence juga dinaikkan dalam cacing yang ditanam dengan ribosa (Rajah.4a); jangka hayat cacing ini adalah signififilebih pendek daripada cacing kawalan (Gamb.4b). Sebaliknya, cacing yang tumbuh pada medium yang mengandungi rifampicin, penghalang AGEs, mengeluarkan kurangfluorescence berbanding cacing kawalan yang ditanam tanpa rifampicin (Rajah 1).4c); kesan pro-panjang umur rifampicin telah dilaporkan sebelum ini30. Tambahan pula,daf-2, mutan pro-umur panjang yang mewakili, juga kurang pendarfluor secara automatik berbanding jenis liar (Rajah 1).4d), manakalaflintensiti uorescence jenis liar meningkat dengan penuaan.

Sebahagian daripadafluorescence dijangka diperoleh daripada sebatian yang dihasilkan bersama dengan kematian haiwan. Birufluorescence boleh menjadi penanda kematian yang Coburn et al. diperhatikan dalamC. elegansselama beberapa jam sebelum dan selepas kematian; cahaya biru akan datang daripada asid anthranilic yang terbentuk sejurus selepas cacing mati14. Khabarnya, kematianfluorescence dipancarkan oleh bentuk glikosilasi asid antranilik yang dihasilkan oleh laluan kynurenine14. kyu-1cacing mutan, yang kekurangan kynureninase, sewajarnya dijangka tidak memancarkan kematianflkecemerlangan. Walau bagaimanapun, walaupun dengan adanya mutasi ini, cacing tua masih kelihatan memancarkan lebih tinggipendarfluordaripada cacing yang lebih muda (Gamb.5a), dan cacing yang ditanam pada medium pertumbuhan nematod (NGM) ditambah dengan tanda ribosa yang dipamerkan.fifilebih tinggifluorescence daripada yang ditanam tanpa ribosa tambahan atau dengan sorbitol gula kawalan (Rajah 1).5b). Jangka hayat cacing yang dikekalkan dengan ribosa jelas lebih pendek daripada yang lain (Gamb.5c), mencadangkan kesan pro-penuaan AGEs dalam cacing.

Pengenalpastian bahan autofluorescentUntuk mengenal pasti bahan yangflJika anda mengalami penuaan haiwan, ujian LC MALDI telah dilakukan ke atas protein yang diekstrak. Enam protein yang paling banyak terdapat dalam setiap sampel disenaraikan dalam Jadual1; terutamanya, faktor vitellogenin dan pemanjangan telah diperkaya di kalangan yang teratas-45flprotein uorescing dalam cacing yang lebih tua. Tambahan pula, menggunakan MS resolusi tinggi dan persekitaran pengiraan Maskot, kami mencari protein yang lebih banyak dalam 15-cacing berumur sehari berbanding 3-cacing berumur sehari dan mengenal pasti 180 protein (Jadual Tambahan 1–3). Walaupun vitellogenin sekali lagi diperkaya (hadir pada tahap enam kali ganda lebih tinggi dalam cacing yang lebih tua berbanding dewasa muda), tahap faktor pemanjangan adalah serupa dalam kedua-dua kumpulan (Tambahan Rajah 3). Untuk mengesahkan sama ada protein ini boleh diglikasikan untuk membentuk AGE autofluorescent, faktor pemanjangan yang telah dimurnikan dan vitellogenin diinkubasi dengan ribosa secara in vitro. Pendarfluor yang dipancarkan daripada vitelogenin terglikasi mempamerkan spektrum yang serupa dengan yang diperolehi dengan ekstrak mentah yang diperolehi daripada 17-cacing berumur sehari (Rajah.6a). Walaupun riboflavin diketahuifluoresce, kami mendapati bahawa panjang gelombang pelepasan riboflavin adalah berbeza daripadaiaitu ekstrak cacing. Pendarfluor FL bagi vitellogenin terglikasi dan faktor pemanjangan adalah enam dan tiga kali ganda (masing-masing) daripada protein bukan glikasi selama 23 hari secara in vitro (Rajah 1).6b).

AGE yang dikesan oleh western blotting dengan antibodi anti-CML juga meningkat dari semasa ke semasa daripada 3-cacing berumur sehari kepada 13-cacing berumur sehari dalam vivo (Gamb.1c). Dengan penghapusan barat serentak dengan antibodi anti-vitellogenin, kami mendapati bahawa isyarat anti-CML adalah jalur bersaiz yang sama seperti vitellogenin (Rajah 1).6c). Walaupun vitellogenin YP170 dan YP115 terkumpul mengikut umur dalam tempoh ini, keamatan isyarat AGE telah dipertingkatkan lebih tinggi daripada peningkatan jumlah vitellogenin YP170 (Rajah 1).6d). Mikroskopi pendarfluor mendedahkan bahawa 13-cacing berumur sehari (Rajah.7d–f, lajur 2 dan 3) tanda yang dipancarkanfificahaya biru yang lebih terang daripada 3-dewasa muda berumur sehari (Rajah.7a–c, lajur 2 dan 3; Rajah.7g); gonad juga kelihatan lebih cerah (Gamb.7d–f, lajur 1 dan 2). CML ialah AGE yang mewakili, walaupun CML sendiri bukan kaki pendarfluor. Pentosidine, AGE lain, diketahui sebagai pendarfluor. Walau bagaimanapun, imunostaining dengan anti-CML mahupun anti-pentosidine anti-body tidak memberikan perbezaan yang ketara antara cacing tua dan muda (data tidak ditunjukkan). Walau bagaimanapun, anti-CML menunjukkan penyebaran meresap ke seluruh tisu, manakala anti-pentosidin hampir tidak menunjukkan ini.