Prinsip Anti-Radang Daripada Jarum Pinus Taiwanensis Hayata Dan Dalam Kajian Siliko Mengenai Potensi Kesan Anti-Penuaan Mereka

Abstrak:Pinusteh jarum sangat popular di negara Timur seperti Jepun, Rusia, Korea, dan China. Teh jarum pain didakwa mempunyai signifikankesan anti-penuaan,tetapi tiada bukti jelas yang menyokong perkara ini sehingga kini. Dalam kajian ini, lima belas sebatian yang tidak diterangkan (1–5), serta tujuh puluh dua sebatian yang diketahui, telah ditulenkan dan dicirikan daripada pecahan bioaktif ekstrak metanol daripadaP. taiwanensisjarum.

Produk Cistanche Herba Anti-Penuaan Terbaik

Kebanyakan pencilan telah diperiksa untuk merekabioaktiviti anti-radangoleh model neutrofil selular dan enam sebatian (45, 47, 48, 49, 50, dan51) dipamerkan aperencatan yang ketara pada penjanaan anion superoksidadan pelepasan elastase dengan nilai IC50 antara 3.3± 0.9 hingga 8.3± 0.8 µM. Inibahan anti-radangtelah tertakluk kepada pengkomputeran dok untuk menilai pertalian mengikat mereka pada reseptor ghrelin, yang memainkan peranan penting dalam mengawal metabolisme, dengankesan anti-penuaan. sebatian49, 50, dan51 membentuk kompleks yang stabil dengan reseptor ghrelin melalui ikatan hidrogen dan pelbagai jenis interaksi.

1. Pengenalan

Pinusgenus (Pinaceae), yang terdiri daripada lebih daripada 100 spesies dan kebanyakannya diedarkan di Hemisfera Utara, secara amnya adalah pokok malar hijau manakala sesetengahnya adalah pokok renek [1]. Kayu pain adalah ringan dan sering digunakan untuk perabot. Walau bagaimanapun, pelbagai kesan farmakologi jarum pada pucuk pain telah direkodkan dalam buku-buku kuno perubatan tradisional Cina. Dalam "The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon", jarum pain menggalakkan pertumbuhan rambut, memanjangkan hayat dan menghilangkan dahaga. Dalam "Taiping Shenghui Fang", telah direkodkan bahawa jarum pain boleh dimasak dengan alkohol dan menunjukkan kesan anti-penuaan. Kini, jarum pain diproses sebagai teh dan popular di Asia. Di Korea, konstituen bagiP. densiflorateh jarum serta yangbioaktiviti antioksidan dan anti-bakteria telah disiasat secara meluas [2,3]. Sejak awal abad yang lalu, lebih daripada tujuh ratus sebatian telah dikenal pasti daripadaJarum Pinus. Kebanyakan literatur yang dilaporkan berkaitan dengan minyak patiP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8], danP. sylvestris[4,9]. Komponen bercirikanPinusJarum kebanyakannya benzenoid, diterpenoid, flavonoid, lignan, monoterpenoid, dan seskuiterpenoid [10]. Jarum daripadaP. densifloradanP. morrisonicolatelah dilaporkan untuk bioaktiviti antioksidan mereka [11–14]. Di samping itu, ekstrak etil asetat daripada jarumP. morrisonicolamenghalang ekspresi protein dan mRNA NO daniNOS dalam makrofaj RAW 264.7 yang disebabkan oleh LPS, mempamerkan bioaktiviti anti-radang yang ketara [13]. Ekstrak cecair superkritikal daripadaP. densiflorajarum menunjukkan kesan perencatan pada pengeluaran NO yang disebabkan oleh LPS dengan merendahkan ekspresiiNOS dan mengurangkan ungkapan IL-6 dan IL-1 dan pengaktifan protein STAT1 dan STAT3 dalam makrofaj yang disebabkan oleh LPS [15]. Ekstrak etanol daripadaP. thunbergiijarum menunjukkan kesan anti-radang yang ketara dalam makrofaj dan menekan edema telinga yang disebabkan oleh asid arakidonik dan menghalang aktiviti enzimatik myeloperoxidase [16]. Lebih-lebih lagi, yang ditapaiP. morrisonicolajarum menunjukkan bioaktiviti antioksidan dan anti-radang yang sangat baik dengan memodulasi NF-κLaluan isyarat B [17]. 

Ghrelin ialah hormon peptida yang terdiri daripada dua puluh lapan asid amino dan pada asalnya ditemui dalam perut [18,19]. Ia adalah ligan endogen untuk secretagogue hormon pertumbuhan (GHSR), yang merupakan ahli -cawangan dalam kelas A GPCRs (G Protein Coupled Receptors) [18,19]. Ghrelin adalah satu-satunya hormon peptida yang menyebabkan rasa lapar untuk menggalakkan selera makan [20]. Banyak kajian telah mencadangkan bahawa ghrelin memainkan peranan penting dalam mengawal metabolisme, keseimbangan tenaga, ingatan, kardiovaskular, dan fungsi gastrousus dalam tubuh manusia.21–23]. Ghrelin juga terlibat dalam pelbagai mekanisme fisiologi dan patofisiologi dalam tubuh manusia seperti penuaan [24,25], dan ia mungkin berkaitan dengan aktiviti anti-radang [26,27]. Pada tahun 2014, glikosida tetra flflavonoid berasilat unik bernama teaghrelins, pertama kali dikenal pasti dalam teh oolong Chin-shin oleh kumpulan kami dan menunjukkan aktiviti menggalakkannya dalam pelepasan hormon pertumbuhan (GH) [28]. Dua lagi sebatian serupa telah disucikan dalam teh oolong Shy-jih-chuen dan bioaktivitinya pada reseptor ghrelin juga telah disahkan [29]. Empat teaghrelin menyebabkan kelaparan melalui laluan kawal selia yang sama seperti ghrelin. Tidak terhad kepada teh, sebatian dengan struktur atau bioaktiviti yang serupa dengan teaghrelin juga telah diterokai dalamPolygonum multiflflorum(Hes houwu) [30], Ginkgo biloba[31], Morus alba[32], danCistanche tubulosa [33]. Keputusan ini menyokong kami dalam mencari prinsip anti-penuaan semula jadi dengan menyaring sebatian seperti ghrelin teh yang mempunyai kesan anti-radang. Selain melaksanakan aktiviti penggalak secara langsung dalam pembebasan hormon pertumbuhan dalam model selular, pemodelan molekul beberapa sebatian berpotensi akan menjadi lebih cekap dalam meneroka kemungkinan calon [34]. Kaedah pengiraan telah digunakan untuk pembangunan dan penilaian hipotesis farmakologi. Docking molekul adalah salah satu teknik yang paling biasa digunakan dan menjangkakan konformasi dan pertalian ligan yang mengikat pada poket aktif dengan ketepatan yang tinggi [35,36]. Kaedah dok secara berkesan mencari ruang berdimensi tinggi untuk kemungkinan interaksi dan menggunakan fungsi pemarkahan yang menyusun calon dengan betul [37]. 

Pada tahun 2018, tiga sebatian telah disucikan daripada jarumP. morrisonicoladan mempamerkan aktiviti vasorelaxant yang ketara, dan di antara juzuk ini, satu dilaporkan dengan struktur seperti ghrelin teh [38]. Di Taiwan,P. taiwanensisjarum biasanya dikeringkan dan dibakar dan kemudian diproses sebagai teh kerana bioaktivitinya yang terkenal.P. taiwanensisHayata adalah salah satu spesies asli dan endemik di Taiwan. Ia juga dipanggil pain merah Taiwan, atau pain huangshan. Terdapat dua jarum dalam fascicle dengan panjang 8–11 cm dan sedikit kaku dan lurus, dan ia tumbuh merentasi seluruh pulau dari altitud rendah ke tinggi dan sering membentuk hutan tulen [39]. Dalam pemeriksaan awal, lapisan etil asetat ekstrak metanol daripadaP. taiwanensisjarum menunjukkan perencatan yang ketara pada penjanaan anion superoksida dan pelepasan elastase dengan IC50 nilai 0.8± {{0}}.2 dan 1.0± 0.1 µg/mL, masing-masing (Jadual S1). Oleh itu, dalam kajian ini, juzuk bioaktif daripadaP. taiwanensisjarum telah disiasat dan sebatian yang telah dimurnikan telah dinilai untuk anti-radangnya bioaktiviti pada model neutrofil selular. Selain itu, pengasingan daripadaP. taiwanensisjarum dengan bioaktiviti anti-radang tertakluk kepada pengkomputeran dok dandisiasat untuk interaksi mereka dengan reseptor ghrelin.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Prosedur Eksperimen Am

spektrum ultraviolet (UV) diperolehi oleh Hitachi U-2001 UV/V ialah spektrometer. TheSpektrum inframerah (IR) telah diperiksa dengan spektrofotometer Jasco FT/IR-4100.1H-, 13C-, dan spektrum resonans magnetik nuklear (NMR) 2D telah direkodkan pada Bruker AV-400Spektrometer NMR. Peralihan kimia ditunjukkan dalamδ nilai (ppm) dengan tetrametilsilanesebagai standard dalaman. TheδH danδC nilai adalah untuk peralihan kimia isyarat,masing-masing. Spektrometri jisim pengionan elektrospray resolusi tinggi (HR-ESI-MS) ialahdijalankan dengan spektrometer JEOL JMS-700 (dikendalikan dalam mod ion negatif).

2.2. Bahan Tumbuhan

Jarum daripadaP. taiwanensistelah dikumpulkan di Puli, Nantou, Taiwan dan dikenal pastioleh Prof. Sheng-Yang Wang (Jabatan Perhutanan, Universiti Chung-Hsing Kebangsaan,Taichung, Taiwan). Spesimen baucar (PCKuo_2016003) telah disimpan di dalam herbaium Pusat Pengajian Farmasi, Universiti Cheng Kung Kebangsaan, Tainan, Taiwan.

2.3. Pengekstrakan dan Pengasingan

2.4. Data Spektrum dan Fizikal 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Dihidroksi-70 -(4-hidroksi-3-methoxyphenyl)propan-80 -yloxy]-2-Asid hidroksibenzoik (2)sirap tidak berwarna; [ ]25 D tambah 5.3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmaks(logε) 284 (3.59), 253 (3.80) nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λmaks(∆ε) 248 ( tambah 1.33), 224 ( tambah 1.03),214( tambah 1.10) nm; IR (kemas)νmaks3425, 2927, 1541, 1384, 1271 sm−1;1H dan13C NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− calcd untuk C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Asid Hidroksiagatik (3)

Serbuk tidak berwarna; mp: 263◦C (dis.); [ ]25 D tambah 30.8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmaks(logε) 225 (sh) (3.83) nm; IR (kemas)νmaks3450, 2937, 1648, 1252 cm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1.09 (1H, ddd,J = 13.6, 13.6, 3.6 Hz, H-3a), 1.21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2.08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, dd,J = 9.2, 2.8 Hz, H-12), 4.53 (1H, s, H-17a), 4.91 (1H, s, H-17b), 5.88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13.5 (CH3-20), 14.9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− calcd untuk C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Isopropil-3-oxocyclohex-1-ene-1-Asid karboksilik (4)

Kristal jadual tidak berwarna; mp: 235◦C (dis.); [ ]25 D tambah 28.6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λmaks(logε) 237 (sh) (3.40) nm; IR (kemas)νmaks3456, 2925, 1635, 1395 sm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0.88 (3H, d,J = 6.8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2.02 (1H, m, H-4b), 2.09 (1H, m, H-5), 2.31 (1H, hept,J = 6.8 Hz, H-8), 2.50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Hz, H-6a), 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 Hz, H-6b), 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1.2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27.1 (C-8), 53.7 (C-5), 128.7 (C-2), 160.6 (C-1), 174.8 (C-7), 205.7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− calcd untuk C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Asid Styraxinolic (5)

sirap tidak berwarna; UV (MeOH)λmaks(logε) 308 (2.89), 237 (sh) (3.37), 222 (sh) (3.70) nm;IR (kemas)νmaks3421, 2926, 1572, 1395, 1268 sm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1.82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6.8 Hz, H-8), 2.61 (2H, t,J {{0}}.0 Hz, H-7), 3.56 (2H, t,J = 6.8 Hz, H-9), 3.83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.31 (1H, d,J = 2.4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32.7 (C-7), 35.6 (C-8), 56.6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131.9 (C-5), 149.2 (C-3), 150.7 (C-2), 176.2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−calcd untuk C11H13O5, 225.0763).

2.5. Pemeriksaan Bioaktiviti Anti-Radang

2.5.1. Penyediaan Neutrofil Manusia

Kajian ini dijalankan dengan kelulusan Lembaga Kajian Institusi Hospital Memorial Chang Gung (LHDN No. 201800369A3). Sampel darah diambil daripada penderma manusia yang sihat (20 hingga 30 tahun), dan neutrofil telah diasingkan dan disucikan mengikut protokol yang diterangkan sebelum ini [40]. 

2.5.2. Penjanaan Anion Superoksida

Pengukuran Ujian untuk mengukur penjanaan anion superoksida adalah berdasarkan pengurangan ferricytochrome yang boleh dihalang SOD.c seperti yang diterangkan sebelum ini [40].

2.5.3. Ujian Pelepasan Elastase

Degranulasi butiran azurofilik ditentukan dengan mengukur pelepasan elastase seperti yang diterangkan sebelum ini [40]. 

2.5.4. Analisis Statistik Keputusan dinyatakan sebagai min± ralat piawai min (SEM). Pengiraan 50 peratus kepekatan perencatan (IC50) telah dilakukan menggunakan perisian PHARM/PCS v.4.2. Perbandingan statistik telah dibuat antara kumpulan menggunakan Student'st-ujian. Nilai daripadap < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Kajian Docking Molekul

Thedalam silicopenilaian telah dijalankan pada perisian AutoDock Vina [41]. Struktur kristal reseptor ghrelin telah dicirikan [42], dan a . Fail PDB telah dimuat turun daripada Protein Databank (PDB ID: 6KO5). Struktur 3D ligan telah dibina dalam program Chem3D. Tambahan hidrogen, pengukuran cas Gasteiger untuk atom protein, dan pemilihan kilasan fleksibel untuk ligan telah dijalankan oleh AutodockTools (ADT ver. 1.5.6). Saiz grid direka pada 18.5 Å× 18.5 Å × 18.5 Å dan pusat grid pada dimensi (masing-masing x, y, dan z): 9.7, –19.2, 14.6 telah ditentukan. Tenaga afiniti mengikat disediakan sebagai skor dok dan ditunjukkan dalam kcal/mol. Interaksi terbaik dianggap hanya pose yang mendapat markah tertinggi. Visualisasi interaksi dok terbaik dianalisis dalam klien Biovia Discovery Studio 2020 [43].