Kesan Anti-Melanogenik Ekstrak Etanolik Sorghum Bicolor Pada Melanogenesis Terinduksi IBMX dalam Sel Melanoma B16/F10

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo, dan Ho Jin Heo

Abstrak:Untuk menilai kemungkinan sebagai agen pemutih kulitSorghum bicolor(S. bicolor), ituantioksidanaktiviti dan kesan anti-melanogenik pada 3-isobutil-1-metilxanthine (IBMX) yang disebabkanmelanogenesisdalam sel melanoma B16/F10 telah disiasat. Keputusan jumlah kandungan fenolik (TPC) menunjukkan bahawa 60 peratus ekstrak etanol daripadaS. dwiwarna(ESB) mempunyai kandungan tertinggi berbanding ekstrak etanol lain.Antioksidanaktiviti telah dinilai menggunakan garam diamonium (ABTS)/1,1-difenil-2-pikril-hidrazil 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-asid sulfonat (DPPH) aktiviti penghapusan radikal dan kesan perencatan malondialdehid(MDA). Keputusan ini menunjukkan ESB mempunyai signifikanantioksidanaktiviti. Kesan perencatan terhadap tyrosinase juga dinilai menggunakan L-tirosin (nilai IC50=89.25 µg/mL) dan3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) sebagai substrat. Di samping itu, rawatan ESB secara berkesan menghalang pengeluaran melanin dalam sel melanoma B16/F10 yang disebabkan oleh IBMX. Untuk mengesahkan mekanisme kesan anti-melanogenik ESB, kami memeriksa protein berkaitan melanogenesis. ESB dikurangkanmelanogenesisdengan mengurangkan ekspresi faktor transkripsi berkaitan mikroftalmia (MITF), tyrosinase dan protein berkaitan tyrosinase (TRP)-1. Akhir sekali, 9-asid hidroksioctadecadienoic (9-HODE),1,3-O-dicaffeoylglycerol dan tricin sebagai sebatian utama ESB telah dianalisis menggunakan kromatografi cecair berprestasi ultra-pemisahan mobiliti ion-kuadrupol masa penerbangan/spektrometri jisim tandem (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Penemuan ini menunjukkan bahawa ESB mungkin mempunyai potensi fisiologi untuk digunakan sebagai bahan pemutihan kulit.

Kata kunci:anti-melanogenesis; sel melanoma B16/F10; asid hidroksioctadecadienoic;Sorghumbicolor; 3-isobutil-1-metilxanthine

Cistanche menghalang pembentukan melanin.

1. Pengenalan

Melanin dihasilkan melalui proses, dipanggilmelanogenesisdalam melanosom intraselular melanosit, dan pengeluaran dan pengedaran melanin menentukan warna kulit, mata dan rambut. Di samping itu, melanin memainkan peranan penting dalam melindungi kulit daripada pelbagai molekul dan rangsangan seperti sinaran ultraungu (UV), spesies oksigen reaktif (ROS), -hormon perangsang melanosit (-MSH), dan agen penaik adenosin monofosfat (cAMP) kitaran termasuk forskolin dan IBMX [1]. Khususnya, sinaran UV, secara langsung dan tidak langsung, merosakkan sel kulit melalui generasi ROS seperti radikal hidroksil, anion superoksida, dan hidrogen peroksida [2]. ROS yang dihasilkan menyebabkan DNA untai tunggal dan berganda pecah dan menyerang molekul struktur selular yang penting seperti protein dan lipid [2]. Oleh itu, melanin danantioksidanenzim seperti glutathione peroksidase, superoxide dismutase, dan katalase mengekalkan tahap malar dengan mengeluarkan ROS yang dihasilkan. Walau bagaimanapun, pengeluaran ROS yang berlebihan akibat pelbagai faktor mengaktifkan melanogenesis dalam kulit, dan pengumpulan melanin yang tidak normal menyebabkan kesan hiperpigmentasi negatif, menyebabkan bintik-bintik umur atau hati, bintik-bintik, dan bintik-bintik [3,4]. Pada masa ini, sebatian semulajadi seperti asid kojik, hidrokuinon, arbutin, dan asid askorbik, yang dikenali sebagai perencat sintesis melanin, sedang digunakan sebagai bahan tambahan agen pemutih kulit. Walau bagaimanapun, bahan-bahan ini bukan sahaja mempunyai penembusan yang lemah ke dalam kulit tetapi juga menyebabkan sitotoksisiti dan keradangan dengan pentadbiran jangka panjang [5]. Dalam hal ini, adalah perlu untuk membangunkan agen pemutih yang tidak merengsa dan berkesan untuk merawat hiperpigmentasi kulit manusia, serta mengkaji bahan sumber semula jadi untuk ini.

Sel-sel kulit manusia biasanya menghasilkan melanin sebagai tindak balas fotoproteksi. Melanogenesis ialah proses kompleks yang dikawal melalui pelbagai laluan isyarat, dan semua isyarat akhirnya mengimbangi MITF. Oleh kerana MITF yang diaktifkan menggalakkan ekspresi keluarga gen tyrosinase (tyrosinase dan TRPs),melanogenesisbermula dengan bersungguh-sungguh [6]. Secara amnya, langkah pertama dalam melanogenesis ialah tyrosinase memangkinkan pengoksidaan L-tirosin kepada 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), dan seterusnya mengoksidakan L-DOPA kepada DOPA kuinon. Dan kemudian TRP-2 menukar DOPA chrome kepada5,6-dihydroxyindole-2-asid karboksilik (DHICA) atau 5,6-dihydroxyindole (DHI). Akhirnya, DHICA dan DHI dioksidakan oleh TRP-1, akhirnya membawa kepada penghasilan melanin [6].

IBMX dan metilxantin lain merangsang melanogenesis dengan menghalang fosfodiesterase dan seterusnya meningkatkan tahap cAMP [7]. cAMP diaktifkan oleh IBMX memfosforilasi kinase terkawal isyarat ekstraselular (ERK) dan fosfoinositide 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) laluan isyarat dan akhirnya membawa kepada pengaktifan MITF dalam proses melanogenesis [7]. Oleh itu, penurunan regulasi protein ini boleh dianggap sebagai faktor penting untuk kesan anti-pemutihan.

Sorghum bicolor(S. bicolor), yang tergolong dalam keluarga Poaceae, dianggap sebagai tanaman kawasan tropika yang penting, termasuk Afrika, Amerika Tengah, dan kawasan gersang, dan merupakan tanaman bijirin terpenting keempat di dunia selepas gandum, beras, dan jagung [8]. ]. Kajian terkini menunjukkan bahawa S. bicoloris bermanfaat kepada manusia kerana ia mengandungi fitokimia seperti sebatian fenolik, tanin dan anthocyanin [9]. Fitokimia ini telah mendapat perhatian yang lebih tinggi kerana merekaantioksidan,anti-obesiti, anti-diabetes, dan kesan anti-radang [10–14]. Walaupun terdapat pelbagai hasil kajian, kajian mengenai kesan pemutihan kulit S. bicolor masih belum dijalankan. Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk menyiasat aktiviti antioksidan dan kesan anti-melanogenikS. dwiwarnadan untuk mengkaji kesannya terhadap IBMX yang disebabkanmelanogenesisdalam sel melanoma B16/F10.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Bahan kimia

Reagen Folin–Ciocalteu, L-DOPA, L-tirosin, L-asid askorbik, arbutin, acarbose, dimetilsulfoksida (DMSO), albumin serum lembu, -glukosidase, tirosinase cendawan, albumin serum lembu,3-(4,{ {6}}dimetil-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) dan IBMX telah dibeli daripada Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). MITF (bsm-51339M) dan tyrosinase (bs-0819R) telah dibeli daripada Bioss (Beijing, China). TRP-1 (sc-166857) dan -actin (sc-69879) telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Antibodi sekunder (anti-arnab dan anti-tikus) diperoleh daripada Teknologi Isyarat Sel (Danvers, MA, Amerika Syarikat).

2.2. Penyediaan Sampel

S. dwiwarna(20 g) telah diekstrak dengan pelbagai kepekatan etanol (0, 20, 40, 60, 80 dan 95 peratus ; 1L) pada 40 darjah selama 2 jam menggunakan pemeluwap refluks. Ekstrak telah ditapis menggunakan kertas penapis (WhatmanInternational Limited, Kent, UK) dan ditumpukan menggunakan penyejat vakum (N-1000; EYELA Co.,Tokyo, Jepun). Selepas ekstrak diliofilkan menggunakan pengering beku vakum (Il Shin Lab Co., Ltd.,Yangju, Korea), ekstrak kering disimpan pada -20 darjah sehingga digunakan.

2.3. Aktiviti Antioksidan In Vitro

2.3.1. Jumlah Kandungan Fenolik (TPC)

Jumlah kandungan fenolik telah diperiksa berdasarkan prinsip bahawa reagentis Folin-Ciocalteu dikurangkan kepada produk tindak balas biru di bawah keadaan alkali. Satu sampel (1 mL) dicampur dengan reagen Folin–Ciocalteu dan 7 peratus natrium karbonat. Campuran telah diaktifkan selama 2 jam, dan kemudian penyerapan diukur pada 760 nm menggunakan spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Jepun). TPC dikira daripada lengkung piawai asid gallik dan hasilnya dinyatakan sebagai mg GAE g−1.

2.3.2. Aktiviti Pemusnahan Radikal

Larutan kation radikal ABTS dihasilkan dengan mencampurkan 2.45 mM kalium persulfat dan 7 mMABTS dengan 10{{10}} mM penimbal kalium fosfat (pH 7.4) yang mengandungi 150 mM dan membenarkan mereka bertindak balas selama 24 jam pada suhu bilik. Larutan ABTS kemudiannya dicairkan dengan air suling untuk mendapatkan penyerapan 0.700 ± 0.020 pada 734 nm. Sampel dibenarkan bertindak balas dengan 980 µL ABTSsolution selama 10 minit pada 37 darjah dan kemudian penyerapan pada 734 nm diukur menggunakan spektrofotometer(UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Jepun).Penyelesaian radikal DPPH disediakan oleh melarutkan 0.1 mM DPPH dalam 80 peratus metanol. DPPHsolution telah dicairkan kepada penyerapan 1.000 ± 0.020 pada 517 nm. 50 µL sampel dicampur dengan 1.45 mL larutan DPPH dan bertindak balas selama 30 minit dalam gelap. Selepas bertindak balas, campuran ditentukan pada 517 nm.

2.3.3. Kesan Perencatan pada Peroksidasi Lipid

Untuk mengukur kesan perencatan pada peroksidasi lipid dalam tisu otak, kaedah bahan reaktif asid thiobarbituric (TBA) telah digunakan. Tisu otak dihomogenkan dalam penimbal 20 mM Tris-HCl (pH7.4) dan disentrifugasi pada 6000× g selama 20 minit. Supernatan telah ditambah kepada 0.1 mM L-asid askorbik dan 10 µM ferus sulfat 37 darjah selama 1 jam pengeraman. Seterusnya, 30 peratus asid trikloroasettik dan 1 peratus TBA ditambah ke dalam campuran, yang kemudiannya diinkubasi dalam mandi air pada suhu 80 darjah selama 20 minit. Kemudian, kompleks TBA-MDA diukur menggunakan spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Jepun) pada 532 nm.

2.4. Kesan Perencatan Tyrosinase

Kesan perencatan tyrosinase ditentukan menggunakan L-tirosin sebagai substrat. Satu sampel telah ditambahkan pada 96-plat perigi dan dicampur dengan 0.1 M natrium fosfat penimbal, tyrosinase dan 0.1 mML-tirosin substrat untuk bertindak balas pada 37 darjah . Selepas mengeram, aktiviti enzim diukur menggunakan microplatereader (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) pada 490 nm. Juga, L-DOPA digunakan sebagai substrat untuk mengukur aktiviti perencatan tyrosinase. Penampan natrium fosfat 67 mM, tirosinase dan substrat 10 mML-DOPA telah ditambah kepada sampel untuk bertindak balas pada 37 darjah selama 10 minit. Aktiviti tyrosinase diukur pada 415 nm.

Cistanche menghalang pembentukan melanin

2.5. -Kesan Perencatan Glukosidase

Kesan perencatan -glucosidase diukur dengan mencampurkan 0.1 M sodium phosphatebuffer dan -glucosidase pada 37 darjah selama 10 min. Selepas diaktifkan, campuran ditambah kepada 5 mM4-nitrophenyl- -D-glucopyranoside dalam penimbal pada 37 darjah selama 5 minit, dan kemudian penyerapan diukurpada 405 nm menggunakan pembaca plat mikro (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, Amerika Syarikat).

2.6. Ujian Daya Tahan Sel

Sitotoksisiti sampel dianggarkan menggunakan ujian MTT. Sel melanoma B16/F10 telah dikultur pada 1×104sel/telaga dalam 96-plat perigi selama 24 jam. Selepas itu, sampel dirawat dengan kepekatan 1, 2, 5 dan 10 µg/mL. Sampel dirawat selama 48 jam, selepas itu sel dirawat dengan 10 µg/mL larutan stok MTT selama 3 jam. Akhirnya, media telah dialih keluar, dan DMSO telah ditambah untuk melarutkan formazan. Jumlah formazan dikira menggunakan pembaca plat mikro (EPOCH2;BioTek, Winooski, VT, USA) pada 570 nm (panjang gelombang pengujaan) dan 655 nm (panjang gelombang pelepasan).

2.7. Pengukuran Kandungan Melanin Selular

Untuk mengukur jumlah melanin, sel melanoma B16/F10 dibiakkan dalam 24-plat perigi pada ketumpatan 4×104sel/telaga di atas selama 24 jam. Kemudian, sel-sel telah dirawat dengan 100 mM IBMX dan ESB atau kawalan positif (arbutin) untuk tambahan 48 jam. Selepas rawatan, sel-sel telah dibasuh dan dituai menggunakan garam penampan fosfat (PBS). Sel-sel yang dituai kemudiannya disentrifugasi pada 16,000 × g selama 10 minit, dan pelet yang diperoleh telah dilarutkan dengan 1 N natrium hidroksida yang mengandungi 10 peratus DMSO pada 90 darjah selama 20 minit. Kandungan melanin diukur pada 490 nm menggunakan pembaca plat mikro (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.8. Analisis Western Blot

Sel melanoma B16/F1{10}} yang telah dirawat telah dicuci dengan PBS dan dilisiskan menggunakan penimbal RIPA yang mengandungi 1 peratus perencat protease pada ais. Kepekatan protein ditentukan oleh ujian protein Bradford, dan protein yang sama telah didenaturasikan dengan penimbal Laemmli selama 10 minit pada 95 darjah. Protein yang didenaturasi telah dipisahkan oleh 10 peratus elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, Amerika Syarikat). Seterusnya, membran telah disekat dengan 5 peratus susu skim dalam garam Tris-buffered dengan 0.1 peratus Tween20 (TBST) selama 1 jam, dan kemudian bertindak balas dengan antibodi primer semalaman pada 4 darjah . Membran telah bertindak balas dengan antibodi sekunder selama 1 jam dan kompleks imun divisualisasikan menggunakan reagen chemiluminescence yang dipertingkatkan (Bionote, Hwaseong, Korea). Imej band dikesan dan dianalisis oleh Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat).

2.9. Analisis UPLC-IMS-QTOF/MS2

Sebatian utama dalam 60 peratus ekstrak etanol daripadaS. dwiwarnatelah dianalisis oleh UPLC-IMS QTOF/MS2(Vion, Waters Corp., Milford, MA, USA). Pemisahan kromatografi telah dijalankan menggunakan lajur Acquity UPLC BEH C18 (2.1 × 10{{10}} mm, saiz zarah 1.7 µm; Waters Corp.) pada kadar alir 0.35 mL/min. Fasa mudah alih terdiri daripada pelarut A (0.1 peratus asid formik dalam air suling) dan B (asetonitril), dan keadaan analisis termasuk kecerunan masa berikut: 1 peratus B pada 0–1 min, 1–100 peratus B pada 1–7 min, 100 peratus B pada 7–8 min, 100–1 peratus B pada 8–8.2 min, 1 peratus B pada 8.2–10 min. Spektrometri jisim telah dilakukan dalam mod negatif pengionan elektrospray (ESI) di bawah keadaan berikut: suhu sumber, 100 ◦C; suhu garisan pelarutan, 400 ◦C; tenaga perlanggaran tanjakan, 10–30 V; voltan kapilari, 2.5 kV. Sebatian fenolik dikesan melalui imbasan penuh antara m/z 50 hingga 1500.

2.10. Analisis statistik

Semua keputusan telah dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Perbezaan statistik antara kumpulan ditentukan oleh Analisis varians sehala (ANOVA) menggunakan ujian julat berganda Duncan (p < 0.05)="" dengan="" perisian="" sas="" versi="" 9.4="" (institut="" sas,="" cary,="" nc,="" usa)="" .dan="" perkaitan="">antioksidankesan (aktiviti penghapusan radikal ABTS/DPPH dan kesan perencatan MDA) dan kesan perencatanmelanogenesis-enzim pengantara (tirosinase dan -glukosidase) dinilai analisis korelasi Pearson.

3. Keputusan

3.1. Jumlah Kandungan Fenolik

Untuk membandingkanantioksidanaktiviti setiap ekstrak etanol daripadaS. dwiwarna, TPC telah disiasat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, TPC adalah berbeza antara ekstrak etanol; 60 peratus ekstrak etanol(150.08 ± 1.13 mg GAE/g) adalah jauh lebih tinggi daripada pengekstrakan lain (0 peratus ; 70.83 ± 1.18, 20 peratus ; 100.42 ± 0.72, 40 peratus ; 114.67 ± 1.46, 80 peratus ; 118.33 ± 3.17 dan 95 peratus ; 73.67 ± 1.46 mg GAE/g). Oleh itu, 60 peratus ekstrak etanol telah digunakan untuk analisis eksperimen selanjutnya.

3.2. Aktiviti Pemusnahan Radikal

Theantioksidanaktiviti ekstrak etanol 60 peratus daripadaS. dwiwarna(ESB) diukur menggunakan ujian ABTS/DPPH dan ujian MDA, dan hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 2. Aktiviti penghapusan radikal ABTS ESB ditunjukkan pada 97.98 peratus pada kepekatan 1000 ug/mL, dan vitamin C (99.82 peratus). , yang digunakan sebagai kawalan positif dan juga mempunyai aktiviti penghapusan radikal yang serupa pada kepekatan yang sama (Rajah 2A). Dan, ESB menunjukkan kesan perencatan 50 peratus (nilai IC50) radikal ABTS pada kepekatan 409.71 ug/mL. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2B, aktiviti penghapusan radikal DPPH ESB telah menunjukkan 79.44 peratus pada kepekatan 1000 ug/mL, dan nilai IC50 ditunjukkan pada 612.53 ug/mL. Kesan perencatan pengeluaran MDA ESB menunjukkan kesan perencatan sebanyak 89.54 peratus pada kepekatan 50 ug/mL dan menunjukkan kesan perencatan yang lebih tinggi daripada katekin (71.03 peratus ), iaitu kawalan positif, pada kepekatan yang sama (Rajah 2C). Di samping itu, nilai IC50 MDA diperhatikan pada kepekatan 16.56 ug/mL ESB.

3.3. Kesan Perencatan Enzim Pengantaraan Melanogenesis

Kesan perencatan daripadamelanogenesis-enzim pengantara dinilai menggunakan tyrosinase dan -glucosidase (Rajah 3). Untuk mengukur aktiviti perencatan tyrosinase terhadap sintesis melanin, eksperimen dilakukan menggunakan L-tirosin dan L-DOPA sebagai substrat dalam keadaan bebas sel. Akibatnya, nilai IC50 ialah 89.25 µg/mL apabila L -tirosin digunakan sebagai substrat (Rajah 3A), tetapi L-DOPA tidak dapat menunjukkan lebih daripada 50 peratus kesan perencatan diperhatikan (Rajah 3B). Pada masa ini, nilai IC50 bagi kawalan positif (arbutin) untuk L-tirosin ialah 74.35 µg/mL, iaitu lebih tinggi daripada ESB. ESB didapati mempunyai kesan perencatan yang lebih baik pada tyrosinase menggunakan L-tirosin daripada menggunakan L-DOPA sebagai substrat. Oleh itu, berdasarkan keputusan ujian menggunakan dua substrat, kesan perencatan tyrosinase ESB dianggap berkaitan dengan pengoksidaan L-tirosin kepada L-DOPA dan bukannya pengoksidaan L-DOPA kepada DOPA kuinon dalam melanogenesis. Kesan perencatan tyrosinase menggunakan L-DOPA sebagai substrat dan aktiviti penghapusan radikal (ABTS; 0.943, p < 0.05,="" dpph;="" 0.952,="" p="">< 0.05)="" menunjukkan="" korelasi="" kuat="" positif="" dalam="" jadual="">

Untuk mengukur kesan perencatan daripadamelanogenesis-enzim pengantara, aktiviti perencatan terhadap -glukosidase ESB diukur. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3C, ESB menghalang -glucosidase sebanyak 33.72 peratus pada kepekatan200 µg/mL. Dan IC50 ESB ialah 46.29 µg/mL, iaitu kira-kira lima kali lebih tinggi daripada acarbose (216.05 µg/mL). Keputusan ini menunjukkan bahawa ESB mempunyai aktiviti perencatan -glukosidase yang lebih baik daripada acarbose sebagai kawalan positif. Kesan perencatan -glucosidase menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan kesan perencatan MDA (0.966, p <0.05) dalam="" jadual="">

3.4. Daya Tahan Sel dan Sintesis Melanin Selular

Untuk mengesahkan sitotoksisiti ESB, sel melanoma B16/F10 dirawat dengan ESB selama 24 jam pada kepekatan 1, 2, 5, 10 dan 20 µg/mL. Keputusan menunjukkan bahawa ESB tidak menjejaskan daya maju sel pada kepekatan yang ditunjukkan jika dibandingkan dengan kawalan (Rajah 4A). Oleh itu, eksperimen telah dijalankan dengan memilih kepekatan 2, 5 dan 10 µg/mL. Selepas itu, sel melanoma B16/F10 telah dirawat dengan IBMX untuk menganalisis kesan ESB pada pengeluaran melanin. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4B, tahap kandungan melanin meningkat kepada 316.85 peratus apabila dirawat dengan IBMX. Sebaliknya, kumpulan ESBtreated (108.60 peratus ) pada kepekatan 10 µg/mL menunjukkan kandungan melanin menurun dengan ketara berbanding kumpulan yang dirawat IBMX, dan kandungan melanin yang serupa berbanding kumpulan arbutin (101.79 peratus ) sebagai kawalan positif.

3.5. Laluan Melanogenesis dalam Sel Melanoma B16/F10

Melanogenesisadalah proses penting untuk melindungi kulit manusia daripada rangsangan luar, dan proses ini dikawal oleh pelbagai mekanisme. Dalam kajian ini, kami mengukur tahap ekspresi molekul pengawalan melanogenesis untuk mengesahkan mekanisme perencatan potensi pengeluaran melanin yang disebabkan oleh ESB onIBMX dalam sel melanoma B16/F10 (Rajah 5). Keputusan menunjukkan bahawa ESB secara berkesan menurunkan ekspresi MITF yang disebabkan oleh IBMX (Rajah 5A, B). Oleh itu, ungkapan tyrosinase(Rajah 5A, C) dan TRP-1 (Rajah 5A, D) telah dikurangkan oleh MITF yang dikurangkan dengan rawatan ESB. Akibatnya, rawatan ESB mengecilkan ekspresi protein yang berkaitan dalam melanogenesis yang disebabkan oleh IBMX dalam sel melanoma B16/F10.

3.6. Analisis UPLC-IMS-QTOF/MS2

Profil sebatian utama ESB telah diimbas oleh LC/MS dalam julat m/z 50–1500, dan kromatogram puncak asas ditunjukkan dalam Rajah 6. Pengenalpastian lanjut dan pencirian sebatian telah dilakukan berbanding dengan data literatur menggunakan MS2fragmentationdata (Jadual 2). Berdasarkan serpihan dalam literatur terdahulu, puncak 2 ialah 1-O-caffeoylglycerol(m/z 253.07, 179.03, 161.02 dan 135.04) [15]; puncak 3, dicaffeoylglycerides (m/z 415.10, 253.07, 179.03dan 135.04) [16]; puncak 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 dan 135.04) [16];puncak 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol, 2.310, 19.30, 19.00 dan 135.04) [17]; puncak 6,feruloyl-caffeoylglycerol (m/z 429.12, 253.07, 193.05, 161.02 dan 134.03) [18]; puncak 7, trisin (m/z 329.23,314.04, 299.01 dan 271.02) [19]; dan puncak 9, 9-asid hidroksioctadecadienoic (9-HODE) (m/z 295.22, 277.21dan 171.10) [20]. Antaranya, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (Rajah 6B), trisin (Rajah 6C) dan9-HODE (Rajah 6D) dikenal pasti sebagai sebatian utama.

kesan cistanche:anti pengoksidaan

4. Perbincangan

Melanogenesisdilaporkan disebabkan oleh peningkatan tekanan oksidatif daripada rangsangan luar. Tekanan oksidatif menyebabkan pengoksidaan DNA dan protein, peroksidasi lipid, dan peningkatan asid lemak tak tepu. Tekanan ini juga membawa kepada peningkatan sintesis melanin yang tidak perlu dalam melanosit pada kulit. Oleh itu, melanin berlebihan yang dihasilkan boleh menyebabkan pigmentasi, dan ia boleh menyebabkan kanser kulit. IBMXmerangsang melanogenesis dengan menghalang fosfodiesterase dan seterusnya meningkatkan tahap cAMP [7]. Apabila tahap cAMP dalam sel meningkat, ia menyebabkan pengaktifan laluan isyarat ERK dan PI3K/Akt yang menggalakkan penjanaan protein yang dikaitkan dengan melanogenesis. Oleh itu, kami menyiasat kesan pemutihan ESB pada melanogenesis yang disebabkan oleh IBMX dalam sel melanoma B16/F10.

Sebatian fenolik sebagai metabolit sekunder tumbuhan mempunyai sifat distabilkan oleh struktur resonans apabila ia bertindak balas dengan radikal [21]. Selain itu, sebatian fenolik bertindak sebagai faktor penting untuk aktiviti antioksidan seperti aktiviti penghapusan radikal ABTS/DPPH, dan perencat akta pembentukan pigmen kerana ia mempunyai struktur kimia seperti L-tirosin [22,23]. Ujian ABTS/DPPH adalah kaedah yang paling biasa dan paling mudah untuk menganggar secara in vitroantioksidanaktiviti. Dalam kajian ini, ESB telah menunjukkan aktiviti pemusnahan radikal TPC (Rajah 1) dan ABTS/DPPH yang tinggi (Rajah 2A, B). Terutamanya, ESB adalah lebih tinggi dalam aktiviti penghapusan radikal ABTS daripada aktiviti penghapusan radikal DPPH. Ujian DPPH digunakan untuk mengukur aktiviti penghapusan radikal sebatian hidrofobik, manakala ujian ABTS memungkinkan untuk mengukur aktiviti penghapusan radikal terhadap sebatian hidrofobik dan hidrofilik [24]. Oleh itu, telah disahkan bahawa aktiviti penghapusan radikal ESB lebih terjejas oleh sebatian hidrofilik.

Pendedahan sinaran UV menyebabkan penghasilan ROS dan mempunyai kesan langsung dan tidak langsung pada kulit. Khususnya, ROS mendorong peroksidasi lipid dengan menyerang asid lemak tak tepu, yang merupakan komponen membran sel [2]. Pengumpulan lipid peroksida membawa kepada pemusnahan sistem antioksidan kulit, menyebabkan pigmentasi, keradangan, dan penuaan [25]. Dalam kajian ini, ESB menunjukkan sangat baik menghalang peroksidasi lipid (Rajah 2C). Sebatian fenolik yang terkandung dalam tumbuhan semula jadi dilaporkan dikaitkan dengan aktiviti pemusnahan radikal [26]. Juga, Maresca et al. [27] melaporkan bahawa penyingkiran ROS dengan antioksidan adalah berkesan dalam menghalang biosintesis melanin. Satu kajian baru-baru ini melaporkan bahawa pecahan etil asetat dan aglikon daun Dendropanax morbifera boleh bertindak sebagai pelindung sel kulit dan antioksidan semulajadi dengan melindungi sel HaCaT daripada tekanan oksidatif [28]. Selain itu, rawatan dengan pecahan yang sama menunjukkan kesan anti-melanogenik yang lebih baik daripada arbutin, digunakan sebagai kawalan apositif, terhadap penjanaan melanin berlebihan yang disebabkan oleh -MSH dalam sel melanoma B16/F10 [28].

Beberapa mekanisme dikaitkan denganmelanogenesis, dan matlamat bersama untuk agen pemutih kulit ialah pengawalan tyrosinase, yang merupakan enzim penting dalam melanogenesis. Tyrosinase, enzim yang mengandungi kuprum, memangkinkan dua tindak balas dalam laluan ini: hidroksilasi L-tirosin kepadaL-DOPA dan pengoksidaan L-DOPA kepada DOPA kuinon [6]. Apabila terdedah kepada sejumlah besar UV atauROS, aktiviti tirosinase meningkat dan sintesis melanin juga meningkat. Oleh itu, keputusan mengukur kesan perencatan tyrosinase berhubung dengan sintesis melanin menunjukkan bahawa ESB didapati mempunyai kesan perencatan yang lebih baik pada tyrosinase menggunakan L-tirosin berbanding menggunakan L-DOPA sebagai substrat (Rajah 3A,B). Satu kajian baru-baru ini melaporkan korelasi antara TPC dan perencatan tyrosinase kerana sebatian fenolik mempunyai struktur kimia yang serupa dengan L-tirosin, substrat tyrosinase. Menurut Choi et al. [29], adalah diperhatikan bahawa kecekapan aktiviti penghapusan radikal bebas dan kesan perencatan tyrosinase meningkat berkadaran dengan masa penapaian Cheonggukjang, yang disebabkan oleh jumlah TPC meningkat dengan masa penapaian. Im & Lee [30] memerhatikan bahawa pecahan etil asetat 75 peratus ekstrak etanol daripada teras Taraxacum num mempunyai aktiviti antioksidan TPC dan antioksidan yang banyak, dan kesan perencatan tyrosinase adalah lebih baik daripada pecahan lain (heksana, kloroform, butanol, dan akueus).

Tirosinase, salah satu daripada glikoprotein, terglikosilasi apabila rantai polipeptida translokasi ke dalam retikulum teendoplasma. Pelbagai enzim terlibat dalam proses ini, dan antaranya, perencatan -glukosidase boleh menghalang lipatan tyrosinase untuk membentuk struktur tidak aktif tanpa kuprum. Akibatnya, tyrosinase tidak dapat diangkut ke melanosom dan menghalang pengeluaran melanin. Polifenol yang ada. dalam tumbuhan mampu bukan sahaja mengurangkan tekanan oksidatif, tetapi juga menghalang enzim penghidrolisis karbohidrat seperti -glukosidase dengan mengikat protein [31]. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa sel melanoma B16/F10 dengan kehadiran perencat glikosilasi mengakibatkan pengurangan melanogenesis dengan mengurangkan jumlah kandungan tyrosinase [32]. Dan Choi et al. [33] melaporkan bahawa deoxynojirimycin, salah satu perencat -glucosidase, menyekat glikosilasi tyrosinase dan menghalang penghijrahan tyrosinase ke melanosom. Ando et al. [34] telah menunjukkan bahawa adalah mungkin untuk menghalang sintesis melanin dalam sel melanoma dengan mengawal glikosilasi tirosinase oleh perencat -glucosidase seperti glutation, ferritin, dan geldanamycin. Kim et al. [35] melaporkan korelasi yang baik untuk Debunga Lebah sebagai semula jadiantioksidanantara TPC dan kesan perencatan tyrosinase ({{0}}.973,p < 0.05),="" dan="" juga="" tpc="" memberikan="" korelasi="" positif="" dengan="" aktiviti="" scavenging="" radikal="" dpph="" (0.897,="" p="">< 0.05).="" dan="" keputusan="" menunjukkan="" bahawa="" polifenol="" sebagai="" antioksidan="" semula="" jadi="" berpotensi="" berkesan="" untuk="" pemutihan="" kulit="" berdasarkan="" aktiviti="" antioksidan="" yang="" sangat="" baik.="" dalam="" kajian="" kami,="" kesan="" antioksidan="" esbin="" dalam="" proses="" menghalang="" tindakan="" tyrosinase="" telah="" ditunjukkan="" sangat="" berkorelasi="" melalui="" perencatan="" pengoksidaan="" l-dopa="" kepada="" dopa="" kuinon="" dan="" glikosilasi="" tyrosinase="" (jadual="" 1).="" atas="" sebab="" ini,="" antioksidan="" kesan="" esb="" mempunyai="" kesan="" ke="" atas="" kesan="" pemutihan="" kulit="" dengan="" menjejaskan="">melanogenesis-enzim pengantara.

antioksidan semulajadi: cistanche tubulosa

Laluan isyarat PKA adalah proses utama yang terlibat dalam melanogenesis, dan ini diaktifkan oleh IBMX, yang merupakan agen peningkatan cAMP. Laluan isyarat PKA boleh mengawal faktor transkripsi seperti MITF dan protein pengikat unsur responsif cAMP, yang terlibat dalam ekspresimelanogenesispengawal selia seperti tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2. Akibatnya, rawatan IBMX meningkatkan ekspresi MITF dan keluarga gen tyrosinase (tyrosinase dan TRP-1) melalui pengaktifan cAMP [7]. Park et al. [36] menunjukkan bahawa jumlah sintesis melanin daripada ekstrak etanol PapenfusiellaCuomo (65.17 ± 13.40 peratus ) pada kepekatan 40 µg/mL adalah serupa dengan asid kojik (72.30 ± 3.92 peratus ) sebagai kawalan positif, dan melaporkan bahawa ia menunjukkan potensi sebagai bahan pemutih semulajadi. Dalam kajian ini, ESB menunjukkan kesan perencatan yang berkesan terhadap sintesis melanin yang serupa dengan kawalan positif pada kepekatan rendah (Rajah 4). Selepas itu, untuk menilai kesan anti-melanogenik terperinci ESB, analisis blot barat dilakukan pada protein pengantara melanogenesis menggunakan sel B16/F10melanoma.

Akt, yang terlibat dalam pelbagai mekanisme, memainkan peranan penting dalam pelbagai proses selular seperti apoptosis, glukosa, dan metabolisme kulit. Khususnya, peningkatan cAMP oleh rawatan IBMX mengurangkan fosforilasi Akt dan pengaktifannya. Juga, Akt yang tidak diaktifkan mendorong pengaktifan GSK-3 , yang bermaksud bahawa fosforilasi tidak tercapai, iaitu tahap p-GSK-3 dikurangkan [7]. Menurut literatur terdahulu, bahagian udara Pueraria thunbergia menurunkan taraf MIF dengan mengaktifkan laluan isyarat Akt/GSK-3 dalam sel melanoma B16/F10 [37]. Juga, Huang etal. [38] menunjukkan bahawa [6]-sekolah mempromosikan ekspresi p-Akt dan menghalang isyarat melanogenesis dalam sel melanoma B16/F10. GSK yang diaktifkan-3 mengimbangi keluarga gen tyrosinase dengan memfosforilasiSer289 MITF, seterusnya menggalakkan melanogenesis. MITF ialah faktor transkripsi utama yang mengikat kepada promoter gen tyrosinase, dan ia seterusnya meningkatkan ekspresi enzim yang berkaitan dengan percambahan melanosit danmelanogenesis[7]. Apabila ekspresi tyrosinase digalakkan oleh MITF, ia seterusnya membawa kepada peningkatan dalam tahap TRP-1 dan TRP-2, dan akibatnya, enzim melanogenik ini menghasilkan melanin [6]. Tekanan oksidatif yang disebabkan oleh cahaya UV merangsang pigmentasi melanin dalam kulit. Oleh itu, aktiviti penghapusan radikal atau ROS adalah berkesan untuk menyekat pengeluaran melanin, dan polifenol dengan aktiviti antioksidan mungkin mempunyai kesan pemutihan yang sangat baik [38]. Choi et al. [39] menunjukkan bahawa batang buluh Korea (Phyllostachys nigra variety henosis) mengurangkan kawalan MITF pengantaraan PKA/CREB melalui penghapusan radikal ABTS/DPPH. Dan 70 peratus ekstrak etanol Nelumbo nucifera G. Leaf menghalang ekspresi MITF, tyrosinase dan TRP dengan aktiviti antioksidan seperti keupayaan pendermaan elektron dan perencatan xanthine oxidase [40]. Dalam eksperimen ini, ditunjukkan bahawa rawatan ESB mengurangkan ekspresi MITF dan keluarga gen tyrosinase (tyrosinase dan TRP-1), yang menggalakkan pengoksidaan DHICA kepada DHI dalam laluan melanogenesis (Rajah 5). Berdasarkan keputusan ini, ESB telah ditunjukkan untuk mengecilkan melanogenesis pengantara IBMX berdasarkan kelebihannyaantioksidankesan.

Berdasarkan literatur terdahulu, sebatian fenolik utama dalam ESB telah dikenalpasti bahawa1,3-O-di-caffeoyl gliserol (Rajah 6B), trisin (Rajah 6C) dan 9-HODE (Rajah 6D) [16 ,19,20]. Antaranya, 9-HODE, yang merupakan sebatian paling banyak dalam ESB, adalah salah satu metabolit asid linoleika dan menunjukkan kesan pemutihan pada kulit yang merengsa dengan menghalang tyrosinase [41]. Selain itu, tidak seperti sebatian alifatik yang lain, 9-HODE dilaporkan stabil dalam semua eksperimen pengoksidaan dan mempunyai kesan pemutihan pada kerosakan ROS [41]. Sementara itu, trisin (5,7-dihydroxy- 2-(4-hydroxy-3,5-di-methoxyphenyl)-4H-chromene{{24 }}satu) telah lama diiktiraf untuk kesan kesihatannya yang bermanfaat, seperti aktiviti antioksidan, antivirus, dan antitumor/antikanser [42–44]. Mu et al. [45] melaporkan bahawatricin mempamerkan kesan perencatan yang lebih baik pada aktiviti tyrosinase berbanding dengan arbutin sebagai kawalan positif. Selain itu, Meng et al. [46] melaporkan bahawa trisin yang diasingkan daripada ekstrak metanol barli hijau muda (Hordeum vulgare L.) menghalang biosintesis melanin dan aktiviti tyrosinase dalam sel B16/F10melanoma melalui kumpulan hidroksil pada kedudukan C-4' dan kumpulan metoksi pada C-3',5'kedudukan rangka trisin. Phenylpropanoid seperti 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglyceride, and 1,3-O-dicaffeoylglycerol ialah sebatian organik yang disintesis oleh tumbuhan daripada fenilalanin dan tirosin. Phenylpropanoid dan bentuk glikosilasinya dilaporkan sebagai antioksidan yang kuat sama ada dengan memusnahkan ROS secara langsung atau dengan bertindak sebagai pemusnah radikal peroksil rantai [47].

Asid p-Coumaric, yang mempunyai struktur kimia yang serupa dengan L-tirosin, bersaing dengan L-tirosin untuk tapak aktif pada tyrosinase [48]. Ia dikenali sebagai perencat tyrosinase yang kuat, dan dilaporkan bahawa kesan anti-melanogenesisnya lebih kuat daripada sebatian yang serupa secara struktur seperti cinnamicacid [48]. Di samping itu, An et al. [48] ​​melaporkan bahawa asid p-kuumarik, konstituen Sasa quelpaertensisNakai, menghalang aktiviti tyrosinase menggunakan L-DOPA sebagai substrat, dan mengurangkan pengeluaran melanin dalam sel melanoma B16/F10. Oleh itu, ESB boleh dianggap mempunyai kesan pemutihan yang sangat baik melalui asid p-kuumarik. Tambahan pula, spektrum MS 1-O-caffeoylglycerol dan 1-3-O-dicaffeoylglycerol menunjukkan corak pemecahan yang serupa pada m/z 179, 161 dan 135, dan serpihan ini dilaporkan sebagai residu asid kafeik. Mereka mempunyai spektrum UV yang serupa dengan derivatif asid kafeik dengan λmax pada kira-kira 326 nm, dan oleh itu dianggap sebagai terbitan asid kafeik [48]. Telah dilaporkan bahawa asid kafeik, terbitan pelbagai sebatian, adalah antioksidan yang kuat dalam vitro/in vivo, dan mengurangkan aktiviti styrosinase danmelanogenesisdalam sel melanoma B16/F10. Akibatnya, kesan anti-melanogenik ESB mungkin dianggap disebabkan olehantioksidandan bahan pemutih kulit seperti sebatian asalifatik dan fenolik.

kesan cistanche: anti-pengoksidaan

5. Kesimpulan

Untuk menilai kemungkinan sebagai agen pemutih kulitSorghum bicolor, antioksidan, dan kesan anti-melanogenik ESB pada melanogenesis yang disebabkan oleh IBMX telah dinilai dalam sel melanoma B16/F10. ESB mempamerkan ketaraantioksidanaktiviti dalam aktiviti penghapusan radikal ABTS/DPPH dan kesan perencatan MDA. ESB menghalang langkah pertamamelanogenesisdengan menghalang -glucosidasedan tyrosinase menggunakan L-tirosin dan L-DOPA sebagai substrat. Kesan anti-melanogenik ESB pada yang disebabkan olehIBMXmelanogenesistelah dinilai dalam sel melanoma B16/F10, dan keputusan menunjukkan bahawa ESB menghalang melanogenesis yang disebabkan oleh IBMX dalam sel melanoma B16/F10. Pengumpulan melanin telah dihalang oleh regulasi rendah ekspresi MITF dan keluarga gen tyrosinase (tyrosinase dan TRP-1) dalam melanogenesis yang disebabkan oleh IBMX. Sebatian utama ESB telah dianalisis sebagai1,3-O-di-caffeoyl gliserol, trisin dan 9-HODE. Akibatnya, ESB menunjukkan secara in vitroantioksidanaktiviti dan kesan anti-melanogenik dalam sel melanoma B16/F10, dan dengan itu, boleh digunakan sebagai agen pemutih kulit dalam pasaran kosmetik.

anti pengoksidaantablet cistanche