Kesan Anti-penuaan Piper Cambodianum P. Fourn. Ekstrak Pada Sel Fibroblast Dermal Manusia Normal Dan Penyembuhan Luka

latar belakang:

Penuaan kulitdikaitkan dengan faktor persekitaran seperti sinaran ultraungu, pencemaran udara, graviti, dan faktor genetik, yang semuanya boleh menyebabkan kulit berkedut. Laporan terdahulu mencadangkan bahawa pembaikan luka terjejas oleh proses penuaan dan strategi untuk memanipulasipenyembuhan luka yang berkaitan dengan usiaadalah perlu untuk merangsang pembaikan.Objektif: Beberapa ekstrak tumbuhan tradisional terkenal dengan sifat perlindungan dan penjagaan kulit.Ekstrak Cistanche Tubulosa(Ekstrak Cistanche), ahli Piperacecae ialah tumbuhan yang ditemui di Vietnam yang mungkin mempunyai sifat terapeutik. Oleh itu, kesan ekstrak batang dan daun Cistanche Extract terhadapproses penuaantelah disiasat secara in vitro dan in vivo.Kaedah: Ekstrak Ekstrak Cistanche yang dilarutkan dalam metanol telah disiasat menggunakan Western blotting, tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif masa nyata, sitometri aliran, dan ujian penyembuhan luka sel. Kami menilaikesan anti-penuaan Ekstrak Cistanchepada tikus menggunakan ujian penyembuhan luka. Keputusan dianalisis dengan ujian t tidak berpasangan Pelajar; *P,0.05 dan **P,0.01 masing-masing dianggap menunjukkan nilai yang ketara dan sangat ketara, berbanding dengan kawalan yang sepadan. Keputusan: Ekstrak Cistancherawatanditunjukkan secara in vitro dan in vivo aktiviti anti-penuaan. Analisis Western blot terhadap sel-sel fibroblas kulit manusia normal yang dirawat oleh Ekstrak Cistanche menunjukkan apeningkatan bergantung kepada dos dalam ekspresi gen matriks ekstraselularseperti kolagen dan elastin, tetapipenurunan ekspresi matriks gen metalloproteinase yang semakin tua-3. Tindak balas rantai polimerase kuantitatif menunjukkan bahawa sel yang dirawat Ekstrak Cistanche memaparkan peningkatan bergantung dos dalam tahap ekspresi RNA messenger bagi kolagen, elastin dan hyaluronan sintase-2 dan penurunan tahap ekspresi gen penuaan matriks metalloproteinase-1. Ekstrak CistancheRawatan anti-penuaanmembawa kepada penurunan pengeluaran spesies oksigen reaktif dalam sel yang tertakluk kepada penyinaran ultraungu. Tambahan pula, ekstrak Ekstrak Cistanche menunjukkan kesan penyembuhan luka yang positif pada tikus.Kesimpulan: Kajian ini menunjukkankesan anti-penuaan dan penyembuhan luka ekstrak Ekstrak Cistanche. Oleh itu, ekstrak Ekstrak Cistanchemewakili agen terapeutik baharu yang menjanjikan untuk rawatan anti-penuaan dan penyembuhan luka. 

Kata kunci:Ekstrak Cistanche, anti penuaan, penyembuhan luka, antioksidan, ROS, fibroblas kulit manusia biasa

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Maklumat Lanjut Mengenai Ekstrak Cistanche Untuk Dijual

pengenalan

Kulit manusia terdiri daripada tisu epidermis, dermis dan subkutan. Epidermis dipengaruhi secara negatif oleh faktor abiotik,1 dan penuaan melibatkan perubahan struktur, fungsi dan biokimia.2 Penuaan kulit dikaitkan dengan faktor persekitaran seperti sinaran ultraungu (UV), pencemaran udara, graviti, dan faktor genetik,3 kesemuanya yang boleh menyebabkan kulit berkedut.4,5 Spesies oksigen reaktif (ROS), termasuk radikal anion superoksida (⋅O2 −), hidrogen peroksida (H2 O2 ), radikal hidroksil (⋅OH), oksigen singlet (1 O2 ), lipid peroksida (LOOH), dan radikalnya (LOO⋅) terbentuk dalam kulit yang terdedah kepada UVA (320–400 nm) dan UVB (290–320 nm). Faktor-faktor ini mendorong penuaan kulit, fototoksikan, keradangan, pembentukan tumor malignan, dan pecahan membran sel.6–8 Beberapa ekstrak tumbuhan tradisional mempunyai kesan yang terkenal untuk perlindungan dan penjagaan kulit. Piper cambodianum P. Fourn. (Ekstrak Cistanche), ahli Piperacecae ialah tumbuhan yang ditemui di Vietnam yang mungkin mempunyai sifat terapeutik, kerana Piper betel Linn., yang tergolong dalam keluarga yang sama, digunakan dalam pelbagai rebusan untuk menyembuhkan luka, melecur, limfangitis, dan ekzema. Selain itu, jus dari daun Kammaru, yang merupakan pelbagai kumbang Piper, mempunyai keupayaan untuk menyembuhkan faringitis, sakit perut, dan bengkak. Akar dan buahnya terkenal untuk digunakan dalam rawatan malaria dan asma.9,10 Tindakan mekanistik dan fungsi farmaseutikal Ekstrak Cistanche dalam perlindungan kulit masih belum disiasat secara terperinci. Kajian ini menyiasat potensi kesan anti-penuaan dan penyembuhan luka dari ekstrak batang dan daun Ekstrak Cistanche dalam sel fibroblas kulit manusia (NHDF) normal dan model tetikus penyembuhan luka.

Bahan dan kaedah

Penyediaan ekstrak PFF

Ekstrak PFF disediakan oleh Institut Penyelidikan Biosains & Bioteknologi Korea (KRIBB). Bahan serbuk kering diekstrak dalam metil etanol 99.9 peratus selama 3 hari dengan SD-Ultrasonic Cleaner (Seoul, Korea Selatan) pada suhu 45 darjah selama 72 jam. Ekstrak ditapis dan dipekatkan pada 45 darjah (Rotary Evaporator, N-1000SWD-EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Bohemya, NY, USA) dan dikeringkan pada suhu 70 darjah selama 24 jam dengan putaran Modul 40 (Biotron Corporation, Alberta, Kanada). Ekstrak Cistanche yang diekstrak telah dicairkan dengan air tulen pada dos yang berbeza untuk setiap eksperimen.

Antibodi dan reagen

Antibodi berikut digunakan: anti-elastin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA), anti-matriks metalloproteinase (MMP)-3 (Santa Cruz), kinase dikawal isyarat anti-ekstraselular (ERK) (Santa Cruz), anti-kolagen (Abcam, Cambridge, UK), anti-actin (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA), anti-tumor necrosis factor receptor (TNFR)-1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), reseptor faktor pertumbuhan anti-epidermis (EGFR) (Thermo Fisher Scientific), anti-pp38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling Tech, Danvers, MA, USA), anti-c-Jun ( Santa Cruz), anti-p53 (Cell Signaling Tech), dan antibodi sekunder (anti-tikus atau anti-arnab) daripada Kombiotech (Seoul, Korea Selatan).

Kultur sel

Sel Fibroblas Dermal Primer Manusia Dewasa Normal (NHDF) telah dibeli daripada ATCC (PCS-201-012, Manassas, VA, Amerika Syarikat). Sel NHDF dikekalkan dalam kultur dalam Media Helang Modified Dulbecco (1:1) yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin dan 1 peratus antibiotik. Sel NHDF telah ditanam pada 37 darjah dalam CO2 5 peratus yang dilembapkan.

Analisis untuk daya maju sel

Sel NHDF disalut pada ketumpatan 1.0×104 sel/telaga dalam 96-plat kultur telaga untuk pelekatan lengkap pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2 selama 24 jam. Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat dengan Ekstrak Cistanche pada dos 1, 10, dan 50 µg/mL selama 24 jam. Medium kultur kemudiannya dikeluarkan, diikuti dengan pengeraman dengan 90 mL EXCyto (Lucigen Corporation, Middleton, WI, Amerika Syarikat) 10 μL pada 37 darjah selama 3 jam. Penyerapan diukur pada 450 nm (dirujuk 659 nm) dengan pembaca ujian imunosorben berkaitan enzim (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, Amerika Syarikat). Hasilnya dinyatakan sebagai daya maju sel relatif sel yang dirawat terhadap kawalan.

Ujian penyembuhan luka sel (ujian migrasi sel)

Untuk ujian penghijrahan sel, monolayers dicakar dengan teliti menggunakan hujung pipet 10 μL. Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat dengan Ekstrak Cistanche pada dos 1, 10, dan 50 mg/mL selama 24 jam dan kemudian kawasan yang cedera difoto.

Analisis melalui tindak balas rantai polimerase transkripsi terbalik kuantitatif masa nyata

Analisis tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (qRT-PCR) telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini.11,12 Jumlah RNA telah diekstrak daripada sampel sel NHDF menggunakan kit RNeasy (Qiagen NV, Venlo, Belanda). DNA pelengkap telah disintesis daripada jumlah RNA dengan SuperScript First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher Scientific) dan primer heksamer rawak. Pengukuran PCR masa nyata DNA pelengkap individu dilakukan menggunakan pewarna hijau SYBR untuk mengukur pembentukan DNA dupleks dengan sistem Thermo Fisher Scientific (StepOne Plus) dan dinormalkan kepada ekspresi gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenase. Primer dan probe yang digunakan dalam qRT-PCR masa nyata dijelaskan dalam Jadual 1.

Analisis Western blot

Analisis Western blot telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini. 13–15 sel NHDF dirawat dengan ekstrak Ekstrak Cistanche selama 24 jam, dibasuh dua kali dalam salin penimbal fosfat ais sejuk, dan dihomogenkan pada 4 darjah dalam penimbal lisis yang mengandungi 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 peratus Triton X{{10}}, 300 mM NaCl, 0.1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 0.1 mM natrium vanadat, 20 mM -gliserol fosfat, 2 mM dithiothreitol, 1 mM leupeptin, dan 10 mM p-nitrofenil fosfat. Homogenat telah disentrifugasi pada 15,000 × g selama 10 minit dan supernatan digunakan untuk analisis Western blot. Kepekatan protein lisat diukur dengan ujian protein albumin serum lembu, dan 50 ug lisat sel dipecahkan oleh 10 peratus gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida dan disapu pada membran polivinilidena difluorida. Selepas menyekat dengan 5 peratus susu skim Tris-buffered saline mengandungi 0.02 peratus Tween 20, membran telah disiasat dengan antibodi yang berkaitan dan divisualisasikan oleh chemiluminescence yang dipertingkatkan, mengikut arahan pengilang (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). Actin digunakan untuk kawalan pemuatan.

Jadual 1 Set primer untuk PCR masa nyata

analisis ROS

Sel NHDF disadur dan diinkubasi pada ketumpatan 1.0×106 sel/telaga dalam plat kultur enam perigi selama 24 jam. Keesokan harinya, sel-sel telah disinari UV pada 40 J selama 180 saat dengan UV Crosslinker (Vilber Loirmat, Eberhardzell, Jerman), tidak dirawat, dan dirawat dengan ekstrak Ekstrak Cistanche selama 24 jam. Sel kemudiannya dibasuh dan diwarnakan dengan 5 mM CM-H2 DCFDA (Thermo Fisher Scientific) dalam larutan garam seimbang Hank, diinkubasi pada 37 darjah selama 30 minit. Cytometer aliran FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) digunakan untuk mengukur aktiviti H2 O2, menggunakan penapis pelepasan 532 nm. Sekurang-kurangnya 10,000 sel telah dianalisis dalam setiap tiga percubaan bebas.

Rawatan penyembuhan luka dengan tikus

C57Bl/6 tikus jantan (7 minggu, n=3) daripada Syarikat Haiwan Jungang (Seoul, Korea) mula-mula dibius dan kawasan yang ditetapkan untuk mencederakan telah dicukur. Empat 0.25 cm2 (0.5×0.5 sm) luka eksisi dicipta pada kulit dorsal (kawalan negatif dan 1, 10, 50 µg/mL ekstrak Ekstrak Cistanche ). Rawatan kulit yang cedera dengan ekstrak Ekstrak Cistanche dilakukan dengan kapas selama 4 hari (sekali sehari). Tikus ditempatkan dalam sangkar tetikus standard dengan 12-kitaran jam terang/gelap. Protokol haiwan dalam kajian kami telah diluluskan oleh jawatankuasa penjagaan dan etika haiwan Universiti Kebangsaan Chungnam. Semua prosedur pengendalian haiwan telah dilakukan mengikut Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal Institut Kesihatan Kebangsaan Korea dan mengikut garis panduan Akta Kebajikan Haiwan.

Analisis statistik Kuantifikasi analisis blot Barat telah dijalankan menggunakan program ImageJ (NIH, Bethesda, MD, Amerika Syarikat). Data dibentangkan sebagai min ± SD. Hasilnya dianalisis oleh ujian-t tidak berpasangan Stu dent (perisian SPSS versi 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). *P,0.05 dianggap penting dan **P,0.01 adalah sangat signifikan berbanding dengan nilai kawalan yang sepadan.

Keputusan

Daya maju sel dan kesan penyembuhan luka ekstrak Ekstrak Cistanche dalam sel NHDF

Ekstrak Cistanche diekstrak daripada daun Kammaru (Rajah 1A). Sel NHDF dirawat dengan ekstrak Ekstrak Cistanche pada dos 1, 10 dan 50 µg/mL selama 24 jam. Sel yang dirawat dengan dos ekstrak Ekstrak Cistanche sebanyak 0, 10, dan 50 µg/mL tidak menunjukkan kesan ke atas daya maju sel berbanding sel kawalan yang tidak dirawat (Rajah 1B). Dalam ujian penyembuhan luka sel, lapisan tunggal sel konfluen telah cedera dengan menyebabkan calar dan kemudian dirawat dengan ekstrak Ekstrak Cistanche pada kepekatan dari 1 hingga 50 µg/mL selama 24 jam. Sel-sel yang dirawat Ekstrak Cistanche menunjukkan pembaikan yang dipertingkatkan pada kawasan yang tercalar dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 1C dan D).

Tahap ekspresi gen matriks ekstraselular dipertingkatkan dalam sel NHDF yang dirawat Ekstrak Cistanche

Kolagen ialah protein struktur utama yang terdapat dalam ruang ekstraselular pelbagai tisu penghubung pada haiwan.16 Elastin ialah protein tisu penghubung elastik yang membantu mengekalkan bentuk tisu selepas meregang atau mengecut dengan memastikan tisu kembali ke kedudukan asalnya. Hyaluronan atau asid hyaluronik (HA) ialah komponen matriks ekstraselular (ECM) yang terlibat dalam pelincir sendi dan mengisi ruang di mana sel boleh berhijrah. Semasa penyembuhan luka dan pembaikan tisu, HA menyediakan rangka kerja untuk fibroblas. HAS-2 ialah hyaluronan synthase (HAS) yang baru dikenal pasti. Selepas rawatan dengan pelbagai dos ekstrak Ekstrak Cistanche selama 24 jam, gen ECM seperti kolagen, elastin dan tahap ekspresi HAS-2 telah meningkat dengan ketara dalam cara yang bergantung kepada dos. MMP-1 yang dikodkan oleh gen MMP1 pada manusia dikenali sebagai kolagenase interstisial dan fibroblast.16–18 MMP terlibat dalam pecahan ECM dalam proses fisiologi normal dan pembentukan semula tisu, dan MMP-1 secara khusus pecah turun kolagen interstisial jenis I, II, dan III. Kami menunjukkan bahawa tahap RNA penghantar MMP{10}} telah menurun dengan ketara dalam sel yang dirawat Ekstrak Cistanche dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 2).

Rajah 1 Ujian daya maju sel dan penyembuhan luka. Nota: Daun dan gambar batang Ekstrak Cistanche. (A) Ekstrak Ekstrak Cistanche yang digunakan pada 1 dan 10 ug/mL tidak menunjukkan sitotoksisiti dalam ujian EXCyto menggunakan sel NHDF. (B) Ujian penyembuhan luka sel telah diimej 24 jam selepas menggaru monolayer sel dan dirawat dengan ekstrak Ekstrak Cistanche pada dos yang ditunjukkan. (C) Sebaik sahaja sel mencapai pertemuan, satu luka dibuat di tengah lapisan tunggal menggunakan hujung pipet 10 ml, dan sel-sel telah dirawat dengan kepekatan ekstrak Ekstrak Cistanche yang ditunjukkan. Selepas pengeraman 24-jam, gambar diambil pada pembesaran ×10 di bawah mikroskop. (D) Imej fotografi dari (C) dalam siri dos dianalisis untuk kawasan jurang. Keputusan dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai bagi tiga eksperimen bebas. **P,0.01. Singkatan: Conc, konsentrasi; NHDF, fibroblas kulit manusia biasa; Ekstrak Cistanche, Piper cambodianum P. Fourn.

Ekspresi protein ECM yang dipertingkatkan dalam sel NHDF yang dirawat Ekstrak Cistanche

Ekstrak protein daripada sel yang tidak dirawat atau Ekstrak Cistanche yang dirawat telah dianalisis dengan analisis Western blot. Sel-sel yang dirawat Ekstrak Cistanche menunjukkan peningkatan paras protein kolagen dan elastin berbanding dengan kawalan yang tidak dirawat (Rajah 3). Laluan isyarat ERK mengawal selia ekspresi gen kolagen jenis I dalam fibroblas manusia.17 Data kami menunjukkan bahawa tahap protein ERK telah dipertingkatkan dengan ketara, dan enzim kolagenase interstisial MMP-3 telah dikurangkan dengan ketara oleh ekstrak Ekstrak Cistanche dalam bergantung kepada dos. cara (Rajah 3). Tahap RNA utusan kolagen dan elastin dikaitkan dengan perubahan dalam tahap protein mereka. Keputusan ini mencadangkan bahawa kesan anti-penuaan Ekstrak Cistanche pada sel NHDF berkaitan dengan peraturan translasi dan transkrip molekul yang terlibat dalam ECM.

Rajah 2 tahap ekspresi gen ECM oleh q-PCR. Nota: RNA daripada sel yang tidak dirawat atau ekstrak Cistanche yang dirawat telah dianalisis oleh q-PCR masa nyata dengan (A) kolagen-, (B) elastin-, (C) hyaluronan synthase (HAS)-2, dan (D ) matriks metalloproteinase (MMP)-1-primer khusus. Keputusan dibentangkan sebagai min ± SD bagi tiga eksperimen bebas. *P,0.05, **P,0.01. Singkatan: Conc, konsentrasi; ECM, matriks ekstraselular; HAS, hyaluronan synthase; MMP, matriks metalloproteinase; mRNA, RNA messenger; NHDF, fibroblas kulit manusia biasa; Ekstrak Cistanche, Piper cambodianum P. Fourn.; q-PCR, tindak balas rantai polimerase kuantitatif; RNA, asid ribonukleik; SD, sisihan piawai.