Asid Aristolochic Menginduksi Fibrosis Dan Penuaan Buah Pinggang pada Tikus
Mar 23, 2022
Abstrak:Buah pinggang adalah salah satu organ yang paling mudah terdedah kepada gangguan berkaitan usia. Secara amnya, penuaan buah pinggang disertai dengan fifibrosis buah pinggang, yang merupakan laluan biasa terakhir penyakit kronik.penyakit buah pinggang. Asid Aristolochic (AA), agen nefrotoksik, menyebabkan nefropati AA (AAN), yang dicirikan oleh fifibrosis buah pinggang yang progresif dan penurunan fungsi. Walaupun fifibrosis buah pinggang dikaitkan dengan penuaan buah pinggang, sama ada AA mendorong penuaan buah pinggang masih tidak jelas. Matlamat kajian ini adalah untuk menyiasat potensi penggunaan AAN sebagai model penuaan buah pinggang. Di sini, kami mengkaji faktor berkaitan penuaan dalam model AAN dengan mentadbir AA secara kronik kepada C57BL/6 tikus. Berbanding dengan kawalan, kumpulan AA menunjukkan penuaanbuah pinggangfenotip, seperti atrofi buah pinggang, penurunan fungsi buah pinggang, dan fifibrosis tubulointerstitial. Selain itu, AA menggalakkan penuaan selular khususnya dalambuah pinggangdan peningkatan ekspresi mRNA p16 buah pinggang dan aktiviti -galactosidase yang berkaitan dengan penuaan. Tambahan pula, tikus yang dirawat AA mempamerkan keabnormalan mitokondria tiub proksimal, serta pengumpulan spesies oksigen reaktif. Klotho, gen antipenuaan, juga telah menurun dengan ketara dalambuah pinggangtikus yang dirawat AA. Secara kolektif, keputusan kajian ini menunjukkan bahawa AA mengubah faktor yang berkaitan dengan penuaan, dan fifibrosis buah pinggang berkait rapat dengan penuaan buah pinggang.
Kata kunci:penyakit buah pinggang yang kronik; fibrosis buah pinggang; asid aristolochic; penuaan; penuaan selular
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
pengenalanDengan jangka hayat manusia yang semakin meningkat, lebih ramai individu mengalami kecacatan yang berkaitan dengan usia.buah pinggangbiasanya dipengaruhi oleh kerosakan tisu yang berkaitan dengan usia, dan kejadian kronikpenyakit buah pinggangmeningkat dengan usia [1]. Penuaan buah pinggang mempercepatkan penuaan keseluruhan, yang mengakibatkan jangka hayat yang lebih pendek. Oleh itu, penyelidikan mengenai penuaan buah pinggang adalah perlu, walaupun model haiwan yang sesuai belum dibangunkan sepenuhnya. Penuaan buah pinggang disertai oleh pelbagai perubahan patologi, termasuk atrofi buah pinggang, glomerulosklerosis, dan fifibrosis tubulointerstitial [2]. Fifibrosis tubulointerstitial renal adalah laluan biasa terakhir dalam kebanyakan bentuk penyakit buah pinggang progresif, yang menunjukkan bahawa fifibrosis buah pinggang berkait rapat dengan orang tua.buah pinggang. Dalam penyelidikan penuaan, tikus adalah alat yang boleh dipercayai kerana kedekatan genetiknya dengan manusia, keupayaan untuk memanipulasi genom mereka secara genetik, dan fakta bahawa mereka membentangkan fenotip berkaitan penuaan yang serupa kepada manusia semasa jangka hayat mereka [3]. Pemerhatian membujur menggunakan tikus baka adalah ideal sebagai model penuaan, walaupun ia memakan masa untuk mengikuti tikus untuk jangka hayat penuh mereka. Selain itu, terdapat beberapa model penuaan tetikus yang diubah suai secara genetik. Tikus kekurangan Klotho ialah model penuaan pramatang yang digunakan dalam penyelidikan penuaan. Walau bagaimanapun, dalam model ini, fungsi buah pinggang tidak terjejas, dan beberapa organ selain buah pinggang terjejas [4]. Oleh itu, model tetikus ini mungkin tidak sesuai untuk penyelidikan mengenai penuaan buah pinggang.Pentadbiran asid Aristolochic (AA) menyebabkan jenis kecederaan buah pinggang tertentu yang dikenali sebagai nefropati AA (AAN), yang dicirikan oleh fibrosis interstisial yang meluas [5,6]. AA adalah toksik kepada epitelium tubular renal kerana ia menggalakkan pembentukan adduct DNA dalam tisu renal [7]. AA tidak mungkin menjejaskan organ selain daripada sistem kencing dan mungkin berguna untuk penilaianbuah pinggang-pengubahan khusus. Oleh itu, AA biasanya digunakan untuk mewujudkan model fifibrosis buah pinggang pada tikus [8,9]. Walau bagaimanapun, masih tidak jelas sama ada perubahan yang disebabkan oleh AA berkaitan dengan penuaan dalambuah pinggang. Dalam kajian ini, kami mengkaji fenotip berkaitan usia dan faktor molekul dalam AAN pada tikus
Keputusan 2.1. Pentadbiran AA menyebabkan penurunan berat badan yang ketara, atrofi buah pinggang dan penurunan dalam fungsi buah pinggangBerat badan asas (BW) dan tekanan darah sistolik (BP) adalah sama antara kumpulan kawalan kenderaan dan AA. BW dalam kumpulan kawalan kenderaan meningkat secara konsisten selama 8 minggu. Walau bagaimanapun, penambahan berat badan telah dihalang oleh pentadbiran AA, dan kumpulan AA telah menurunkan BW dengan ketara pada 4 dan 8 minggu selepas permulaan pentadbiran AA (Rajah 1A). Tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam BP sistolik atau kadar denyutan antara kumpulan kawalan kenderaan dan AA (Rajah 1B, C). Nisbah berat jantung / BW tidak menunjukkan perbezaan antara kumpulan pada 8 minggu selepas permulaan pentadbiran AA (Rajah 1D), manakalabuah pinggangnisbah berat / BW jauh lebih rendah dalam kumpulan AA pada 8 minggu selepas permulaan pentadbiran AA (Rajah 1E). Kami seterusnya mengkaji fungsi buah pinggang dalam kumpulan kawalan kenderaan dan AA. Kepekatan kreatinin plasma dan nitrogen urea (UN) adalah lebih tinggi dalam kumpulan AA berbanding kumpulan kawalan kenderaan pada 8 minggu selepas permulaan pentadbiran AA. Di samping itu, rawatan AA dengan ketara mengurangkan pelepasan kreatinin berbanding dengan kumpulan kawalan kenderaan pada 8 minggu selepas permulaan pentadbiran AA (Rajah 1F-H).
2.2. Pentadbiran AA Induced Overt Tubulointerstitial Fibrosis dan Peningkatan Ketara bagi Ekspresi Gen Berkaitan Fibrosis dalam Buah PinggangPemeriksaan histologi menggunakan pewarnaan asid-Schiff (PAS) berkala mendedahkan bahawa kawasan glomerular berkurangan dengan ketara dalam kumpulan AA berbanding dengan kumpulan kawalan kenderaan (Rajah 2A). Fifibrosis tubulointerstitial yang meluas, dinilai menggunakan pewarnaan trichrome (MT) Masson, diperhatikan dalam kumpulan AA (Rajah 2B), serta dengan penyelarasan tahap mRNA gen berkaitan fifibrosis buah pinggang, kolagen I dan III, dan faktor pertumbuhan mengubah ( TGF)- (Rajah 2C–E).
2.3.Pentadbiran AA Mempercepatkan Penuaan Selular, Disfungsi Mitokondria dan Pengumpulan Spesies Oksi/gen Tindak balas (ROS) dalam Buah PinggangUntuk menilai penuaan selular, kami memeriksa ekspresi mRNA buah pinggang p53, p21, p16, dan glutaminase (GLS), Kumpulan AA menunjukkan tahap mRNA yang lebih tinggi daripada gen yang berkaitan dengan penuaan ini dalambuah pinggang(Rajah 3A-D). Tambahan pula, keamatan pewarnaan -galactosidase(SA- -}gal) yang berkaitan dengan penuaan dalambuah pinggangtelah meningkat dalam kumpulan AA dan hampir tidak hadir dalam kumpulan kawalan kenderaan (Rajah 3E). Dalam kumpulan AA, mikroskop elektron mendedahkan kehilangan krista mitokondria, pemecahan mitokondria, vakuolisasi sitoplasma, dan autolisosom dalam sel tubular proksimal, seiring dengan downregulation BCL2/adenovirus E1B 19-kDa berinteraksi protein 3(Bnip3), gen berkaitan mitokondria (Rajah 3FG). Ekspresi mRNA buah pinggang Nox2. komponen nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase, telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan AA berbanding dengan kumpulan kawalan kenderaan (Rajah 3H). Tambahan pula, analisis western blot mendedahkan bahawa tahap 4-hidroksi-2-nominal(4-HNE) buah pinggang telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan AA (Rajah 3I). Keputusan ini menunjukkan bahawa pentadbiran AA menyebabkan penuaan selular, disfungsi mitokondria, dan pengumpulan ROS dalambuah pinggang.
2.4. AA Mengurangkan Ekspresi Protein Klotho RenalKami mengkaji ekspresi buah pinggang protein antipenuaan dalam kumpulan kawalan kenderaan dan AA. Ekspresi Klotho dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan AA berbanding dengan kumpulan kawalan kenderaan (Rajah 4A), manakala ekspresi buah pinggang nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) dan sirtuin1 (SIRT1) adalah serupa antara kumpulan (Rajah 4B, C).
3. PerbincanganUntuk pengetahuan kami, kajian ini adalah yang pertama memfokuskan pada penilaian perubahan yang berkaitan dengan penuaan buah pinggang dalam AAN menggunakan penanda penuaan, seperti aktiviti p16 dan SA- -gal. Rawatan AA menggalakkan atrofi buah pinggang, fibrosis tubulointerstitial dan kemerosotan fungsi buah pinggang, yang disertai oleh pengawalseliaan mRNA p16 buah pinggang dan pewarnaan SA- -gal-positif. Tambahan pula, kumpulan AA menunjukkan ciri-ciri mekanisme yang berkaitan dengan penuaan buah pinggang seperti keabnormalan mitokondria, peningkatan tekanan oksidatif, dan downregulation gen antipenuaan, Klotho. Diambil bersama, pemerhatian kami mencadangkan bahawa pentadbiran AA kronik sebahagiannya meniru penuaan buah pinggang.
Penuaan selular ialah penahanan kekal percambahan sel sebagai tindak balas kepada pelbagai tekanan, seperti kerosakan DNA, dan menyumbang kepada penuaan dan penyakit yang berkaitan dengan penuaan. Ekspresi p16, perencat kinase yang bergantung kepada cyclin, dikaitkan dengan penuaan dalam pelbagai organ, termasuk buah pinggang. Sekatan kalori meningkatkan jangka hayat dengan menghalang ungkapan pl6 [10]. Selain itu, penyingkiran p16-sel-sel senescent dalam tikus INK-ATTAC melalui suntikan AP20187, dimerizer protein pengikat FK506-[11], menyebabkan pengecilan fenotip penuaan buah pinggang, seperti sklerosis glomerular dan buah pinggang. kemerosotan fungsi. Oleh itu, p16 adalah salah satu faktor berkaitan penuaan yang paling penting. Sel senescent boleh dikesan menggunakan pewarnaan SA- -gal, yang menunjukkan peningkatan aktiviti -galactosidase pada pH 6.0 [12] dan merupakan penanda bio yang digunakan secara meluas bagi sel tua dan tua. Ekspresi mRNA buah pinggang pl16 meningkat dalam tikus tuabuah pinggangdan disertai dengan peningkatan aktiviti SA- -gal dalam epitelium buah pinggang [13I. Dalam kajian ini, kami menunjukkan peningkatan ekspresi mRNA p16 buah pinggang dan pewarnaan SA- -gal, menunjukkan bahawa AA mendorong penuaan buah pinggang. GLS baru-baru ini dilaporkan penting untuk kemandirian sel senescent melalui peningkatan glutaminolisis dan peneutralan pH intraselular [14]. Perencatan glutaminolisis yang bergantung kepada GLS dalam tikus tua ditunjukkan untuk menghapuskan sel senescent dan memperbaiki disfungsi organ yang berkaitan dengan usia. Dalam kajian ini, regulasi mRNA GLS buah pinggang menunjukkan pengumpulan buah pinggang sel senescent dalam kumpulan. Oleh itu, pentadbiran AA kronik menyebabkan penuaan selular dalam buah pinggang.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Sebagai tambahan kepada penuaan selular, disfungsi mitokondria adalah mekanisme penting yang mendasari kerosakan tisu berkaitan usia dan disertai dengan pengumpulan ROS [15,16. Disfungsi mitokondria memacu dan mengekalkan penuaan selular [17] manakala penuaan selular menyumbang secara langsung kepada disfungsi mitokondria [18]. Bnip3, yang terletak terutamanya dalam membran mitokondria luar, mungkin memainkan peranan dalam pengawalan mitophagy dalam sel tubular proksimal buah pinggang yang berbudaya sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif dan hipoksia. Dalam tikus yang berumur, sekatan kalori meningkatkan autophagy dalam sel tiub, melalui pengawalan Bnip3, dan meningkatkan degenerasi fungsi buah pinggang yang disebabkan oleh usia [19]. Dalam kajian ini, mikroskop elektron mendedahkan ciri-ciri keabnormalan mitokondria yang mungkin terjejas oleh pengurangan ekspresi Bnip3 buah pinggang atau penuaan selular. Mitokondria adalah sumber intraselular utama ROS. Untuk menilai kesan keabnormalan mitokondria pada ROS buah pinggang, kami memeriksa pengumpulan buah pinggang 4-HINE dan menunjukkan pengumpulan ROS yang disebabkan oleh AA dalambuah pinggang.NADPH oksidase adalah sumber utama ROS. Semasa fasa akut AAN pada tikus, ekspresi mRNA buah pinggang Nox2 dinaikkan, dan ketersediaan oksida nitrik dikurangkan, yang membawa kepada hipoksia dan iskemia yang berterusan [20. Dalam tikus tuabuah pinggang, pengumpulan ROS disertai dengan peningkatan ekspresi Nox2 [21]. Penemuan ini menunjukkan bahawa AA boleh mendorong jenis fenol yang berkaitan dengan usia melalui pengumpulan ROS yang disebabkan oleh disfungsi mitokondria dan pengawalan NADPH oksidase.
Ekspresi gen Renal Klotho telah menurun dalam kumpulan AA, manakala ekspresi NAMPT dan SIRTl adalah serupa antara kumpulan. Klotho ialah gen antipenuaan yang mengekod protein transmembran satu laluan yang bertindak sebagai penekan penuaan. Proses penuaan pada tikus kekurangan Klotho menyerupai pada manusia, termasuk jangka hayat yang lebih pendek, ketidaksuburan, arteriosklerosis, atrofi kulit, osteoporosis, dan emfisema [22]. Tikus Klotho mutant hypomorphic juga mempamerkan fenotip penuaan dipercepatkan, yang dipulihkan oleh ablasi p16 [23]. Memandangkan Klotho merupakan faktor penting dalam penuaan, tikus yang diubah suai gen Klotho telah digunakan secara meluas dalam penyelidikan mengenai penuaan. Walau bagaimanapun, tikus yang diubah suai gen Klotho mungkin tidak sesuai untuk penyelidikan tentang penuaan buah pinggang disebabkan oleh kerosakan sistemik yang berkaitan dengan penuaan tikus ini dan fakta bahawa fungsi buah pinggang tidak diuji (iaitu, tahap kreatinin). Sebaliknya, model tetikus AAN boleh digunakan sebagai model penuaan buah pinggang yang disebabkan oleh dadah untuk tujuan penyelidikan, kerana ia mempunyai beberapa kelebihan, seperti kemudahan relatif pelaksanaan dan keupayaan untuk menganggarkan kesan intervensi terhadap penurunan fungsi buah pinggang. .
Kajian ini mempunyai beberapa batasan. Kami menilai penuaan buah pinggang, memberi tumpuan terutamanya pada penuaan selular, morfologi mitokondria, dan ekspresi gen yang berkaitan dengan penuaan. Walau bagaimanapun, mekanisme penuaan adalah kompleks dan masih kurang difahami. Di samping itu, walaupun ekspresi gen Klotho telah menurun sebagai tindak balas kepada AA, kami tidak dapat menunjukkan hubungan kausal dengan perubahan patologi dalam AAN. Kajian lanjut diperlukan untuk menentukan peranan pelbagai molekul yang terlibat dalam pembangunan AAN. Walau bagaimanapun, kajian ini memberikan pandangan baru tentang penggunaan Avan sebagai model penuaan buah pinggang. Adalah penting untuk diperhatikan bahawa perubahan fenotip dalambuah pinggangsangat berkaitan dengan jangka hayat. walaupunbuah pinggangmudah dipengaruhi oleh perubahan yang berkaitan dengan penuaan, perencatan penuaan buah pinggang boleh memanjangkan jangka hayat keseluruhan. Oleh itu, penyelidikan lanjut mengenai penuaan buah pinggang menggunakan model AAN boleh membawa kepada peningkatan umur panjang pada masa hadapan.
4. Bahan dan Kaedah4.1. HaiwanKajian ini dijalankan mengikut garis panduan Institut Kesihatan Kebangsaan untuk penggunaan haiwan eksperimen. Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Kajian Haiwan Universiti Yokohama City (Nombor kelulusan: FA20-027) dan telah dijalankan dengan mematuhi garis panduan ARRIVE. Usaha telah dibuat untuk meminimumkan bilangan haiwan yang digunakan dan penderitaan mereka. Tikus ditempatkan dalam persekitaran terkawal di bawah kitaran 12-h cahaya/12-h gelap pada suhu 25 darjah C. Tikus mempunyai akses percuma kepada makanan dan air.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Tikus C57BL/6 jantan berusia lapan minggu telah dibeli dari Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) dan ditugaskan kepada kumpulan kawalan kenderaan atau AA selepas 1 minggu penyesuaian, tikus diberikan secara intraperitoneal dengan kenderaan atau AA (Sigma -Aldrich, St.Louis, MO, USA), yang telah dibubarkan dalam sedikit dimetil sulfoksida. Sebelum kajian ini, kami menjalankan kajian awal menggunakan beberapa protokol. Protokol pertama termasuk pentadbiran AA (3 mg/kg) kepada C57BL/6 tikus secara intraperitoneal dua kali seminggu selama 4 minggu tanpa masa pembentukan semula; dalam protokol ini, AA menyebabkan lesi buah pinggang akut yang terang-terangan, seperti tubul proksimal yang diluaskan dengan kehilangan sempadan berus (Tambahan Rajah S1). Dalam protokol kedua, tikus C57BL/6 ditadbir dengan AA (2.5 mg/kg) secara intraperitoneal sekali seminggu selama 4 minggu diikuti dengan masa pengubahsuaian selama 4 minggu; kreatinin plasma dalam tikus ini ialah 0.19 ± {{20}}.080 mg/dL berbanding 0.18 ± 0.010 mg/dL (masing-masing kawalan kenderaan berbanding AA; min ± ralat piawai bagi min (SEM), p=0.86, ujian-t Pelajar tidak berpasangan, n=4 setiap kumpulan) dan plasma UN ialah 31.3 ± 5.95 mg/dL berbanding 30.4 ± 3.87 mg/dL (masing-masing kawalan kenderaan berbanding AA; min ± SEM, p=0.90, ujian-t Pelajar tidak berpasangan, n=4 setiap kumpulan). Oleh itu, kami menentukan bahawa protokol ini tidak sesuai untuk model kecederaan buah pinggang kerana AA tidak menyebabkan penurunan fungsi buah pinggang yang ketara. Dalam protokol ketiga, tikus C57BL/6 ditadbir dengan AA (3 mg/kg) secara intraperitoneal dua kali seminggu selama 10 minggu tanpa masa pembentukan semula; dalam tikus ini, kadar kematian dalam kumpulan AA ialah 83 peratus (n=6), manakala tiada tikus dalam kumpulan kawalan kenderaan mati (n=4). Dalam protokol ini, kami tidak dapat menilai secara statistik fenotip buah pinggang yang disebabkan oleh AA kerana kematian yang tinggi. Dalam protokol keempat, tikus C57BL/6 ditadbir dengan AA (3 mg/kg) secara intraperitoneal dua kali seminggu selama 4 minggu diikuti dengan masa pembentukan semula selama 4 minggu; lesi buah pinggang kronik, seperti fifibrosis tubulointerstitial, dan penurunan fungsi buah pinggang diperhatikan pada tikus ini [9]. Oleh itu, berdasarkan keputusan penyiasatan awal ini, kami menerima pakai protokol keempat untuk menjalankan eksperimen dalam kajian ini.
4.2.Pengukuran BPBP sistolik dan kadar denyutan jantung diukur menggunakan kaedah tail-cuff yang diterangkan sebelum ini (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Jepun)[24,25]. Semua ukuran telah dilakukan antara 9:00 dan 14:00. Sekurang-kurangnya 10 ukuran telah dilakukan dalam setiap tetikus, dan nilai min digunakan untuk analisis.
4.3. Analisis PCR Transkripsi Balik Kuantiti Masa Nyata Jumlah RNA diekstrak daripada tisu buah pinggang menggunakan ISOGEN (Gen Nippon, Tokyo, Jepun), dan DNA pelengkap (cDNA) disintesis menggunakan SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Analisis PCR transkripsi terbalik kuantitatif masa nyata telah dilakukan menggunakan Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata Sentuh CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Amerika Syarikat), dan produk transkripsi terbalik telah diinkubasi dengan TaqMan PCR Master Mix dan TaqMan tersuai probe (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), seperti yang diterangkan sebelum ini [26]. Probe TaqMan terhadap gen berikut telah digunakan: kolagen I(Mm00801666_g1), kolagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) dan Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA telah dinormalisasikan kepada RNA ribosom 18S.
4.4. Analisis Western Blot Ekspresi protein dianalisis oleh analisis blot barat bagi homogenat tisu menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini [27,28]. Jumlah ekstrak protein telah disediakan daripada tisu menggunakan penimbal sampel yang mengandungi natrium dodesil sulfat. Kepekatan protein setiap sampel diukur menggunakan Kit Ujian Protein Serasi Detergen (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) dan NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), dengan albumin serum lembu sebagai standard. Jumlah ekstrak protein yang sama daripada sampel tisu dipecahkan pada 5-20 peratus gel poliakrilamida (ATTO Corp., Tokyo, Jepun). Protein yang diasingkan kemudiannya dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida menggunakan Sistem Pemindahan Semi-Kering (ATTO Corp., Tokyo, Jepun). Membran disekat selama 1 jam pada suhu bilik dengan garam penimbal fosfat yang mengandungi 5 peratus serbuk susu skim. Membran diinkubasi dengan antibodi utama terhadap Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, Amerika Syarikat), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Jepun), dan glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Membran dibasuh dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 60 minit pada suhu bilik. Tapak untuk tindak balas antibodi-antigen telah divisualisasikan menggunakan substrat chemiluminescence yang dipertingkatkan (Merck, Kenilworth, NJ, USA).GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan. Imej dianalisis secara kuantitatif menggunakan ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Amerika Syarikat).
4.5. Analisis Histologi telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [29]. Tisu buah pinggang daripada tikus telah diperbaiki dengan 4 peratus paraformaldehid dan seterusnya tertanam dalam parafin. Bahagian (tebal 4 um) telah diwarnai dengan kesan PAS dan MT. Untuk menilai kawasan glomerular, 50 glomeruli setiap tetikus diukur dan dipuratakan. Semua imej telah diperoleh menggunakan mikroskop BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Jepun).
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
4.6. SA- -al Pewarnaan Tisu buah pinggang daripada tikus telah dibekukan dengan cepat dan dipasang dalam sebatian Suhu Pemotongan Optimum （Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Jepun）. Bahagian（4 μm tebal）disediakan menggunakan cryostat (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) dan dipasang pada slaid kaca. Aktiviti SA- -gal diukur menggunakan kit pengesanan penuaan (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) mengikut protokol pengeluar. Sampel dilihat di bawah medan terang pada pembesaran ×100 menggunakan BZ-9000mikroskop (Keyence Corp.. 4.7.Electron MicroscopyAnalisis mikroskop elektron telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [30]. Tikus-tikus telah dibius dengan isoflurane dan diserap melalui gerbang aorta kanan dengan garam fisiologi heparin (5 U/mL) dan 2.5 peratus glutaraldehid dalam penimbal fosfat 0.1 mol/L pada pH 7.4. Spesimen untuk mikroskop elektron penghantaran telah direndam dalam 1 peratus osmium tetroksida selama 2 jam, dehidrasi secara bersiri dalam etanol, dan dibenamkan dalam campuran Epon. Bahagian UlItrathin telah diwarnakan dengan uranil asetat dan plumbum sitrat dan diperiksa menggunakan mikroskop elektron penghantaran Hitachi H{10}} yang dikendalikan pada 80 kV(Hitachi, Ltd., Tokyo, Jepun). Bahagian diperhatikan pada pembesaran × 5000 dan difoto menggunakan kamera peranti berganding cas.
4.8.Analisis BiokimiaSampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung dalam keadaan makan. Sampel darah keseluruhan telah disentrifugasi pada 3000 rpm (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Jepun) selama 10 minit pada 4 darjah untuk memisahkan plasma. Sampel plasma yang terhasil telah disimpan pada -80 darjah . Paras kreatinin plasma, PBB, dan kreatinin kencing diukur menggunakan penganalisis automatik Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Jepun).
4.9. Analisis statistik Analisis statistik dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data dibentangkan sebagai min ± SEM. Ujian f Pelajar tidak berpasangan digunakan untuk membandingkan perbezaan antara kumpulan kawalan kenderaan dan AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. KesimpulanPentadbiran AA menyebabkanbuah pinggangpenuaan, bersama-sama dengan fibrosis tubulointerstitial dan atrofi buah pinggang. Keputusan menunjukkan bahawa fibrosis buah pinggang berkait rapat dengan penuaan buah pinggang dan AAN mungkin berguna sebagai abuah pinggang-model penuaan khusus.