Potensi Antioksidan Dan Anti-penuaan Formulasi Peptida (Gal2–Pep) Terkonjugasi Dengan Asid Gallic
May 04, 2023
Kulit sangat terdedah kepada penuaan pramatangdisebabkan oleh tekanan luaran, oleh itu, dalam kajian ini, formulasi peptida, (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) telah disintesis dengan menggabungkan TPPTTP peptida, dan gallicasid (GA). Semua peptida telah disintesis pada 2-resin klorotritil klorida menggunakan peptida fasa pepejalsintesis (SPPS), dan dianalisis pada pengionan electrospray (ESI)/quadrupole-time-of-flflight (Q-TOF) sistem spektroskopi jisim tandem (MS). Pada mulanya, Gal2–Pep tidak menunjukkan ketoksikan di bawah kepekatan 100mM dengan kadar survival sel sebanyak 88 peratus untuk keratinosit danfibroblas. Thespesies oksigen reaktif(ROS) aktiviti mengais Gal2–Pep adalah lebih stabil berbanding dengan GA sahaja; dan selepas empat minggu di biliksuhu, ituAktiviti mencari ROSkekal lebih tinggi daripada 50 peratus . Selain itu, formulasi peptida,Gal2–Pep juga mempamerkan kesan perencatan elastase dalam CCD-1064Skfibroblastsel. Berdasarkan keputusan RT-qPCR, telah dibuktikan dalam kajian ini bahawa Gal2–Pep meningkatkan ekspresi PGC-1a kepadamencegahtekanan oksidatif, dan mengesahkan potensinya sebagaiagen anti penuaanolehmeningkatkan ekspresikolagen jenis Idan olehmengurangkan ungkapan matriks metalloproteinase-1 (MMP1). Thepenemuan diperolehi mengukuhkan cadangan bahawa formulasi peptida yang disintesis dalam kajian ini boleh digunakan sebagai aantioksidan semulajadidanagen anti penuaanuntuk aplikasi kosmetiknya.
Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Maklumat Lanjut Mengenai Produk Anti-Penuaan Cistanche
1. Pengenalan
Penuaan kulitberlaku akibat penurunan beransur-ansur dan akhirnya terhenti pembahagian sel keratinosit dan broletupan dalam kulit. Kedutan pada kulit berkembang apabila bilangan sel berkurangan, dengan hasil denaturasi matriks ekstraselular menyebabkan kekeringan dan kehilangan elaskekejangan pada kulit.1 Kerosakan kepada DNA mitokondria intraselulardan pengurangan kadar sintesis protein juga berlakusemasa proses penuaan kulit.2 Penuaan kulit mempunyai dua laluan utamacara, intrinsik dan ekstrinsik, dengan pendedahan ultraungu (UV).
pemandu utamapenuaan ekstrinsik. Cahaya UV bertindak balas dengan komponen kulit utama, termasuk lipid, protein, dan asid nukleik, untuk menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) yang membawa kepada selkematian.3–5 Tahap ROS yang berlebihan juga membawa kepada belahan danpengikatan rantai kolagen atau elastin yang tidak normal dan menggalakkan ekspresi metalloproteinase matriks (MMP), seperti MMP-1, yang memecahkan kolagen, yang membawa kepada kedutan kulit danmempercepatkan penuaan kulit.6,7 Oleh itu, terapi antioksidan untuk membuangROS dan untuk mengaktifkan potensi mitokondria mempunyai kebaikan untuk melindungi kulit daripada penuaan.
Sebagai tambahan kepada ROS, elastase mempunyai peranan penting dalam kehilangankeanjalan kulit, yang memecahkan elastin, protein penting bagimatriks ekstraselular.8 Elastin, disebabkan oleh kemunduran yang ketaraciri-ciri, memberikan keanjalan pada kulit, manakala elastase mempunyaikeupayaan untuk membelah elastin dan protein lain.8 Oleh itu, menghalangEnzim elastase boleh menjadi strategi utama untuk kulit kendur melalui mencegah kehilangan keanjalan kulit.
Dalam kajian ini, kami mereka bentuk bahan baharu yang menggabungkanperoxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1-alfa (PGC-1a)-diperolehi peptida TPPTTP dan asid gallic (GA)untuk digunakan dalam kosmetik anti-penuaan. GA ialah fitokimia yang terdapat dalam pelbagai buah-buahan dan sayur-sayuran, termasuk anggur, tomato, dan teh hijau, yang diketahui mempunyai antioksidan dan antibakteria yang tinggi. effects.9 Walaupun GA digunakan dalam industri kosmetik dan makanan kerana effects, formulasinya cenderung tidak stabil.10 Oleh itu, kami membangunkan (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) untuk meningkatkan kestabilan GA dengan mengikatnya pada PGC-1a-diperolehi peptida TTPTTP.
Dalam kajian ini, kami mensintesis a (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) rumusan peptida dalam konjugasi dengan asid gallic dan disahkanpotensinya sebagai agen antioksida dan antipenuaan.
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Bahan
Dulbecco's ModifiedEagle's Medium (DMEM), penisilin/streptomisin, serum lembu janin (FBS), fosfat-bufferedsaline (PBS), dan trypsin telah dibeli daripada Gibco (Carls
buruk, CA). Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropyl carbodiimide (DIC), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropylethylamine (DIEA), asid gallic danN-suksinil-tri-alanil-pnitroanilide diperolehi daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Membentuk asid amino (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH dan Fmoc-Pro–OH) telah dibeli daripada Bead-Tech (Seoul,Korea).
2.2. Sintesis peptida dan peptida bergandingan asid gallik
Semua peptida telah disintesis pada 2-resin klorotritil klorida (200mskala mol, nilai penggantian¼ 1.46 mmol g 1) menggunakan HOBt–DIC pengantara sintesis peptida fasa pepejal (SPPS).
Sintesis peptida menggunakan kaedah SPPS telah dijalankan dengan sedikit modikation merujuk kepada kajian lepas.11–13 2-resin klorotritil klorida (CTC) telah membengkak dalam dichloro
metana (DCM, 8 mL) selama 30 minit. Damar telah dibasuh dengandimetilformamida (DMF). Semua tindak balas dilakukan pada suhu bilik. Derivatif asid amino yang dilindungi Fmoc (2 setara(Setara), untukfiasid amino melekat pertama atau 5 setara, untuk asid amino yang lain) digandingkan dengan sama ada DIEA (5 setara, untuk asid amino melekat) atau HOBt/DIC (6 setara/5 setara) dalam DMF akakiehmelakukan penyahlindungan Fmoc menggunakan 2 peratus (v/v) DBU dalam DMF (2 kali, 2 min satu masa, 8 mL). Dan semua langkah telah dibasuh 5 kali dengan DMF. Asid gallik akhir digabungkan dengan peptida yang melekat pada lisin.Selepas gandingan asid gallic, resin adalahadiganti, dibasuh,dan dikeringkan di bawah vakum yang tinggi. Penyelesaian belahan (TFA:air [DI] ternyahion: TIS¼ 95 : 2.5 : 2.5, v/v/v peratus ) telah dirawat selama 2 jamuntuk mendapatkan peptida mentah. Peptida mentah telah dimendakkan dan dibasuh tiga kali dengan dietil eter sejuk.
Kromatografi cecair berprestasi tinggi fasa terbalik analitik(RP-HPLC) telah dijalankan pada Waters 2695 SeparationModul dengan lajur Capcell Pak C18 (4.6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Fasa mudah alih terdiri daripada 0.05 peratus TFA dalam H2O (fasa mudah alih A) dan 0.05 peratus TFA dalam asetonitril (fasa mudah alih B).
Elusi dicapai dengan menggunakan kecerunan linear untuk mudah alihfasa B sebanyak 5 peratus hingga 65 peratus selama 30 minit pada akadar ow 1.0 mL min 1. Puncak peptida dikesan pada panjang gelombang 230 nm. RP-HPLC separuh persediaan telah dijalankan pada sistem HPLC Waters (Pam 600E, Pengesan UV-484) dengan Gemini RP-C18lajur (21.2 mm 250 mm, 5mm, Fenomena). Fasa mudah alih terdiri daripada 0.05 peratus TFA dalam H2O (fasa mudah alih A)dan 0.05 peratus TFA dalam asetonitril (fasa mudah alih B). Elusi dicapai dengan menggunakan kecerunan linear untuk fasa mudah alih B bagi7 peratus hingga 22 peratus selama 15 minit pada alkadar ow 10 mL min 1. Thepuncak peptida dikesan secara spektrofotometri pada panjang gelombang 230 nm.
Peptida yang disintesis telah dibubarkan dalam 5 peratus asid formik dalam air dan dianalisis pada pengionan semburan elektro (ESI)/empat-empat-masa-light (Q-TOF) spektroskopi jisim tandem(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Sampel telah disuntik ke dalam sistem Q-TOF yang dilengkapi dengansumber semburan nano di alkadar ow 1mL min 1. Ion ESIparameter sumber adalah seperti berikut: voltan semburan ion 1.5 kV, gas tirai pada 10 psi, dan gas sarung pada 5 psi. Spektrum dalammod imbasan penuh dan MS/MS dikumpulkan dalam julatm/z
100–1200 Da pada masa pengumpulan 25 ms setiap spektrum.Tenaga perlanggaran telah ditingkatkan daripada 10 kepada 80. Hasilnyadata telah diperoleh menggunakan Analyst TF jadiware dan secara automatikditetapkan oleh centroid 80 peratus dengan puncak minimum, pengurangan hingar sebanyak 10 peratus , penyahisotopan sederhana dengan ambang 3 peratus, tiada pengurangan hingar dan tiada pelicinan. Peptida yang disintesis telah dikenalpastidengan toleransi jisim 0.05 Da dan disusun secara manual menggunakan toleransi MS/MS 0.01 Da.
2.3. Kultur sel dan ujian daya maju
Sel manusia, dewasa, kalsium rendah, suhu tinggi (HaCaT).dan CCD-1064Sk (kulit manusia biasafibroblast) sel adalahdikultur dalam DMEM dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus penisilin/streptomycin. Sel-sel telah diinkubasi pada 37 C dalam ruang udara lembap dengan 5 peratus CO2.Untuk ujian daya maju, kit pengiraan sel-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, China) telah digunakan. HaCaT dan sel CCD-1064Sktelah disemai dalam 96-plat mikro perigi (5 103 sel setiap telaga) dan diinkubasi pada 37 C dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam. Budaya kemudiannya terdedah kepada kepekatan berbeza peptida atau GA yang disintesis dan diinkubasi pada 37 C dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam. Daya maju selkemudiannya diukur menggunakan CCK-8 mengikut garis panduan pengilang.
2.4. Penentuan aktiviti antioksidan
2.4.1. ujian DPPH.Aktiviti antioksidan yang disintesispeptida dan GA dinilai secara individu menggunakan ujian DPPH. Ujian DPPH telah dilakukan berikutan yang dilaporkan sebelum ini
metodologi dengan modi kecilkation.12,14–16 Pertama, 0.12 mg mL 1 Larutan DPPH disediakan dalam metanol, kemudian 100mL larutan DPPH dan 100mL daripada peptida yang disintesis atau GA dicampur pada kepekatan yang berbeza ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM dan 1mM) dalam 96-plat mikro perigi. Dalam inkubator goncang orbit, yangcampuran telah bertindak balas selama 30 minit pada 37 C dan 100 rpm tanparingan. Penyerapan kemudiannya diukur pada 517 nm dan kapasiti antioksidan dikira.
2.4.2. Aktiviti mencari ROS.
Aktiviti penghapusan ROS intraselular telah dinilai menggunakan kit 20,70-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA, Abcam, Amerika Syarikat). Sel HaCaT telah disemai dalam 96-plat mikro telaga (5 103 sel setiap telaga) dan diinkubasi pada 37 C selama 24 jam.AkakiDalam pengeraman, kultur telah terdedah kepada peptida yang disintesis atau GA (100mM) dan diinkubasi pada 37 C selama 24 jam. Sel-sel itu kemudiannya terdedah kepada 10mLarutan M DCF-DA dan diinkubasi selama 30 minit. Akakier inkubasi, larutan telah dibasuh dengan PBS. Thesel dianalisis menggunakan pembaca plat mikro pada pengujaan dan
pancaran panjang gelombang 485 nm dan 530 nm, masing-masing.
Rajah 1Pengesahan langkah dan jujukan sintetik peptida menggunakan masa empat kali ganda bagipenerbangan(Q-TOF) spektrometri jisim: (a) prosedur sintetik terperinci (b) TPPTTP, (c) galloil–TPPTTP, dan (d) (galloyl)2–KTPPTTP.
2.5. Ujian potensi membran mitokondria
Pewarna JC-1 (Thermo Fisher, USA) digunakan untuk mitokondriaujian potensi membran (MmP). CCD-1064Sk dan sel HaCaT telah disemai dalam 96-plat mikro telaga (5 10 3sel setiap telaga)
dan diinkubasi pada 37 C dan dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam. After inkubasi,kultur telah terdedah kepada kepekatan berbeza peptida yang disintesis dan diinkubasi pada 37 C dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam.Pewarna JC-1 telah ditambahkan pada sel-1064CCD dan HaCaT untukmenghasilkan a kepekatan akhir 10mM. Akaki10 minit pengeraman, sel telah dibasuh dua kali dengan 37 C PBS. Hijau dan merahpendarfluordiukur menggunakan Varioskan LUXPembaca Microplate Multimode (ThermoFisher, USA) di excitation (lCth)/pelepasan (lEm) daripada 475/530 nm dan alCth/lEmdaripada 475/590 nm, masing-masing.
2.6. Ujian aktiviti penghambatan Elastase
CCD-1064Sel Sk telah disemai dalam 6-plat perigi dan diinkubasi pada 37 C dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam. Budaya kemudiannya didedahkan kepada kepekatan 100mM daripada peptida yang disintesis atau GA dan diinkubasi pada 37 C dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam. Sel telah dibasuh dengan dPBS dua kali dan kami mengumpul setiap sel menggunakan pengikis sel. Aer menambah 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) dengan 0.1 peratus Triton-X kepada yang dikumpulsel, sel telah dihomogenkan oleh ultrasonicator. Larutan homogen diempar selama 20 minit pada 3000 rpmdan 4 C. Kemudian, akakier mengambil supernatan, kuantiti protein-kation dilakukan menggunakan ujian protein BCA. Protein untuk setiap satusampel telah dikeluarkan difikepekatan akhir 100mgmL 1, danN-suksinil-tri-alanil-p-nitroanilide telah ditambah padakepekatan akhir 1.6 mM dan bertindak balas pada 36 C selama 1 jam.Kemudian, penyerapan diukur pada 405 nm menggunakan pembaca plat mikro.
2.7. RT-qPCR
Tahap mRNA penanda antipenuaan dalam sel Sk-1064CCKtelah dinilai menggunakan RT-qPCR. Jumlah RNA dikumpul menggunakan reagen TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) dan terbalik
ditranskripsi menggunakan kit reagen PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Jepun). Sistem CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) dan iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora
tories) digunakan untuk RT-qPCR.b-Actin digunakan untuk menormalkan tahap mRNA kolagen jenis I, MMP-1 dan PGC-1a.
2.8. Analisis statistik
Data dibentangkan sebagai min sisihan piawai daripadatiga ukuran bebas dan dianalisis menggunakan Student'st-ujian, dengan ap < 0.05 considered to be a signitidak dapat perbezaan.
Minta lebih lanjut:
E-mel:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: tambah 86 15292862950
