Sifat Anti-tyrosinase Dari Pelbagai Spesies Kunyit Dan Pengasingan Sebatian Aktif Daripada Curcuma Amada
Mar 18, 2022
Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1
1 Fakulti Pertanian, Universiti Ryukyus, Okinawa, Jepun
2 Jabatan Farmakologi, Fakulti Sains Veterinar, Universiti Pertanian Bangladesh, Mymensingh, Bangladesh
Untuk maklumat lanjut:Scotty.Wang@wecistanche.com
Abstrak
Kunyit secara tradisinya digunakan sebagai kosmetik kulit dalam beberapa majlis keagamaan dan kebudayaan di benua kecil India. Dalam kajian ini, kami membandingkan sifat perencatan tyrosinase bagi empat Curcuma spp., iaitu, C. xanthorrhiza, C. aromatik, C. amada, dan C. zedoaria. Pengasingan berpandukan bioassay dan penulenan perencat tyrosinase menggunakan lajur gel silika dan kromatografi cecair berprestasi tinggi. Pengenalpastian struktur sebatian telah dijalankan menggunakan 1 H NMR, 13C
NMR, dan spektrometri jisim tandem kromatografi cecair. C. amada menunjukkan aktiviti perencatan tyrosinase tertinggi, dengan IC50 sebanyak 53.4 ug/mL. Oleh itu, ia dipilih untuk pengasingan dan penulenan perencat tyrosinase. Sebatian yang telah ditulenkan ialah zederone (1), furanodienone (2), 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl){ {13}}(4-hidroksifenil) heptana (3), 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksi fenil)-7-({{22 }}hidroksi-3-methoxyphenyl) heptana (4) dan 1,5- epoxy 3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl) -7-(4-hidroksi-3-methoxyphenyl) heptana (5). Nilai IC50 untuk cendawananti-tirosinaseaktiviti sebatian 1, 2, 3, 4, dan 5 ialah 108.2, 89.2, 92.3, 21.7, dan 41.3 µM, masing-masing. Sebatian ini juga menghalang aktiviti tyrosinase intraselular, sekali gus mengurangkan sintesis melanin dalam sel melanoma B16F10. Kompaun 4 menunjukkan lebih kuat dengan ketaraanti-tirosinaseaktiviti daripada arbutin (ubat kawalan positif). Tiada perbezaan ketara diperhatikan dalam kesan perencatan tyrosinase antara sebatian 5 dan arbutin. Penemuan kami sangat mencadangkan bahawa C. Amanda adalah sumber perencat tyrosinase semulajadi yang menjanjikan untuk mencegah melanogenesis dan boleh digunakan sebagai kosmetik pemutihan.
Kata kunci: Curcuma amada ● Sebatian aktif ● NMR ● Anti-tirosinase ● Antimelanogenik
Cjilat ke Cistanche untuk anti-tirosinase
pengenalan
Melanin adalah pigmen hitam dalam rambut dan kulit dan penting untuk melindungi kulit daripada sinaran UV. Pigmen dihasilkan oleh sel melanosit, terdapat dalam lapisan basal dermis melalui proses fisiologi yang dipanggil melanogenesis. Walau bagaimanapun, pengeluaran melanin yang tidak normal menyebabkan gangguan dermatologi seperti jeragat, melasma, lentigin, bintik-bintik penuaan, ephelid, dan hiperpigmentasi selepas keradangan [1]. Dalam industri makanan, hiperpigmentasi buah-buahan dan sayur-sayuran membawa kepada kehilangan kualiti pemakanan dan nilai pasaran yang ketara [2]. Melanogenesis boleh dikawal dengan menghalang aktiviti tyrosinase, enzim pengehad kadar untuk sintesis melanin dalam mamalia, tumbuhan, mikroorganisma, dan kulat [3]. Oleh itu, perencatan aktiviti tyrosinase menghalang hiperpigmentasi dan membawa kepada pemutihan kulit. Ia juga mengawal kualiti sayur-sayuran dan buah-buahan dengan mengawal selia pemerangan sayuran dan makanan yang tidak diingini. Kebanyakan agen pencerah kulit, seperti hidrokuinon, asid azelaik, asid kojik, dan arbutin adalah perencat tyrosinase yang kuat. Walau bagaimanapun, mereka mempunyai pelbagai kesan yang tidak diingini seperti sitotoksisiti, ochronosis, vitiligo, kerengsaan, pengelupasan kulit, dan kemerahan [4]. Selain itu, asid kojic dan -arbutin menunjukkan kestabilan formulasi yang lemah dan keupayaan penembusan kulit, dan keberkesanan yang rendah dalam vivo [5]. Beberapa garam merkuri organik dan bukan organik mempunyai kesan anti-melanogenik dan digunakan dalam agen pemutihan kulit. Walau bagaimanapun, melalui penyerapan kulit, sebatian merkuri boleh menyebabkan kesan toksik seperti perubahan warna kulit, kerosakan buah pinggang, tindak balas alahan, dan parut [6]. Oleh itu, penyiasatan perencat tyrosinase yang kurang toksik dan lebih berkesan diperlukan. Kunyit (keluarga: Zingiberaceae; genus: Curcuma), tumbuhan ubatan tradisional yang tumbuh terutamanya di kawasan tropika dan subtropika Asia dan Afrika, mempunyai spektrum luas fungsi farmakologi. Ia telah digunakan secara tradisional dalam upacara pra-perkahwinan selama beribu-ribu tahun di benua kecil India sebagai agen pencerah kulit. Kunyit dipercayai dapat memperbaiki seri kulit dengan mengurangkan pertumbuhan rambut muka, jerawat, dan penuaan kulit [7, 8]. Oleh itu, produk penjagaan kulit yang ditambah dengan kunyit boleh didapati secara komersial di pasaran [9]. Lebih daripada 70 spesies/varieti kunyit dengan sifat kimia dan farmakologi yang berbeza telah dikenal pasti. Walau bagaimanapun, terdapat kekurangan maklumat saintifik tentang sifat anti-melanogenik spesies kunyit yang berbeza dan komponen aktif yang berpotensi yang terdapat dalam kunyit. Curcuminoids adalah sebatian aktif utama yang bertanggungjawab untuk sebahagian besar aktiviti biologi kunyit. Curcuminoids mempunyai potensi dalam kosmeseutikal sebagaiantioksidan, anti-radang,dan agen pencerah kulit [7, 8]. Walau bagaimanapun, dalam kajian terdahulu, kami mendapati variasi ketara dalam kandungan curcuminoid dalam kunyit, dan beberapa spesies (C. amada, C. zedoaria) tidak mengandungi curcumin [10]. Kami juga melaporkan antikulat,antioksidan, dan aktiviti vasodilator pelbagai spesies dan jenis kunyit [10–13]. Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk menilai kesan spesies kunyit yang berbeza, iaitu, C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada, dan C. zedoaria, terhadap enzim tyrosinase dan untuk mengenal pasti sebatian kimia khusus yang bertanggungjawab untukanti-tirosinaseaktiviti. Kami juga menilai aktiviti perencatan tyrosinase dan kesan anti-melanogenik sebatian aktif yang telah dimurnikan pada sintesis melanin dalam sel melanoma B16F10.
Keputusan dan perbincangan
Di antara empat spesies kunyit yang berbeza, ekstrak MeOH C. amada menunjukkan kesan perencatan tyrosinase cendawan maksimum dengan nilai IC50 53.4 ± 2.7, diikuti oleh C. xanthorrhiza, C. aromatik, dan C. zedoaria (Rajah 1a). Curcumin ialah komponen aktif utama kunyit (Curcuma longa) dan mempunyai pelbagai aktiviti biologi, termasuk aktiviti anti-kanser, anti-radang, anti-bakteria, anti-kulat dan antioksidan. Ia menunjukkan 75-aktiviti anti-tirosinase kali ganda lebih kuat daripada arbutin dan asid kojik [14]. Walau bagaimanapun, dalam kajian terdahulu, kami melaporkan bahawa terdapat variasi ketara dalam kandungan curcumin dalam spesies kunyit yang berbeza [10].
Curcumin hadir dalam C. xanthorrhiza dan C. aromatik tetapi tiada dalam C. zedoaria dan C. amada [10]. Dapatan menarik kajian ini ialah, tanpa curcumin, C. amada menunjukkan aktiviti perencatan tyrosinase yang kuat. Keputusan ini menunjukkan bahawa mesti terdapat beberapa sebatian aktif C. amada dikaitkan dengan kesan anti-tirosinase yang kuat. Aktiviti anti-tirosinase C. xanthorrhiza dan C. aromatica mungkin disebabkan oleh kandungan curcuminnya. Walau bagaimanapun, kami tidak dapat menolak kemungkinan kehadiran sebatian lain. Ekstrak MeOH C. amada telah difraksikan dengan air, n-heksana dan EtOAc. Di antara tiga pecahan ini, EtOAc menunjukkan kesan perencatan yang jauh lebih kuat daripada air dan n-heksana (Rajah 1b). Oleh itu, bahagian EtOAc telah diambil untuk pecahan selanjutnya. Aktiviti anti-tirosinase enam pecahan [n-heksana:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) dan 0:100 (F6)] diperoleh daripada bahagian EtOAc C. amada dibandingkan. Di antara enam pecahan ini, F6 dan F3 menunjukkan aktiviti anti-tirosinase yang jauh lebih tinggi daripada yang lain (Rajah 1c). Kemudian struktur kimia lima sebatian daripada pecahan F3 dan F6 telah dikenal pasti mengikut spektrum 1 H NMR dan 13C NMR mereka. Data puncak adalah seperti berikut:
Kompaun 1:
Kristal bentuk jarum tidak berwarna; UV λmax: nm 234, 285. ESI-MS ( tambah ) m/z: 247.3 [M tambah H] tambah , 229.4 [ M tambah H-H2O] tambah . 1 H-NMR (CD3OD): δ 7.22 (1H, s, H-12), 5.59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{20}}) , 3.99 (1H, s, H-5), 3.85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3.69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2.57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2.26 (1H, m, H{{46 }}a), 2.20 (1H, m, H{{50}}b), 2.09 (3H, s, H-13), 1.57 (3H, s, H-15), 1.32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1.28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD3OD): δ 194.2(C-6) 160.2(C-8), 139.7(C12), 132.8 (C-1), 132.0(C-10 ), 124.3(C-11), 123.0(C-7), 67.8(C-5), 65.2(C-4), 42.5(C-9 ), 39.0(C-3), 25.4(C-2), 15.7 (C-15), 15.4(C-14), 10.7(C-13 ) (Data Tambahan). Daripada perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [15, 16], bahan itu dikenal pasti sebagai zederone (Rajah 2). Ia adalah sesquiterpene, sebelum ini diasingkan daripada C. amada dan C. zedoaria dan telah dilaporkan untuk kesan analgesik, anti-radang, anti-kulat dan sitotoksiknya [12, 17-20].
Kompaun 2:
Minyak tidak berwarna; UV λmaks: nm 243, 280. ESIMS ( tambah ) m/z: 231.0 [M tambah H] tambah , 223.3 [M tambah H-H2O] tambah . 1 H-NMR (CD3OD): δ 7.16 (1H, s, H-12), 5.83 (1H, s, H-5), 5.21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3.73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3.63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2.45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2.31 (1H, m, H-2a ), 2.20 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2.06 (3H, s, H{{57} }), 1.92 (3H, s, H-14), 1.89 (1H, m, H-3b), 1.25 (3H, s, H-15). 13C-NMR (CD3OD): δ 191.8 (C-6), 158.6 (C-8), 147.6 (C-4), 140.0 (C-12), 136.1 ( C-10), 133.3 (C-5), 132.0 (C-1), 124.6 (C-11), 123.1 (C-7), 42.4 ( C-9), 41.4 (C-3), 27.3 (C-2), 19.3 (C-14), 15.9 (C-2), 9.9 ( C{117}}) (Data Tambahan). Daripada perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam kesusasteraan [21], bahan tersebut dikenal pasti sebagai furanodienone (Rajah 2). Ia diasingkan daripada Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. bekas cangkuk. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] dan Curcuma wenyujin [23]. Ia adalah furanosesquiterpenoid yang mempamerkan aktiviti anti-kulat [12], anti-radang [19], anti-kanser [24], anti-bakteria dan anti-oksida [22].
Kompaun 3:
Minyak kekuningan; UV λ maks: nm 275. ESIMS ( tambah ) m/z: 383.3 [M tambah Na] tambah , 361.3 [M tambah H] tambah , 343.2 [M tambah H-H2O] tambah . 1 H-NMR (CD3OD): δ 6.99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6.67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6.52 (2H, s, H-2´, -6´), 4.63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4.21 (1H, m, H-3), 3.89 (1H, m, H-5), 3.85 ( 3H, s, 5´-OCH3), 2.63 (2H, m, H-7), 1.82 (1H, m, H-2a), 1.78 (1H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1.73 (1H, m, H-2b), 1.69 (1H, m, H-4a), 1.68 (1H, m, H{{72} }b), 1.53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 156.3 (C-4´´), 149.5 (C-5´), 146.4 (C-3´), 134.5 (C-4 ´), 134.44 (C-1´), 134.41 (C-1´´), 130.4 (C-2´´, -6´´), 116.1 (C{ {104}}´´, -5´´), 108.0 (C-2´), 102.8 (C-6´), 75.2 (C-1), 72.6 ( C-5), 65.6 (C3), 56.6 (5´-OCH3), 41.1 (C-2), 39.5 (C-4), 39.2 (C-6) 31.8 (C-7) (Data Tambahan). Daripada perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [25], bahan itu dikenal pasti sebagai 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ {145}} methoxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl) heptana (Gamb. 2). Ia telah diasingkan daripada rizom Zingiber officinale, dan sifat antioksidannya telah dikaji [25].
Kompaun 4:
Sirap likat; UV λ maks: nm 281. ESIMS ( tambah ) m/z: 385.3 [M tambah Na] tambah , 363.3 [M tambah H] tambah , 345.2 [M tambah H-H2O] tambah . 1 H-NMR (CD3OD): δ 6.75 (1H, d, J=2 Hz, H-2´), 6.68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}´), 6.64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6.61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6.60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6.49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3.80 (3H, s, 3´-OCH3), 3.73 (2H, m, H-3, -5), 2.64-2.47 (4H, m, H{{59 }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1.65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1.61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 148.8 (C-3´), 146.1 (C-3´´), 145.4 (C-4´), 144.2 (C-4 ´´), 135.24 (C-1´ atau C-1´´), 135.22 (C-1´ atau C-1´´), 121.8 (C{{101 }}´), 120.6 (C-6´´), 116.5 (C-2´´), 116.3 (C-5´´), 116.1 (C-5´ ), 113.2 (C-2´), 70.94 (C-3 atau C-5), 70.92 (C-3 atau C-5), 56.4 (3 ´-OCH3), 44.9 (C-4), 40.8 (C-2, -6), 32.3 (C-1), 32.1 (C-7) (Data Tambahan). Daripada perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [26, 27], bahan itu dikenal pasti sebagai minyak 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl){{150 }} (4-hidroksi-3-methoxyphenyl) heptana (Gamb. 2). Ia telah diasingkan daripada rizom Tacca chantrieri [26] dan Curcumalonga L. [27]. Ia adalah diarilheptanoid yang mempamerkan aktiviti sitotoksik [26] dan anti-tumor [27].
Kompaun 5:
Minyak tidak berwarna; UV λ maks nm: 279. ESI-MS ( tambah ) m/z: 413.3 [M tambah Na] tambah , 391.3 [M tambah H] tambah , 373.3 [M tambah HH2O] tambah . 1 H-NMR (CD3OD): δ 6.76 (1H, s, H-2´´), 6.67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6.21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6.53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4.63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4.21 (1H, m, H-3), 3.83 (3H, s, 5´-OCH3) , 3.78 (3H, s, 3-OCH3), 2.65 (2H, m, H-7), 1.84 (1H, m, H-2a), 1.79 (1H, m, H-6a), 1.74 (1H, m, H-2b), 1.69 (1H, m, H-4a), 1.68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1.53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 149.5 (C-5´), 148.8 (C-3´´), 146.4 (C-3´), 145.4 (C-4 ´´), 135.3 (C-1´), 135.2 (C-1´´), 134.4 (C-4´), 121.9 (C-6´´), 116.1 (C-5´´), 113.4 (C-2´´), 108.0 (C-2´), 102.7 (C-6´), 75.2 (C{ {121}}), 72.5 (C-5), 65.6 (C-3), 56.6 (5´-OCH3), 56.3 (3´´-OCH3), 41.2 (C{{140} }), 39.4 (C-4), 39.3 (C-6), 32.2 (C-7) (Data Tambahan). Daripada perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [20], bahan itu dikenal pasti sebagai 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ {157}}methoxyphenyl)- 7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) heptana (Gamb. 2) dan tiada maklumat tentang aktiviti biologinya. Kami mengasingkan sebatian 3, 4, dan 5 buat kali pertama daripada C. amada. Semua sebatian menunjukkan aktiviti perencatan terhadap tyrosinase cendawan
Lima sebatian, iaitu, zederone, furanodienone, 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl)- 7-( 4-hydroxyphenyl) heptana, 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dishy hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl) heptana dan 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl)- 7-(4- hidroksi-3-methoxyphenyl) heptana, telah diasingkan daripada pecahan F3 dan F6. Sebatian terpencil menunjukkan aktiviti anti-tirosinase dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Di antara lima sebatian, sebatian 4 menunjukkan aktiviti anti-tirosinase yang ketara lebih kuat daripada arbutin. Tiada perbezaan ketara dalam kesan anti-tirosinase antara kompaun 5 dan arbutin (Rajah 3). Kesan sebatian terpencil terhadap daya maju selular telah dikaji pada sel melanoma murine B16F10. Sel-sel telah dirawat dengan 50, 100, 200, dan 400 μM kepekatan kompaun selama 48 jam. Sebatian terpencil tidak menunjukkan kesan sitotoksik sehingga 200 μM, bagaimanapun, kira-kira lima puluh peratus daripada kematian selular diperhatikan dalam semua kes pada kepekatan 400 μM (Rajah 4). Oleh itu, kepekatan sehingga 200 μM digunakan untuk menilai antityrosinase intraselular dan kesan anti-melanogenik mereka.
Untuk menentukan aktiviti anti-melanogenik dan anti-tirosinase bagi sebatian terpencil, kesannya terhadap kandungan melanin dan aktiviti tyrosinase telah dinilai dalam sel melanoma B16F10. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1, sebatian terpencil kami yang bergantung kepada dos menghalang kandungan melanin intraselular dan aktiviti tyrosinase. Kompaun 4 adalah jauh lebih kuat daripada arbutin ubat kawalan positif dalam kedua-dua kesan perencatan melanin dan tyrosinase. Tiada perbezaan ketara diperhatikan antara kompaun 5 dan arbutin. Memandangkan tyrosinase selular meningkatkan pengeluaran melanin, pengurangan aktiviti tyrosinase adalah strategi yang cekap untuk pembangunan agen anti-melanogenik. Untuk ini, kami menilai sifat perencatan aktiviti tyrosinase intraselular dan melanogenesis dalam sel melanoma B16F10. Sama seperti penemuan aktiviti perencatan tyrosinase cendawan, sebatian terpencil menghalang aktiviti tyrosinase intraselular dan melanogenesis dalam cara yang bergantung kepada dos. Kesan anti-tirosinase daripada sebatian terpencil menghasilkan sifat anti-melanogeniknya. Susunan aktiviti anti-tirosinase dan anti-melanogenik bagi sebatian ini ialah sebatian 4 > arbutin > 5 > 2 > 3 > 1. Nilai IC50 yang dikira bagi sebatian 4 adalah jauh lebih rendah daripada arbutin. Keberkesanan sebatian 4 ialah 1.9- hingga 5-kali ganda lebih tinggi daripada empat sebatian yang lain. Kompaun 5 juga menunjukkan aktiviti anti-tirosinase yang kuat yang setanding dengan arbutin. Keputusan kami menunjukkan bahawa sebatian 4 dan 5 boleh digunakan sebagai perencat tyrosinase semula jadi yang berpotensi dan kosmetik pemutihan kulit. Tekanan oksidatif telah dicadangkan untuk terlibat dalam mekanisme asas pengeluaran berlebihan melanin [28]. Oleh itu, peranan antioksidan telah disiasat dalam pelbagai gangguan kulit, termasuk fotokarsinogenesis atau melanoma [9]. Kami dan yang lain sebelum ini melaporkan sifat anti-oksidan C. amada [13, 29] yang mungkin bertanggungjawab terhadap kesan antimelanogenik sebatian terpencil. Dalam kajian ini, kami mengesan kesan perencatan sebatian terpencil pada sintesis melanin intraselular dan aktiviti tyrosinase yang disebabkan oleh -MSH. Oleh itu, sebatian terpencil kami boleh digunakan sebagai agen dalam kosmetik berfungsi untuk membangunkan rawatan pemutihan kulit yang berkesan.
Kesimpulan
Kami amat mencadangkan bahawa C. amada boleh memainkan peranan penting sebagai perencat tyrosinase yang berkesan. C. amada dan sebatian bioaktifnya boleh digunakan dalam industri kosmetik sebagai agen pemutih semula jadi, industri makanan sebagai agen antiperang, dan bidang perubatan untuk rawatan hiperpigmentasi. Walau bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan untuk menyiasat kesan anti-melanogenik sebatian terpencil dalam model haiwan.
Bahan dan kaedah
Bahan kimia
Tyrosinase daripada cendawan dan arbutin telah dibeli daripada Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). L-Tyrosine adalah daripada Wako pure chemical industries Ltd. (Osaka, Jepun). Metanol (MeOH), etil asetat (EtOAc), dan n-heksana telah dibeli daripada Nacalai Tesque (Kyoto, Jepun). Gel silika (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokyo, Jepun) dan MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Jerman) telah dibeli.
Penyediaan bahan tumbuhan Empat spesies kunyit yang berbeza iaitu C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada, dan C. zedoaria telah ditanam di ladang tanah kelabu (pasir kasar 3.6 peratus , pasir halus 30.9 peratus , kelodak 24.3 peratus , tanah liat 32.8 peratus , pH 7.4, NO{{10}}N 0.07 peratus , NH4-N 0.08 peratus , P 4.6 ng/g, K 42.9 ng/g) pada Pusat Sains Lapangan Subtropika, Universiti Ryukyus, Okinawa, Jepun. Purata suhu bulanan, kelembapan dan pemendakan semasa tempoh penanaman adalah masing-masing 17–29 darjah , 61–83 peratus , dan 22–369 mm. Amalan agronomi biasa termasuk baja dan pengairan telah disediakan. Rimpang dituai apabila semua pucuk spesies layu sepenuhnya. Rizom dibasuh, dihiris, dan dikeringkan dalam ketuhar udara panas pada suhu 50 darjah selama 72 jam.
Pengekstrakan sampel
Pengekstrakan dijalankan dengan melarutkan serbuk kunyit yang berbeza (300 g) ke dalam MeOH (3 L) pada suhu bilik (25 darjah ) dan tekanan atmosfera dan disimpan selama dua hari dengan kacau magnet berterusan untuk mengelakkan pengoksidaan oleh udara dan melindungi daripada cahaya matahari. Sebatian larut pelarut ditapis menggunakan kertas penapis (No. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Jepun). Pelarut segar (MeOH) telah ditambah kepada bahan tumbuhan terpakai dan proses diulang tiga kali. Larutan yang ditapis yang mengandungi sebatian tumbuhan telah dikeringkan oleh penyejat berputar di bawah tekanan yang dikurangkan pada 40 darjah. Hasil semua ekstrak disimpan di dalam peti sejuk pada 4 darjah untuk analisis eksperimen.
Ujian perencatan tyrosinase
Aktiviti perencatan tyrosinase telah ditentukan mengikut kaedah sebelumnya [30], mengukur kepekatan krom DOPA yang dihasilkan oleh tindakan enzim tyrosinase pada substrat tyrosine. Secara ringkas, sampel ujian telah dibubarkan dalam 80 peratus MeOH untuk mendapatkan kepekatan yang berbeza (25, 50, dan 100 µg/mL). Plat telaga 96-disiapkan mengikut susunan berikut: 120 μL penimbal fosfat (20 mM, pH 6.8), 20 μL sampel dan 20 μL cendawan tyrosinase (500 U/mL dalam 20 mM fosfat penampan). Selepas pengeraman selama 15 minit pada 25 darjah, tindak balas dimulakan dengan menambah 20 μL larutan L-tirosin 0.85 mM dan kemudian diinkubasi selama 10 minit pada 25 darjah. Aktiviti tyrosinase ditentukan dengan mengukur penyerapan pada 470 nm menggunakan pembaca plat mikro (spektrofotometer Biotek Powerwave XS2). Arbutin digunakan sebagai kawalan positif, manakala 80 peratus MeOH digunakan sebagai kawalan negatif. Peratusan perencatan tyrosinase dikira seperti berikut:
di mana C ialah penyerapan kawalan negatif, B ialah penyerapan kosong, dan S ialah penyerapan sampel ujian.
Pengasingan sebatian bioaktif daripada ekstrak mentah Curcuma amada
Memandangkan keputusan empat ekstrak kunyit, C. amada menunjukkan aktiviti anti-tirosinase yang jauh lebih tinggi daripada yang lain. Oleh itu, penulenan berpandukan bioassay bagi sebatian aktif daripada ekstrak mentah C. amada telah dilakukan. Untuk mengenal pasti sebatian anti-tirosinase, pecahan daripada ekstrak mentah C. amada telah dijalankan seperti yang diterangkan dalam Rajah 5. Ekstrak mentah telah dicairkan dengan air suling dan kemudian diekstrak dengan n-heksana, diikuti oleh EtOAc. Isipadu yang sama bagi setiap larutan pelarut dan ekstrak kasar kemudian dicampur dengan menggoncang selama 3 minit dalam corong pemisah. Semua pecahan telah ditumpukan kepada kekeringan oleh penyejat berputar pada 4{14}} darjah . Aktiviti anti-tirosinase ketiga-tiga pecahan ini ditentukan mengikut prosedur di atas. Oleh kerana pecahan EtOAc menunjukkan aktiviti anti-tirosinase tertinggi, ia dipilih untuk pengasingan dan penulenan sebatian bioaktif. Pecahan EtOAc aktif telah disejat kepada kekeringan dan tertakluk kepada kromatografi pada lajur silika gel (75 g) (30 × 3 cm). Elusi telah dijalankan menggunakan n-heksana dan EtOAc dengan peningkatan jumlah EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) , dan 0:100 (F6)]. Aktiviti anti-tirosinase enam pecahan ini telah dijalankan mengikut prosedur di atas, dan kebanyakan aktiviti ditemui dalam F3 dan F6. Pecahan F3 dan F6 telah ditulenkan oleh HPLC fasa terbalik C18 (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Jepun) yang dilengkapi dengan air dan asetonitril sebagai fasa mudah alih dengan kadar alir 2.5 mL min−1, dikesan pada 280 nm.
Tiga puncak daripada F3 dicairkan pada 9.55, 13.66 dan 16.47 min, dan empat puncak daripada F6 dicairkan pada 11.56, 12.20, 12.75 dan 15.03 min sebagai bahan putih tidak berwarna, yang menghalang aktiviti dikesan dalam lima pecahan puncak yang dielusikan pada 9.55 dan 16.47 min daripada F3 dan 11.56, 12.75, dan 15.03 min (Data Tambahan) daripada F6 (Rajah 5). Sebatian terpencil (~10} mg) telah dibubarkan dalam MeOH-d4 dan kemudian tertakluk kepada analisis spektrum. Spektrum resonans magnetik nuklear (NMR) telah direkodkan pada spektrometer BRUKER NMR (500 MHz untuk 1 H dan 125 MHz untuk 13C) pada suhu bilik. Anjakan kimia (δ) direkodkan sebagai bahagian per juta (ppm) berbanding tetrametilsilane (TMS) sebagai piawai dalaman. Eksperimen spektrometri jisim telah dijalankan pada Spektrometer Jisim Air menggunakan kuar pengionan elektrospray (ESI − MS) di bawah keadaan instrumental berikut: Lajur: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) mm. Pelarut A: Air (0.1 peratus asid formik), Pelarut B: asetonitril, kadar alir: 4 mL/min, isipadu suntikan: 100 µL, masa larian: 35 min, program masa untuk F3: 75 peratus B (0 min) → 75 peratus B (20 min) → 100 peratus B (20.1 min) → 100 peratus B (27 min) → 75 peratus B (27.1 min) → 75 peratus B (35 min). Program masa untuk F6: 45 peratus B (0 min) → 45 peratus B (14 min) → 100 peratus B (14.1 min) → 100 peratus B (20 min) → 45 peratus B (20.1 min) → 45 peratus B (25 min). Mod pam: Kecerunan binari. Butiran ketuhar: CTO-20AC, suhu 40 darjah . Mod pengionan MS: ES ( tambah ), voltan kapilari: 4.0 kV, voltan kon: 20 V, suhu sumber: 120 darjah , suhu penyoraian: 350 darjah , aliran gas kon: 100 L/j, aliran gas penyahlarutan: 800 L /h (Data Tambahan).
Aktiviti anti-tirosinase sebatian terpencil
Sebatian terpencil telah dilarutkan dalam MeOH pada kepekatan 5, 10, 30, 50, 100, dan 200 μM bagi setiap sebatian. Aktiviti anti-tirosinase ditentukan menggunakan prosedur yang diterangkan sebelum ini.
Perencatan intraselular tyrosinase dan melanogenesis oleh sebatian terpencil
Kultur sel
Sel melanoma B16F10 telah dibiakkan dalam medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS) yang tidak diaktifkan haba dan 1 peratus penisilin (10,000 U/mL)/streptomycin (100 ug/mL) pada 37 darjah dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2.
Daya maju sel
Sel B16F10 disalut pada ketumpatan 5 × 104 sel/telaga dalam 96-plat perigi. Selepas 24 jam, sel telah terdedah kepada pelbagai kepekatan sebatian terpencil dan diinkubasi selama 48 jam tambahan pada 37 darjah. Selepas pengeraman, daya maju sel ditentukan oleh ujian MTS. Dua puluh mikroliter larutan MTS telah ditambah dan diinkubasi selama 60 minit. Selepas pengeraman, penyerapan sel ditentukan pada 490 nm menggunakan pembaca plat mikro (Benchmark Plus).
Aktiviti anti-tirosinase dan anti-melanogenik sebatian terpencil
Penentuan kandungan melanin selular dan ujian aktiviti tyrosinase telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [31], dengan sedikit pengubahsuaian. Sel melanoma B16F10 disalut pada ketumpatan 5 × 104 sel/telaga dalam 96-plat perigi. Selepas 24 jam, sel telah terdedah kepada pelbagai kepekatan sebatian terpencil atau arbutin. Selepas 1 jam, 100 nM -melanocyte-stimulating hormone (-MSH) telah ditambah, dan sel-sel diinkubasi selama 48 jam tambahan pada 37 darjah. Untuk kajian aktiviti anti-tirosinase, sel-sel kemudiannya dibasuh dengan penimbal fosfat ais sejuk dan dilisekan dengan penimbal fosfat (pH 6.8) yang mengandungi 1 peratus Triton-X (90 μL/telaga). Plat dibekukan pada -80 darjah selama 30 minit. Selepas pencairan dan pencampuran, 10 μL 1 peratus L-DOPA ditambah kepada setiap telaga. Selepas pengeraman pada 37 darjah selama 2 jam, penyerapan diukur pada 490 nm. Untuk ujian kandungan melanin, sel telah dibasuh dua kali dengan penimbal fosfat dan kemudian dibubarkan dalam 100 μL NaOH (1 N) yang mengandungi 10 peratus DMSO. Sampel diinkubasi pada 80 darjah selama 1 jam dan dicampur untuk melarutkan melanin. Ketumpatan optik homogenat bercampur diukur pada 490 nm.
Analisis statistik
Keputusan dinyatakan sebagai min ± SEM. Perbezaan statistik antara kedua-dua min telah dinilai oleh ujian-t Pelajar. Perbandingan berbilang dilakukan menggunakan analisis varians sehala diikuti dengan ujian Bonferroni. Perbezaan dianggap ketara pada P <>
Ini adalah produk anti-keletihan kami! Klik gambar untuk maklumat lanjut!
Rujukan
1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Agen hipopigmentasi: ulasan terkini tentang aspek biologi, kimia dan klinikal. Sel Pigmen Sel. 2006;19:550–71.
2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Perencat tyrosinase semulajadi dan sintetik sebagai agen antibrowning: Kemas kini. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.
3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, et al. Kinetik aktiviti perencatan tyrosinase menggunakan ekstrak daun vinifera Viti. Biomed Res Int. 2017:5232680.
4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Orto-kuinon reaktif yang dihasilkan oleh pengoksidaan tyrosinase-pemangkinan agen penyahpigmenan kulit monobenzon: gandingan diri dan tindak balas konjugasi tiol dan kemungkinan implikasi untuk melanosit ketoksikan. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.
5. Couteau C, Coiffard L. Gambaran keseluruhan agen pemutih kulit: ubat-ubatan dan produk kosmetik. Kosmetik. 2016;3:27.
6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Perbandingan paras merkuri dalam pelbagai tisu albino dan tikus berpigmen yang dirawat dengan dua jenama berbeza krim pencerah kulit merkuri. Biometal: Peranan Int J Met ion Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.
7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kunyit: perasa, kosmetik dan penawar. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.
8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Kesan kunyit (Curcuma longa) pada kesihatan kulit: kajian sistematik bukti klinikal. Phytother Res. 2016;30:1243–64.
9. Baliga MS, Katiyar SK. Chemoprevention fotokarsinogenesis oleh botani pemakanan terpilih. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.
10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Aktiviti antikulat pelbagai spesies dan strain kunyit (Curcuma spp.) terhadap Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.
11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, et al. Kelonggaran arteri serebral babi yang tidak bergantung kepada endothelium dan saluran kalsium oleh spesies dan strain kunyit yang berbeza. J Tradit Complement Med. 2018;9:297–303.
12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Pengasingan dan penjelasan struktur sebatian antikulat daripada Curcuma amada. Asian Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.
13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Aktiviti antioksidan pelbagai spesies dan jenis kunyit (Curcuma spp): Pengasingan sebatian aktif. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.
14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Tyrosinase aktiviti perencatan kurkuminoid daripada serbuk kunyit (Curcuma longa Linn.). J SWU Sci. 2008;24:125–39.
15. Giang PM, Anak PT. Pengasingan seskuiterpenoid daripada rizom Salisb aromatik Curcuma Vietnam. J Chem. 2000;38:96–9.
16. Asem SD, Laitonjan SW. Penyiasatan hubungan struktur-tak lineariti zederone daripada rizom Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.
17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et al. Prinsip analgesik dari Curcuma amada. J Ethnopharmacol. 2015;163:273–7.
18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Konstituen sitotoksik daripada rizom Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014;2014:321943.
19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Antiradang sesquiterpenes daripada Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.
20. Kikuzaki H, Nakatani N. Diarilheptanoid kitaran daripada rizom Zingiber officinale. Fitokimia. 1996;43:273–7.
21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes daripada Commiphora sphaerocarpa dan pezina yang berkaitan dengan mur sejati. Fitoterapia. 2002;73:48–55.
22. Joshi SC, Mathela CS. Aktiviti antioksida dan antibakteria minyak pati daun dan konstituennya furanodienone dan curzerenone daripada Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. bekas cangkuk. f. Pharmacogn Res. 2012;4:80–4.
23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Pengoptimuman keadaan GC-MS berdasarkan resolusi dan kestabilan analit untuk penentuan serentak sembilan seskuiterpenoid dalam tiga spesies rizom Curcuma. J Pharm Biomed Dubur. 2007;43:73–82.
24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienone menghalang percambahan dan kemandirian sel dengan menyekat isyarat ER dalam sel MCF{1}} kanser payudara manusia. J Sel Biokim. 2011;112:217–24.
25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, et al. Diarilheptanoid dan monoterpenoid daripada rizom Zingiber officinale: sifat antioksidan dan sitoprotektif. J Nat Prod. 2008;71:12–17.
26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Diarilheptanoid dan glukosida diarilheptanoid baharu daripada rizom Tacca chantrieri dan aktiviti sitotoksiknya. J Nat Prod. 2002;65:283–9.
27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Pengenalpastian juzuk antitumor dalam kurkuminoid daripada Curcuma longa L. berdasarkan hubungan komposisi-aktiviti. J Pharm Biomed Dubur. 2012;70:664–70.
28. Marrot L, Meunier JR. Kerosakan foto DNA kulit dan akibat biologinya. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.
29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Pengasingan dan pencirian sebatian antioksidan dan antibakteria daripada rizom mangga halia (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Teknologi Dubur Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.
30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antityrosinase dan aktiviti antibakteria ekstrak perikarp manggis. J Kesihatan Re. 2009;23:99–102.
31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein menghalang melanogenesis melalui pengaktifan laluan isyarat ERK. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.
