Melemahkan Kesan Dieckol Pada Nefropati Hipertensi dalam Tikus Hipertensi Secara Spontan

Ang II menyebabkan vasoconstriction dan seterusnya mendorong hipertensi [30]. Dalam hipertensi, RAAS diaktifkan secara sistemik, dan regulasi RAAS disertai dalam beberapa organ, sepertibuah pinggang[31,32]. Hiperaktivasi RAAS intrarenal adalah mekanisme penting hipertensi dan kronikpenyakit buah pinggang[31,32]. Kedua-dua TGF 1 dan Ang II mendorong pengaktifan RAAS intrarenal dan meningkatkan ekspresi angiotensinogen, renin, ACE, dan AT1R, yang mendorong EMT [33]. Dalam kajian kami, BP sistolik SHR telah berkurangan dengan ketara oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK. Tahap serum Ang II SHR telah menurun dengan ketara oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK. Ekspresi AT1R dalam korteks dan medulla SHR telah berkurangan dengan ketara oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK.

Penyelarasan RAAS, seperti peningkatan ekspresi AT1R, mengaktifkan laluan isyarat turun TGF 1 [34]. Diaktifkan oleh RAAS, TGF 1 mendorong EMT melalui laluan SMAD-dependent dan SMAD-independent [33]. Sebagai laluan isyarat yang bergantung kepada SMAD, isyarat TGF 1 ditransduksi melalui TGF RII dan TGF RI dan membawa kepada pengaktifan SMAD2/3. [10]. SMAD4 mengikat kepada SMAD2/3 dan menggalakkan translokasi kompleks SMAD ke dalam nukleus [10]. SMAD yang ditranslokasi mengimbangi ekspresi gen EMT, seperti Siput, Twist, dan ZEB [34]. Dalam kajian kami, ungkapan AT1R jauh lebih tinggi dalam korteks dan medula SHR daripada tikus WKY, dan dikurangkan oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK. Ekspresi TGF dan SMAD2/3 dalam korteks dan medulla SHR telah dikurangkan oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG

EMT dicirikan oleh kehilangan penanda epitelium, seperti E-cadherin, dan pencapaian penanda mesenchymal, seperti -SMA, vimentin, dan fibronektin [35]. E-cadherin ialah kadherin yang paling nyata dalam sel epitelium dan, oleh itu, kerap digunakan sebagai penanda epitelium [36]. -SMA ialah penanda fenotip sel myofibroblast, dan ekspresinya adalah ciri peringkat lanjutan EMT [37]. -Miofibroblas yang mengekspresikan SMA, yang menjalani EMT, mendorong sintesis ECM yang berlebihan dan pembentukan semula ECM yang tidak normal danbuah pinggangfibrosis [37]. Nefropati hipertensi menyebabkan glomerulosklerosis dan fibrosis interstisial, yang mendorong penurunan dalamfungsi buah pinggangdan proteinuria yang ketara [6]. Dalam kajian kami, ekspresi vimentin dan -SMA dalam medulla dan korteks SHR telah meningkat dan dikurangkan oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK. Jumlah kawasan fibrosis dalam medula dan korteks SHR telah meningkat, dan ia dikurangkan dengan pentadbiran sama ada ECE atau DK. Indeks sklerosis glomerular SHRs telah meningkat, dan ia telah menurun dengan pentadbiran sama ada ECE atau DK.

Jumlah air kencing SHR secara beransur-ansur menurun berbanding dengan tikus WKY pada umur yang sama [38]. Adalah diketahui bahawa semakin besar perkumuhan natrium air kencing, semakin kurang perkumuhan kalium kencing. Selain itu, dalam kajian manusia, nisbah Na/K air kencing dikaitkan dengan peningkatan BP dan kemerosotan cepatfungsi buah pinggang[39]. Dalam kajian kami, jumlah air kencing SHR adalah lebih rendah daripada tikus WKY, walaupun jumlah pengambilan air tidak berbeza antara tikus SHR dan WKY. Nisbah Na / K air kencing SHR adalah berbeza dengan ketara di kalangan tikus WKY, SHR, dan kumpulan yang dirawat ECE atau DK. Nisbah Na / K air kencing digunakan sebagai penanda pengambilan natrium dan kalium dalam kajian manusia [39]. BP meningkat dengan peningkatan pengambilan natrium. Walau bagaimanapun, peningkatan pengambilan kalium mengurangkan BP dengan meningkatkan perkumuhan natrium ke dalam air kencing [40]. Oleh itu, nisbah Na / K air kencing dikaitkan dengan BP pada manusia [40]. Dalam kajian kami, semua haiwan tidak diberi makan dengan diet natrium tinggi, yang menjelaskan mengapa nisbah Na / K air kencing di kalangan kumpulan tidak menunjukkan sebarang perbezaan yang ketara. Hipertensi cenderung meningkatkan proteinuria [37]. Adalah diketahui bahawa nisbah albumin-ke-kreatinin air kencing dikaitkan dengan penurunan kadar penapisan glomerular [41]. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa perkembangan mikroalbuminuria dalam SHR disebabkan oleh kecederaan tiub yang utama, yang mendorong kehilangan air kencing protein berat molekul rendah [42,43]. Dalam kajian kami, nisbah albumin-ke-kreatinin air kencing SHR adalah lebih tinggi daripada tikus WKY, dan telah dikurangkan oleh pentadbiran sama ada ECE atau DK

Kajian terdahulu menunjukkan bahawa beberapa polifenol mempunyai kesan menghalang aktiviti ACE [14-17]. Walau bagaimanapun, kajian ini hanya melaporkan aktiviti perencatan ACE sebagai nilai IC50, iaitu 50 peratus kepekatan perencatan kawalan positif, dan mereka tidak menunjukkan kesan antihipertensi atau kesan perlindungan terhadap nefropati hipertensi dalam haiwan. Satu kajian menunjukkan bahawa ECE menurunkan BP dalam 2-buah pinggang1-clip Goldblatt tikus hipertensi [44]. Pyrogallol-phloroglucinol-6,6-bieckol menurunkan BP dalam model haiwan hipertensi akibat diet tinggi lemak dengan memodulasi disfungsi vaskular [45]. Walau bagaimanapun, kajian ini hanya menunjukkan penurunan BP dan tidak menilai sama ada ECE menunjukkan sebarang kesan melemahkan nefropati hipertensi. Kajian kami menunjukkan bahawa ECE dan DK menurunkan ungkapan AT1R/TGF/SMAD2/3 dalambuah pinggangdan menurunkan paras serum Ang II. Selain itu, ECE dan DK menurunkan EMT,buah pinggangfibrosis dan sklerosis glomerular. Nampaknya ECE dan DK mungkin membantu dalam melemahkan nefropati hipertensi

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Penyediaan ECE dan Pengasingan DK

ECE diperoleh daripada Aqua Green Technology Co., Ltd. (Jeju, Korea). E. cava telah dicuci bersih dengan air tulen dan dikeringkan di udara pada suhu bilik selama 48 jam. Ia dikisar, dan 50 peratus etanol ditambah, diikuti dengan pemanasan pada 85 ◦C selama 12 jam. ECE ditapis dan kemudian, apabila pekat, disterilkan dengan memanaskan pada suhu tinggi selama 40-60 minit dan kemudian dikeringkan dengan semburan. Pengarah, yang merupakan salah satu daripada phlorotanin wakil E. cava, kemudian diasingkan. Secara ringkas, kromatografi partition emparan dilakukan menggunakan sistem pelarut dua fasa yang mencampurkan air tulen, etil asetat, n-heksana, dan campuran metanol (nisbah 7:7:2:3). Fasa pegun organik telah dipenuhi dalam lajur dan fasa bergerak telah dipenuhi dalam lajur, mengikut tertib menurun kadar sesama (2 mL seminit) dan digunakan untuk pengasingan. Kami mengikuti kaedah Dr. Son et al. (2019) [45].

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG

4.2. Model Haiwan Hipertensi

SHR jantan (8 minggu) dan tikus WKY jantan (8 minggu) telah dibeli dari Orient Bio (Sungnam, Korea) dan disimpan pada suhu malar kira-kira 24 ◦C, kelembapan relatif 50–55 peratus , dan cahaya/ kitaran gelap 12 jam/12 jam. Sublimasi tikus dijalankan selama 1 minggu. Tikus dibahagikan secara rawak kepada enam kumpulan (lima tikus setiap kumpulan): (i) Kumpulan WKY, di mana tikus diberi secara lisan dengan air minuman selama 4 minggu; (ii) Kumpulan SHR, di mana tikus diberi secara lisan dengan air minuman selama 4 minggu; (iii–v) Kumpulan SHR, di mana tikus diberikan secara lisan dengan ECE sebanyak (iii) 50 mg/kg/hari, (iv) 100 mg/kg/hari, dan (v) 150 mg/kg/hari selama 4 minggu; (vi) Kumpulan SHR, di mana tikus diberikan secara lisan dengan 2.5 mg/kg/hari DK selama 4 minggu. Selepas 4 minggu, penggunaan air, jumlah air kencing dan analisis kimia air kencing telah disahkan dengan sangkar metabolik selama 24 jam. Selepas melengkapkan analisis metabolik, semua tikus telah dikorbankan mengikut prinsip etika Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Gachon (nombor kelulusan: LCDI-2019-0121).

4.3. Imunohistokimia

Tisu buah pinggangblok parafin dipotong pada 8 µm, diletakkan pada slaid bersalut gelatin, dan dikeringkan pada suhu 37 ◦C selama 3 hari. Thebuah pinggangslaid tisu telah dinyahparafin dan kemudian diinkubasi dengan 0.3 peratus hidrogen peroksida (Sigma-Aldrich, MO, Amerika Syarikat) selama 10 minit. Selepas itu, slaid dibilas tiga kali dengan garam penampan fosfat (PBS), dan diinkubasi dengan serum haiwan untuk menghalang pengikatan tidak spesifik antibodi. Selain itu, mereka diinkubasi dengan antibodi utama (anti-AT1R, anti-E-cadherin, anti- -SMA dan anti-vimentin) dan dibilas dengan PBS tiga kali. Slaid tisu kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder biotinilasi dari kit ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), diinkubasi selama 3 jam dengan larutan penyekat, dan dibilas dengan PBS tiga kali. Slaid tisu telah dibangunkan dengan 3,3-diaminobenzidine sebagai substrat selama 3 minit, dipasang dengan penyelesaian DPX berasaskan xilena (Sigma-Aldrich) dan digambarkan melalui mikroskop cahaya (Olympus Optical Co., Tokyo, Jepun) .

4.4. Pengekstrakan RNA dan Tindak balas Rantaian Polimerase Masa Nyata Kuantitatif (qRT-PCR)

RNA daripada tikusbuah pinggangtisu telah diasingkan menggunakan reagen RNAiso Plus (TAKARA, Jepun) mengikut arahan pengilang. Thebuah pinggangtisu mula-mula dibahagikan kepada dua bahagian, iaitu bahagian korteks dan bahagian medula. Tisu buah pinggang dipotong halus dan dihancurkan menjadi serbuk, dan serbuk digantung semula dengan 1 mL reagen RNAiso Plus, dicampur dengan 0.1 mL kloroform glade tulen (Amresco, Solon, OH, USA), dan kemudian disentrifugasi pada 13,000× g selama 20 min pada 4 ◦C. Selepas sentrifugasi, supernatan dicampur dengan 0.25 mL alkohol isopropil glade tulen, dan pelet RNA yang diekstrak dibasuh dengan alkohol 70 peratus dan disentrifugasi pada 7500 × g selama 5 minit pada suhu 4 ◦C. Pelet kering telah dibubarkan dalam 10-30 µl air tulen yang dirawat diethylpyrocarbonate, dan RNA dikira dan diperiksa menggunakan NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). DNA pelengkap (cDNA) disediakan daripada RNA menggunakan kit sintesis cDNA (PrimeScript™, TAKARA). Tindak balas rantai polimerase masa nyata kuantitatif (qRT-PCR) menentukan tahap RNA daripadabuah pinggangtisu. Primer hadapan dan belakang dicampur dengan air suling, dan kemudian campuran 10 µl diletakkan dalam 384-plat qRT-PCR perigi. cDNA dan SYBR hijau (TAKARA) kemudiannya ditambah dan kemudian disahkan menggunakan mesin qRT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Gen yang diminati disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1. Kami mengikuti kaedah Dr. Son et al. 2019 [45].

4.5. Ujian Imunosorben Berkaitan Enzim (ELISA)

Untuk mengesahkan tahap serum Ang II, aliquot darah yang ditarik balik (1.5 hingga 1.7 mL) ditambah dalam tiub pemisah serum (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) dan kemudian disentrifugasi pada 2000 × g selama 20 minit pada suhu bilik . Selepas itu, serum yang diasingkan itu dipindahkan ke dalam tiub baru dan disimpan di dalam peti sejuk beku. Kit Ang II ELISA (MyBioSource, San Diego, CA, USA) digunakan untuk menganalisis kehadiran serum mengikut arahan pengeluar. Ang II diukur dalam masa 1 minggu selepas pengumpulan darah daripada haiwan.

4.6. Analisis Histologi

4.6.1. Noda Trichrome (MT) Masson

Pewarnaan trichrome (MT) Masson mengesahkan fibrosisbuah pinggang.Blok yang dibenamkan parafinbuah pinggangtisu dibelah pada ketebalan 8 µm, diletakkan pada slaid salutan, dan dikeringkan pada suhu 37 ◦C selama 3 hari. Slaid tisu telah dinyahparafin dengan xilena dan alkohol dan dibetulkan semula dengan larutan Bouin selama 24 jam dan dibilas dengan air paip yang mengalir selama 3 minit. Slaid itu direndam dengan larutan hematoksilin besi Weigert selama 10 minit dan larutan fuchsin asid merah Biebrich selama 15 minit dan kemudian dibezakan dengan larutan asid fosfomolibdik-fosfotungstik selama 10 minit. Akhirnya, slaid dipindahkan ke larutan biru anilin selama 3 minit dan kemudian dibasuh dengan air. Slaid berwarna telah dipasang dengan penyelesaian DPX berasaskan xilena (Sigma-Aldrich) dan divisualisasikan melalui mikroskop cahaya (Olympus). Gentian kolagen kelihatan berwarna biru di kawasan fibrosis, manakalabuah pinggangepitelium kelihatan berwarna merah. Kawasan fibrosis bernoda MT diukur menggunakan perisian ImageJ. Imej asal buah pinggang bernoda MT telah ditukarkan kepada imej RGB, dan kemudian imej ini dinyahkembang menggunakan perisian ImageJ menggunakan pemalam penyahkonvolusi warna.

4.6.2. Pewarnaan Asid-Schiff Berkala (PAS).

Noda asid-Schiff (PAS) berkala mengesahkan kerosakan glomerularbuah pinggang. Blok yang dibenamkan parafinbuah pinggangtisu dibelah pada ketebalan 8 µm, diletakkan pada slaid salutan, dan dikeringkan pada suhu 37 ◦C selama 3 hari. Slaid tisu telah dinyahparafin dengan xilena dan alkohol, terhidrat dengan air, teroksida dengan 0.5 peratus larutan asid berkala selama 5 minit dan dibasuh dengan air. Slaid itu direndam dengan reagen Schiff selama 15 minit dan kemudian dibasuh dengan air paip suam selama 5 minit. Akhirnya, slaid dipindahkan ke larutan hematoxylin Mayer selama 1 minit dan kemudian dibasuh dengan air. Slaid berwarna telah dipasang dengan penyelesaian DPX berasaskan xilena (Sigma-Aldrich) dan divisualisasikan melalui mikroskop cahaya (Olympus).

Glomeruli dipilih secara rawak, dan kerosakan glomerular dinilai menggunakan kaedah pemarkahan separa kuantitatif (Gred 0–4) menggunakan pewarnaan PASbuah pingganggelongsor tisu.

(1) Gred 0: glomeruli normal; (2) Gred 1: sklerosis minimum (kawasan sklerotik sehingga 25 peratus ); (3) Gred 2: sklerosis sederhana (kawasan sklerotik 25 peratus hingga 50 peratus ); (4) Gred 3: sklerosis sederhana-teruk (kawasan sklerotik 50 peratus hingga 75 peratus ); (5) Gred 4: sklerosis teruk (kawasan sklerotik 75 peratus hingga 100 peratus ); Indeks glomerulosklerotik (GSI) dikira menggunakan persamaan berikut: (4 × n4) tambah (3 × n3) tambah (2 × n2) tambah (1 × n1) / n4 tambah n3 tambah n2 tambah n1 tambah n0, di mana n ( x) ialah bilanganbuah pinggangsklerosis glomerular dalam setiap gred [46]. Analisis ini dijalankan dalam kumpulan rawatan oleh pemerhati bertopeng.

4.7. Tekanan Darah Sistolik, Tekanan Darah Diastolik dan Pengukuran Tekanan Darah Arteri Min

BP sistolik, BP diastolik, dan BP arteri min diukur menggunakan sistem tail-cuff CODA bukan invasif (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, Amerika Syarikat). Sublimasi tikus dijalankan selama 20 minit selama 5 hari, dan BP diukur pada hari terakhir.

4.8. Pemodelan In Vitro Menggunakan Sel TCMK-1.

Sel TCMK-1, barisan sel tubul proksimal tetikus, telah dibeli daripada American Type Culture Collection (Washington, DC, Amerika Syarikat). Medium Dulbecco's Modified Eagle's glukosa tinggi (Gibco; Grand Island, NY, USA), 10 peratus serum lembu janin (FBS) dan 1 peratus penicillin-streptomycin digunakan sebagai medium kultur. Untuk mengesahkan kesan perencatan ECE dan DK dalam sel TCMK-1 yang dirawat angiotensin II, kami merawat ECE (5, 25, 50 µg/mL) dan DK (1.8 µg/mL) dengan 100 nmol/L angiotensin II (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 12 jam. Telmisartan (1 µmol/L, Sigma-Aldrich) digunakan untuk antagonis reseptor AT1 dan prarawatan sebelum angiotensin II selama 3 jam [47].

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG

4.9. Penyediaan Protein dan Western Blotting

Untuk mengasingkan protein daripada sel TCMK-1 yang dirawat angiotensin II, sel tersebut dikikis menggunakan penimbal lisis RIPA dengan perencat fosfatase dan proteinase (EzRIPA; ATTO; Tokyo, Jepun) dan diinkubasi pada ais selama 20 min. Selepas mengempar pada 13,000 × g selama 20 minit, pada suhu 4 ◦C, supernatan bersih dipindahkan ke tiub baru dan kepekatan supernatan dianalisis dengan kit ujian asid bicinchoninic (kit BCA; Thermo Fisher Scientifific, Inc.; Waltham, MA, Amerika Syarikat). Untuk mengesahkan ekspresi protein daripada sel TCMK-1, blotting telah dijalankan. Jumlah protein lisat yang sama (30 µg/lorong) dipisahkan oleh 10 peratus gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida menggunakan elektroforesis. Kemudian, protein berjalan dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida, yang diinkubasi dengan antibodi primer yang dicairkan (Anti{11}}aktin, AGTR1, TGF- , SMAD2/3 dan pSMAD2/3) pada suhu 4 ◦C. Membran yang diinkubasi dengan antibodi telah dibasuh dengan teliti menggunakan garam Tris-buffered dengan 0.1 peratus Tween 20 dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 2 jam pada suhu bilik. Semua membran telah dibangunkan oleh chemiluminescence yang dipertingkatkan (LAS-4000s; GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Maklumat antibodi yang digunakan dalam kajian ini boleh didapati dalam Jadual S2.

4.10. Analisis statistik

Keputusan dibentangkan sebagai min ± SD, dan nilai-p bagi<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">

5. Kesimpulan

Sebagai kesimpulan, AT1R dikawal selia dalam SHR, dan laluan isyarat meningkatkan TGF dan SMAD2 atau 3, yang mendorong EMT. Sama ada ECE atau DK menurunkan kawalan laluan isyarat dan menurunkan EMT. Oleh itu, ECE atau DK mengurangkan penanda sel mesenchymal seperti ekspresi vimentin dan -SMA, tisu fibrotikbuah pinggang, dan nisbah albumin/kreatinin air kencing dan melemahkan EMT. Tambahan pula,buah pinggangfibrosis membawa kepada pemulihanfungsi buah pinggang(Rajah 7).