Oligoglycosides Phenylethanoid Berasilat Dengan Aktiviti Hepatoprotektif Dari Tumbuhan Gurun Cistanche Tubulosa

untuk maklumat lanjut:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa et al

Abstrak

Ekstrak metanol daripada batang segarCistanche tubulosa(Orobanchaceae) didapati menunjukkan kesan hepatoprotektif terhadap kecederaan hati yang disebabkan oleh D-galactosamine (D-GalN)/lipopolysaccharide (LPS) pada tikus. Daripada ekstrak, tiga baruphenylethanoidoligoglycosides, kankanosides H1 (1), H2 (2), dan I(3), telah diasingkan bersama-sama dengan 16glikosida fenilethanoid(4–19) dan dua oligogula berasilat (20,21). Struktur 1–3 ditentukan berdasarkan sifat spektroskopi serta bukti kimia. Antara pencilan, echinacoside (4, IC50=10.2 lM), acteoside (5, 4.6 lM), isoacteoside (6,5.3 lM), 20-acetylacteoside (8, 4.8 lM), dan tubuloside A (10, 8.6 lM) menghalang kematian hepatosit yang disebabkan oleh D-GalN. Lima pencilan ini, 4 (31.1 lM), 5 (17.8 lM), 6 (22.7 lM), 8 (25.7 lM), dan 10 (23.2 lM), dan cistantubuloside B1 (11, 21.4 lM) turut mengurangkan TNF-a- sitotoksisiti teraruh dalam sel L929. Selain itu, juzuk utama (4-6) mempamerkan kesan hepatoprotektif in vivo pada dos 25-100 mg/kg, PO.

Klik untuk kesan sampingan cistanche dan produk Cistanche

1. Pengenalan

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) ialah tumbuhan parasit aperennial yang tumbuh pada akar Salvadora atau Spesies Calotropis, dan diedarkan di Afrika Utara, Arab, dan negara-negara Asia.2BatangCistanche tubulosaserta bantuan salsa dan Cistanche deserticolahave secara tradisional digunakan untuk rawatan mati pucuk, kemandulan, sakit pinggang, dan kelemahan badan serta sebagai agen penggalak peredaran darah.2,3 Sebelum ini, beberapaphenylethanoids, iridoid, monoterpenes, dan lignan telah diasingkan daripada Cina dan PakistanCistanche tubulosa.2,4–9 Dalam perjalanan kajian pencirian kami tentang juzuk bioaktif dalam perubatan semulajadi ini, kami sebelum ini melaporkan bahawa lima iridoid, kankanosides A–D dan kankanol, monoterpeneglycoside, kankanoside E, duaphenylethanoidoligoglycosides, kankanosides F dan G (23), dan gula oligo tesilat, kankanose(21), telah diasingkan daripada ekstrak metanol batang keringCistanche tubulosa.10,11 Selain itu, ekstrak metanol dan beberapa pencilan seperti echinacoside (4), acteoside (5), cistanoside F (20), 21, dan kankanoside F didapati menunjukkan kesan vasorelaxant, iaitu, kesan perencatan terhadap kontraksi yang disebabkan. oleh noradrenalin dalam aorta toraks tikus terpencil.11 Dalam kajian berterusan kami tentang juzuk dalam tumbuhan, ekstrak metanol daripada batang segartubul cistanche adalahdidapati menunjukkan kesan perlindungan pada kecederaan hati yang disebabkan oleh D-galactosamine (D-GalN)/lipopolysaccharide (LPS) pada tikus. Daripada ekstrak metanol, kami telah mengasingkan tiga baharuphenylethanoidoligoglycosides bernama kankanosides H1 (1), H2 (2), dan I (3) bersama-sama 16 phenylethanoid glycosides (4–19) dan dua oligosugar tesilat (20, 21). Kertas kerja ini membincangkan pengasingan dan penjelasan struktur baru iniphenylethanoidoligoglycosides (1–3). Keperluan struktur glikosida phenylethanoid untuk aktiviti hepatoprotektif juga dibincangkan (Rajah 1)

2. Keputusan dan perbincangan

2.1. Kesan perlindungan ekstrak metanol daripada batangCistanche tubulosapada kecederaan hati yang disebabkan oleh D-GalN / LPS pada tikus

Batang segarCistanche tubulosa(ditanam di Urumqi, Wilayah Xinjiang, China) telah diekstrak dengan metanol di bawah refluks toyield ekstrak metanol (8.36 peratus daripada batang segar). Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1, pada dos 250-500 mg/kg, PO, ekstrak metanol menunjukkan kesan perencatan pada peningkatan serum aspartate amino transaminase (sAST) dan alanine aminotransaminase (sALT), penanda kecederaan hati, yang disebabkan oleh D- GalN/LPS pada tikus.

2.2. Juzuk kimia daripada batangCistanche tubulosa

Ekstrak metanol daripada batang segarCistanche tubulosatelah tertakluk kepada kromatografi lajur Diaion HP-20 (H2O?MeOH) memberikan pecahan terlarut H2O- dan MeOH (masing-masing 5.63 peratus dan 2.73 peratus). Pecahan terlarut MeOH telah tertakluk kepada kromatografi SiO2 dan ODScolumn dan akhirnya HPLC untuk memberikan tigaphenylethanoidoligoglycosides, kankanosides H1 (1, 0.0008 peratus ), H2(2, 0.0001 peratus ), dan I (3, 0.0007 peratus ) bersama-sama dengan 16glikosida fenilethanoid, echinacoside2,11 (4, 0.45 peratus ), acteoside2,11 (5, 0.28 peratus ), isoacteoside2,11 (6, 0.0 41 peratus ), cis-acteoside12,13 (7, 0.0007 peratus ), 20-acetylacteoside2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 peratus ), decaffeoylacteoside14 (9, 0.0002 peratus ), bahagian tubulo A2,11 (10, 0.013 peratus ), cistantubulosides B19 (11, 0.0020 peratus ), B29 (12,0.0003 peratus ), arenarioside15 (13, 0.0006 peratus ), wiedemanninoside C16 (14,0.0008 peratus ), cistantubuloside A9 (15, 0.0009 peratus ), syringalide A 30-OaL rhamnopyranoside4 (16, 0.0017 peratus ), campneosides I17,18 (17,1 ) (17,0.8) (17,0.8 peratus) , 0.0005 peratus ), dan salidroside11 (19, 0.0027 peratus), dan dua oligogula berasilat, cistanoside F11 (20, 0.0004 peratus) dan kankanose11 (21, 0.0004 peratus).

2.3. Struktur kankanosides H1 (1), H2 (2), dan I (3)

Kankanoside H1 (1) diperolehi sebagai serbuk putih dengan putaran optik negatif (½a-24D-45.3 dalam MeOH). Spektrum IRnya menunjukkan jalur serapan pada 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70 dan 1040 cm 1 boleh dikaitkan dengan hidroksil, karbonil ester, fungsi eter, dan cincin aromatik. FABMSspektra ion positif dan negatif 1 menunjukkan puncak ion kuasimolekul pada m/z 835(M tambah Na) tambah dan m/z 811 (MH), masing-masing, dan formula molekul ditentukan sebagai C37H48O20 oleh resolusi tinggi positif- pengukuran FABMS ion. Spektrum 1H dan 13C NMR 1 (CD3OD, Jadual 2 dan 3), yang telah diberikan oleh pelbagai eksperimen NMR,19 menunjukkan isyarat yang boleh diserahkan kepada dua metilena [d 2.70(2H, m, H2-7), 3.66 , 4.07 (1H setiap satu, kedua-dua m, H2-8)], proton aromatik jenis ABC bergandingan orto dan meta [d 6.52 (1H, dd, J=1.8,7.8 Hz, H{ {50}}), 6.65 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 6.67 (1H, d, J=7.8 Hz,H{{62 }})], dua bD-glucopyranosyl moieties [d 4.29 (1H, d, J=7.8 Hz,terminal-Glc-H-1), 4.54 (1H, d, J {{76 }}.2 Hz, dalam-Glc-H-1)] dan bahagian aa-L-rhamnopyranosyl [d 1.06 (3H, d, J=6.0 Hz, Rha-H{{89 }}),4.80 (1H, br s, Rha-H-1)] bersama kumpulan asetil [d 1.98(3H, s)] dan kumpulan trans-p-kuumaroyl {trans-olefin [d 6.34,7.67 (1H setiap satu, kedua-duanya d, J=16.0 Hz, H-8 dan 7)] dan jenis proton aromatik A2B2-ortho-coupled [d 6.80, 7.46 (2H setiap satu , kedua-duanya d,J=8.7 Hz, H-3,5 dan 2,6)]}. Keterkaitan antara gugus oligoglikosida dan asil dalam 1 dicirikan oleh eksperimen HMBC, yang menunjukkan korelasi jarak jauh antara pasangan proton dan karbon berikut: dalam-Glc-H-1 dan C-8 (dC71.9 ); dalam-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, seperti dd)] dan asetil karbonilkarbon (dC 171.4); dalam-Glc-H-4 [d 5.08 (1H, dd, J=9.6, 9.6 Hz)]dan karbonil karbonil p-kuumaroy (dC 168.2); Rha-H{155}} dan dalam-Glc-C{158}} (dC 80.5); dan terminal-Glc-H-1 dan dalam-Glc-C-6 (dC69.3) (Gamb. 2). Akhir sekali, hidrolisis alkali 1 dengan 5 peratus kaliumhidroksida (KOH) membebaskan asid trans-p-kuumarik, yang telah dikenal pasti melalui analisis HPLC, bersama-sama dengan produk ternyahilasi. Produk terdeasilasi berturut-turut dirawat dengan asid hidroklorik (HCl) 1.0 M untuk membebaskan L-rhamnose dan D-glukosa, yang dikenal pasti melalui analisis HPLC menggunakan pengesan putaran optik.10,11 Oleh itu, struktur kankanoside H1 telah dijelaskan menjadi {{181 }}(3,4-dihidroksi fenil)etil OaL-rhamnopyranosyl-(1- 3)-[bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-asetil{{196 }}O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranoside (1).

Kankanoside H2 (2) telah diasingkan sebagai serbuk putih dengan putaran optik negatif (½a 25 D 52.4 dalam MeOH). Formula molekulnya C37H48O20 didapati sama dengan 1 dengan pengukuran FABMS ion positif resolusi tinggi. Sifat spektroskopi 2 sangat serupa dengan 1, kecuali isyarat disebabkan oleh kumpulan cis-p-coumaroyl [d 5.79, 6.95 (masing-masing 1H, kedua-duanya d, J=12.8 Hz, H{{ 22}} dan 7), 6.76, 7.73 (2H setiap satu, kedua-duanya d, J=8.7 Hz, H-3,5 dan 2,6)]. Tambahan pula, percubaan HMBC pada 2 juga mendedahkan mod korelasi jarak jauh yang serupa seperti yang dikesan untuk 1 antara pasangan proton dan karbon berikut: dalam-Glc-H-1 [d 4.51 (1H, d, J {{44) }}.8 Hz)] dan C-8 (dC 72.0); dalam-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, m)] dan karbonil karbonil asetil (dC 171.4); dalam-Glc-H-4 [d 4.98 (1H, dd, J=9.6, 9.7 Hz)] dan karbonil p-kuumaroyl (dC 166.7); Rha-H-1 [d 4.77 (1H, d, J=1.4 Hz, Rha-H-1)] dan dalam-Glc-C-3 (dC 80.7 ); dan terminal-Glc-H-1 [d 4.28 (1H, d, J=7.8 Hz)] dan dalam-Glc-C-6 (dC 69.4) (Gamb. 2) . Melalui kajian degradasi, 2 memberikan asid cis-p-kuumarik dan dua gula yang sama seperti yang diperoleh dalam kes 1. Akibatnya, struktur kankanoside H2 telah dijelaskan menjadi 2-(3,4- dihidroksi fenil)etil OaL-rhamnopyranosyl-(1-3)- [bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-coumaroyl- bD-glucopyranoside (2).

Kankanoside I (3) juga diasingkan sebagai serbuk putih dengan putaran optik negatif (½a- 25D-62.2 dalam MeOH). Formula molekulnya, C35H46O18, ditentukan oleh pengukuran FABMS dan HRFABMS positif dan negatif. Sifat spektroskopi 3(CD3OD, Jadual 2 dan 3) boleh ditindih pada sifat echinacoside (4), kecuali isyarat disebabkan oleh bahagian aglikon {{dua metilena {d 2.95 (2H, dd, J=7. 3, 7.8 Hz, H2-7), [3.79 (1H, m), 4.10 (1H,dt, J=16.9, 7.3 Hz), H{{32} }]}, proton aromatik monosubstitusi [d7.18 (1H, m, H-4), 7.26–7.28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Hidrolisis alkali 3 dengan asid trans-kafeik terbebas KOH 5 peratus, dan produk terdeasilasi dirawat secara berturut-turut dengan 1.0 M HCl untuk membebaskan L-rhamnose dan D-glukosa. Akhir sekali, keterkaitan kumpulan asil dan bahagian gula dalam 3 telah dijelaskan oleh eksperimen HMBC, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Berdasarkan bukti yang disebutkan di atas, struktur kankanoside I telah dijelaskan sebagai2-feniletil OaL- rhamnopyranosyl-(1-3)-[bD-glucopyrano-syl-(1-6)]-4-O-trans-caffeoyl-bD-glucopyranoside (3)

2.4. Kesan juzuk kimia daripada batang Cistanche tubulosa pada sitotoksisiti yang disebabkan oleh D-GalN dalam hepatosit tikus kultur primer

Kecederaan hati yang disebabkan oleh D-GalN/LPS diiktiraf untuk membangunkan tindak balas melalui imunologi.19 Kecederaan hati jenis ini dilaporkan berlaku dalam dua bentuk. Pertama, kepekaan terhadap TNF-a dengan pengurangan uridin trifosfat dalam hepatosit ditingkatkan oleh D-GalN. Kedua, mediator pro-radang, seperti NO dan TNF-a, dikeluarkan daripada makrofaj yang diaktifkan LPS (sel Kupffer). Apoptosis hepatosit oleh TNF-a dilaporkan mempunyai peranan penting dalam kecederaan hati yang disebabkan oleh D-GalN/LPS.20

Dalam kajian terdahulu kami tentang sebatian hepatoprotektif daripada ubat-ubatan semulajadi, kami melaporkan bahawa beberapa juzuk daripada Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia2 reticulata,31 hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 dan Piper chaba42,43 menunjukkan kesan hepatoprotektif yang disebabkan oleh injuri DLP/kecederaan hati pada tikus dan/atau platyphylla var. japonica, 29 Kesan perencatan pisum pada sitotoksisiti yang disebabkan oleh D-GalN dalam kultur primerdhepatosit. Oleh kerana ekstrak metanol daripada batangCistanche tubulosamenunjukkan kesan hepatoprotektif pada kecederaan hati akibat D-GalN/LPS pada tikus (vide ante), kesan perencatan juzuk pada sitotoksisiti akibat D-GalN dalam hepatosit tikus kultur primer telah diperiksa menggunakan 3-(4,{ {6}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 4,echinacoside (4, IC50=10.2 lM), acteoside (5, 4.6 lM), isoaceteoside(6, 5.3 lM), 20-acetylacteoside (8, 4.8 lM), tubulosida A (10,8.6 lM) dan B11 (22, 14.6 lM), dan kankanoside G11 (23, 14.8 lM) menunjukkan aktiviti yang kuat. Aktiviti mereka lebih besar daripada silybin komersial (38.8 lM),33–43 sebagai kawalan positif.44,45 Keperluan strukturglikosida fenilethanoid for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) aglikon yang mempunyai kumpulan 3,4-dihidroksi menunjukkan aktiviti yang lebih kuat daripada yang mempunyai 4-kumpulan hidroksi (6 > 23); (3) 60-bahagian ObD-glucopyranosyl mengurangkan aktiviti (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" 8-bahagian="" obd-glucopyranosyl="" yang="" mempunyai="" 40-kumpulan="" o-caffeoyl="" menunjukkan="" aktiviti="" yang="" lebih="" kuat="" daripada="" yang="" mempunyai="" 60-kumpulan="" o-caffeoyl="" (5="6," 8=""> 22 ); dan (5) pengenalan 20-O-asetilmoiety mengurangkan aktiviti (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, data tidak ditunjukkan).Oleh itu, sebatian ini didapati tidak menjejaskan pengeluaran berlebihan NO dan TNF-a daripada makrofaj yang diaktifkan LPS.

2.5. Kesan konstituen kimia pada TNF-a-inducedcytotoxicity dalam sel L929

Untuk menjelaskan kesan konstituen pada kepekaan hepatosit kepada TNF-a, penurunan daya maju sel L929 yang disebabkan oleh TNF-a, garisan sel TNF-a-sensitif, 48 telah diperiksa menggunakan ujian MTT. Tanpa sampel ujian, daya maju sel dikurangkan kepada ca. 60 peratus selepas pengeraman sel dengan 20 ng/mL TNF-a selama 44 jam berbanding kes tanpa TNF-a. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 5,echinacoside (4, IC50=31.1 lM), acteoside (5, 17.8 lM), isoaceteoside (6, 22.7 lM), 20-acetylacteoside (8, 25.7 lM), tubuloside A (10,23.2 lM), dan cistantubuloside B1 (11, 21.4 lM) menghalang penurunan daya maju sel, dan aktiviti mereka didapati lebih besar daripada piperine42,43 dan silybin. Keperluan struktur bagiglikosida fenilethanoid for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)];dan (5) pengenalan bahagian 20-O-asetil mengurangkan aktiviti(8 < 5,="" 22="">< 6).="" keperluan="" ini="" didapati="" sama="" dengan="" yang="" diperhatikan="" dalam="" bab="" sebelumnya="" mengenai="" kesan="" perencatan="" pada="" sitotoksisiti="" yang="" disebabkan="" oleh="" d-galn="" dalam="" hepatosit="" tikus="" kultur="">

Penemuan in vitro ini mencadangkan mekanisme tindakan berikut yang mungkin untuk kesan hepatoprotektif konstituen batangCistanche tubulosa: (i) penurunan sitotoksisiti akibat D-GalN (4–6, 8, 10, 22, dan 23), dan (ii) penurunan sitotoksisiti akibat TNF-a (4–6, 8, 10, dan 11) .

2.6. Kesan perlindungan echinacoside (4), acteoside (5), dan isoacteoside (6) terhadap kecederaan hati yang disebabkan oleh tikus D-GalN/LPS dan cara tindakannya

Akhirnya, kami mengkaji kesan pengetuaglikosida fenilethanoid, echinacoside (4), acteoside (5), dan isoacteoside (6) pada kecederaan hati yang disebabkan oleh D-GalN/LPS pada tikus. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 6 dan 4-6 dengan ketara menghalang peningkatan sAST dan sALT yang disebabkan oleh D-GalN / LPS pada tikus pada dos 25-100 mg / kg, PO. Sebaliknya, 4-6 tidak menjejaskan pengeluaran berlebihan TNF-a daripada makrofaj yang diaktifkan LPS. Tambahan pula, 4–6 menghalang kematian sel L929 dengan ketara yang disebabkan oleh TNF-a, menunjukkan penurunan sensitiviti sel L929 kepada TNF-a (vide ante). Penemuan ini mencadangkan bahawa 4–6 mengurangkan sensitiviti sel-sel ini kepada sitotoksisiti yang disebabkan oleh TNF-a. Banyak sebatian yang menghalang kematian sel yang disebabkan oleh D-GalN dan pengeluaran TNF-a telah dilaporkan,24,26,32 tetapi terdapat beberapa sebatian yang dilaporkan secara selektif mengurangkan sensitiviti hepatosit kepada TNF-a.42,43,49,50

Kesimpulannya, daripada batang segarCistanche tubulosa, tiga baruglikosida fenilethanoid, kankanosides H1 (1), H2 (2), dan I (3) bersama-sama dengan 16 diketahuiglikosida fenilethanoid(4–19) dan dua oligogula tesilat (20, 21) telah diasingkan. Keperluan struktur untuk kesan perlindungannya terhadap kecederaan hepatosit yang disebabkan oleh D-GalN, dan kesan sitoprotektif pada sel L929 yang disebabkan oleh TNF-a adalah seperti berikut; (1) bahagian aglikon adalah penting untuk aktiviti; (2) aglikon yang mempunyai kumpulan 3,4-dihidroksi menunjukkan aktiviti yang lebih kuat daripada yang mempunyai 4-kumpulan hidroksi;(3) bahagian 60-ObD-glucopyranosyl mengurangkan aktiviti; (4) 8-bahagian ObD-glucopyranosyl yang mempunyai 40-kumpulan O-caffeoyl menunjukkan aktiviti yang lebih kuat daripada yang mempunyai 60-kumpulan O-caffeoyl;dan (5) pengenalan {{27 }} Bahagian O-asetil mengurangkan aktiviti. Tambahan pula, prinsipalglikosida fenilethanoid, echinacoside(4), acteoside (5), dan isoacteoside (6), menghalang peningkatan insAST dan ALT pada dos 25-100 mg/kg PO dalam tikus yang dirawat D-GalN/LPS, dan kesan perencatan tersebut dicadangkan untuk bergantung kepada pengurangan sensitiviti hepatosit kepada TNF-a. Mekanisme tindakan terperinci daripadaglikosida fenilethanoidperlu dikaji lebih lanjut.

3. Eksperimen

3.1. Umum

Instrumen berikut digunakan untuk mendapatkan data spektrum dan fizikal: putaran khusus, polarimeter digital Horiba SEPA-300(l=5 cm); Spektrum UV, spektrometer UV Shimadzu-1600; Spektrum IR,Shimadzu FTIR-8100 spektrometer; Spektrum NMR 1H dan 13C, JEOLJNM-ECA600 (600 dan 150 MHz) dan JEOL JNM-ECS400 (400 dan100 HMz) spektrometer dengan tetrametilsilane sebagai piawai dalaman; FABMS dan FABMS resolusi tinggi, spektrometer jisim JEOL JMS-SX 102A; Pengesan HPLC, Shimadzu RID-10Indeks biasan, Shimadzu SPD-10UV–vis dan Shodex ATAU{19}} pengesan putaran optik. Lajur HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II dan pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4.6 mm id) dan (250 - 20 mm id) masing-masing digunakan untuk tujuan analisis dan persediaan.

Keadaan percubaan berikut digunakan untuk kromatografi: kromatografi lajur silika gel fasa normal (CC), gel silika 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 mesh, sfera, neutral ); CC silika gel fasa terbalik, Diaion HP-20 (NipponRensui) dan Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); TLC fasa biasa, plat TLC prasalut dengan gel silika 60F254 (Merck, 0.25 mm); TLC fasa terbalik, plat TLC prasalut dengan gel silika RP-18 F254S (Merck, 0.25 mm); HPTLC fasa terbalik, plat TLC prasalut dengan gel silika RP-18 WF254S(Merck, 0.25 mm), pengesanan dicapai dengan menyembur dengan 1 peratus Ce(SO4)2–10 peratus akueus H2SO4, diikuti dengan pemanasan .

3.2. Bahan tumbuhan

Batang segarCistanche tubulosayang ditanam di Urumqi, Wilayah Xinjiang, China telah dikumpulkan pada September 2007. Bahan tumbuhan telah dikenal pasti oleh salah seorang pengarang (MY). Baucar untuk bahan tumbuhan ada dalam fail di makmal kami.

3.3. Pengekstrakan dan pengasingan

Batang segarCistanche tubulosa(2.98 kg) dipotong halus dan diekstrak tiga kali dengan metanol di bawah refluks selama 3 jam. Penyejatan pelarut di bawah tekanan berkurangan menyediakan ekstrak metanol (249.1 g, 8.36 peratus ). Ekstrak metanol telah tertakluk kepada Diaion HP 20 CC (5.0 kg, H2O?MeOH) untuk memberikan pecahan terlarut H2O- dan MeOH(167.84 g, 5.63 peratus dan 81.21 g, 2.73 peratus , masing-masing). Pecahan tercair MeOH (61.00} g) tertakluk kepada gel silika fasa normal CC[1.8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] untuk memberikan tujuh pecahan [Fr. 1 (1.12 g), 2 (9.56 g), 3 (0.89 g), 4(10.69 g), 5 (8.84 g), 6 (12.52 g) dan 7 (4.60 g)]. Pecahan 2(9.56 g) dipisahkan oleh gel silika fasa terbalik CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?acetone] untuk memberikan lima pecahan[Fr. 2–1 (55.9 mg), 2–2 (4.48 g), 2–3 (3.42 g), 2–4 (1.16 g), dan 2–5(31.9 mg)]. Pecahan 2–3 (1.00 g) tertakluk kepada HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus AcOH akueus (7:93, v/ v)] untuk memberikan tujuh pecahan [Fr. 2–3–1 (66.5 mg), 2–3–2 (20.4 mg), 2–3–3 (26.0 mg),2–3–4 (136.6 mg), 2–3–5 (38{{300}}.6 mg), 2–3–7 (84.9 mg)]. Pecahan2–3–4 (10}6.6 mg) telah disucikan lagi oleh HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1 peratus AcOH berair (5:95, v/v)] untuk memberikan salidroside (19,13.7 mg, {{340}}.0{{409}}27 peratus ). Pecahan 4 (10}.69 g) diasingkan oleh gel silika fasa terbalik CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?acetone] untuk memberikan empat pecahan [Fr. 4–1 (878.2 mg),4–2 (7.06 g), 4–3 (1.57 g) dan 4–4 (792.8 mg)]. Pecahan 4–2(1.5{{560}}} g) telah tertakluk kepada HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus AcOH berair (2{{57{{586} }}}:80, v/v)] untuk memberikan lima pecahan {Fr. 4–2–1(42.9 mg), 4–2–2 [= campneoside I (17, 67.0 mg, 0.014 peratus )], 4–2– 3 [= acteoside (5, 1.21 g, 0.26 peratus )], 4–2–4 (41.6 mg) dan 4–2–5(181.3 mg)}. Pecahan 4–2–4 (41.6 mg) disucikan lagi olehHPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 peratus AcOH berair (18:82, v/v)] memberi isoacteoside (6, 19.1 mg, 0.0040 peratus ) dan cis-acteoside (7,3.4 mg, 0.0007 peratus ). Pecahan 4–3 (1.57 g) telah ditulenkan oleh HPLC[Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus AcOH berair (20:80, v/v)] untuk memberikan11 pecahan [Fr. 4–3–1 (30.4 mg), 4–3–2 (55.2 mg), 4–3–3 (= 17,22.1 mg, 0.0010 peratus ), 4–3–4 (= 5 , 224.6 mg, 0.010 peratus ), 4–3–5 (27.4 mg),4–3–6 (43.6 mg), 4–3–7 (= 6, 825.0 mg, 0.037 peratus ), 4–3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-rhamnopyranoside (16, 37.6 mg, 0.0017 peratus )], 4–3–9(39.8 mg), 4–3–10 [{{310} }asetilakteosida (8, 85.4 mg, 0.0038 peratus )], dan4–3–11 (64.6 mg)]. Pecahan 4–3–6 (43.6 mg) disucikan lagi oleh HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 peratus akueus AcOH (18:82,v/v)] untuk memberikan kankanosides H1 (1, 17.0 mg, 0.0008 peratus) dan H2 (2,3.3 mg, 0.0001 peratus ). Pecahan 4–3–9 (39.8 mg) telah disucikan lagi oleh HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 peratus AcOH berair (18:82, v/v)] togive kankanoside I (3, 15.4 mg, 0.0007 peratus ) dan 6 ( 3.1 mg, 0.0001 peratus ).Pecahan 5 (8.84 g) dipisahkan oleh silika gelCC fasa terbalik [400 g, MeOH–H2O (20:80-30}:70, v/v)?MeOH?acetone] toive tujuh pecahan [Fr. 5–1 (870.2 mg), 5–2 (478.9 mg), 5–3(3.72 g), 5–4 (979.9 mg), 5–5 (1.19 g), 5–6 (1.27 g), dan 5 –7(130.1 mg)]. Pecahan 5–1 (870.2 mg) telah ditulenkan oleh HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN–1 peratus akueus AcOH (5:95, v/v)] untuk memberikan decaffeoy lacteoside (9, 5.1 mg, 0.0002 peratus ) dan cistanoside F ( 20, 8.1 mg, 0.0004 peratus ). Pecahan 5–3 (3.72 g) telah ditulenkan oleh HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus AcOH berair (15:85, v/v)] untuk memberikan enam pecahan [Fr. 5–3–1 (128.6 mg), 5–3–2 [= kankanose (21, 9.4 mg,0.0004 peratus )], 5–3–3 (64.6 mg), 5–3–4 (72.3 mg), 5–3–5 [= sisi echinaco (4, 2.54 g, 0.11 peratus ), dan 5–3–6 (318.5 mg)]. Pecahan 5–3–4(72.3 mg) telah disucikan lagi oleh HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 peratus AcOH berair (10:90, v/v)] untuk memberikan campneoside II (18,10.6 mg, 0.0005 peratus ). Pecahan 5–4 (979.9 mg) telah ditulenkan oleh HPLC[Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus AcOH berair (15:85, v/v)] kepada pecahan yang diberi [Fr. 5–4–1 (28.6 mg), 5–4–2 (90.5 mg), 5–4–3(99.7 mg), 5–4–4 (= 4, 25.7 mg, 0.0012 peratus ), 5 –4–5 (16.4 mg), 5–4–6(318.5 mg), 5–4–7 (21.6 mg), 5–4–8 (= 5, 204.4 mg, 0.0091 peratus ), dan5– 4–9 (134.7 mg)]. Pecahan 5–4–6 (318.5 mg) telah disucikan olehHPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 peratus akueus AcOH (15:85, v/v)] memberi cistantubulosides B1 (11, 44.9 mg, 0.0020 peratus ), B2 (12). , 7.6 mg,0.0003 peratus ), dan A (15, 21.1 mg, 0.0009 peratus ) dan wiedemanninoside C(14, 17.2 mg, 0.0008 peratus). Pecahan 5–5 (1.19 g) telah ditulenkan olehHPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus akueus AcOH (18:82, v/v)]untuk memberikan tubuloside A (10, 300.3 mg, 0.013 peratus ) dan arenarioside (13,5.8 mg, 0.0006 peratus ). Pecahan 6 (12.52 g) diasingkan oleh gel silika CC fasa terbalik [600 g, MeOH–H2O (20:80?30:70,v/v)?MeOH?acetone] untuk memberikan empat pecahan [Fr. 6–1 (553.8 mg), 6–2 (10.69 g), 6–3 (1.40 g), dan 6–4 (17.8 mg)]. Pecahan 6–2(500.0 mg) telah ditulenkan oleh HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 peratus akueus AcOH (25:75, v/v)] untuk memberikan 4 (353.1 mg, 0.34 peratus ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Serbuk putih, ½a- 24D -45.3 (c 1.06, MeOH). FABMS ion positif resolusi tinggi: Calcd untuk C37H48O20Na (M tambah Na) tambah : 835.2637. Dijumpai: 835.2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4.33), 293 (sh,4.36), 317 (4.52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 sm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: diberikan dalam Jadual 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: diberikan dalam Jadual 3. FABMS ion positif:m/z 835 (M tambah Na) tambah . FABMS ion negatif: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2)Serbuk putih, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS ion positif resolusi tinggi: Calcd untuk C37H48O20Na (M tambah Na) tambah : 835.2637. Dijumpai:835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4.26), 290 (sh, 4.22), 316(4.37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 sm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: diberikan dalam Jadual 2. 13C NMR (150 MHz,CD3OD) dC: diberikan dalam Jadual 3. FABMS ion positif: m/z 835 (M campur Na) campur .FABMS ion negatif : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Serbuk putih, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS ion positif resolusi tinggi: Calcd untuk C35H46O18Na (M tambah Na) tambah : 777.2581. Dijumpai: 777.2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3.97), 295 (sh,4.04), 334 (4.23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 sm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: diberikan dalam Jadual 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: diberikan dalam Jadual 3. FABMS ion positif:m/z 777 (M campur Na) tambah . FABMS ion negatif: m/z 753 (MH)-.

3.4. Hidrolisis alkali dan asid 1–3

Larutan 1, 2 dan 3 (setiap 1.5 mg) dalam 5 peratus kalium hidroksida berair (KOH, 0.5 mL) telah dikacau pada 40 darjah selama 1 jam. Setiap larutan telah dineutralkan dengan Dowex HCR W2 (bentuk H tambah), dan resin telah dikeluarkan melalui penapisan. Penyejatan pelarut di bawah tekanan yang dikurangkan menghasilkan produk terdeasilasi yang sepadan, yang tertakluk kepada analisis HPLC [lajur: Cosmosil pNAP,250 - 4.6 mm id; fasa mudah alih: CH3CN–1 peratus akueus AcOH(15:85, v/v); pengesanan: UV (254 nm); kadar aliran: 1.0 mL/min] dikenal pasti sebagai asid trans-kafeik (tR 9.9 min daripada 3), asid trans-p-kuumarik (tR 17.1 min daripada 1) dan asid cis-p-kuumarik (tR17.8 min daripada 2), masing-masing. Kemudian setiap satunya dilarutkan dalam 1.0 MHCl (1.0 mL) dan dipanaskan pada 80 C selama 3 jam. Selepas disejukkan, campuran tindak balas telah dineutralkan dengan Amberlite IRA-400 (bentuk OH), dan resin dikeluarkan melalui penapisan. Selepas penyingkiran pelarut di bawah tekanan berkurangan, sisa diasingkan oleh lajur kartrij Sep-Pak C18 (H2O?MeOH). Pecahan terlarut H2O tertakluk kepada analisis HPLC di bawah syarat berikut: lajur HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4.6 mm id - 250 mm(Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Jepun); pengesanan, putaran optik[Shodex ATAU-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Jepun); fasa mudah alih, CH3CN–H2O (85:15, v/v); kadar aliran 0.8 mL/min]. Pengenalpastian L-rhamnose (i) dan D-glukosa (ii) yang dibebaskan daripada 1, 2, atau 3 dalam pecahan terlarut H2O telah dijalankan dengan membandingkan masa pengekalan dan putaran optiknya dengan sampel tulen [i,tR 9.9 min. (negatif)] dan [ii, tR 17.9 min (positif)].

3.5. Bioassay

3.5.1. Reagen

LPS (dari Salmonella enteritidis), medium penting minimum (MEM), dan medium E William dibeli daripada Sigma–Aldrich Chemical (St. Louis, MO, Amerika Syarikat); serum lembu janin (FBS) adalah daripada Invitrogen (Carlsbad, CA, Amerika Syarikat); dan bahan kimia lain adalah daripada Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Jepun). 96-Pelat mikro telaga telah dibeli daripada Sumitomo Bakelite Co.,Ltd (Tokyo, Jepun).

3.5.2. Haiwan

Tikus ddY jantan telah dibeli daripada Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Jepun). Haiwan itu ditempatkan pada suhu malar 23 ± 2 C dan diberi makan makmal standard (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Jepun). Semua eksperimen dilakukan dengan tikus sedar melainkan dinyatakan sebaliknya. Protokol eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penyelidikan Haiwan Eksperimen Universiti Kinki.

3.5.3. Kesan perlindungan pada incit kecederaan hati yang disebabkan oleh D-GalN/LPS

Kaedah yang diterangkan oleh Tiegs et al.51 telah diubah suai dan digunakan untuk eksperimen ini. Secara ringkas, tikus ddY jantan dengan berat kira-kira 25–30 g dipuasakan selama 20 jam sebelum eksperimen. D-GalN (350 mg/kg) dan LPS (10 lg/kg) yang dilarutkan dalam garam telah disuntik secara intraperitoneal untuk menghasilkan kecederaan hati. Setiap sampel ujian diberikan secara lisan 1 jam sebelum suntikan D-GalN/LPS. Sampel darah dikumpulkan dari plexus vena infraorbital 10 jam selepas suntikan D-GalN/LPS. Tahap sAST dan ALT ditentukan menggunakan kaedah Reitman–Frankel (kit komersil, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hidrokortison digunakan sebagai paun kom rujukan. Sampel ujian digantung dengan larutan gula Arab 5 peratus, dan larutan itu diberikan secara lisan pada 10 mL/kg dalam setiap eksperimen, manakala kenderaan diberikan secara lisan pada 10 mL/kg dalam kumpulan kawalan corre sponding.

3.5.4. Kesan perlindungan pada sitotoksisiti yang disebabkan oleh hepatosit tikus kultur primer D-GalN

Kesan hepatoprotektif konstituen ditentukan oleh {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT ) ujian kolorimetrik menggunakan hepatosit tikus kultur primer.33–43 Hepatosit diasingkan daripada tikus maleddY (30–35 g) dengan kaedah perfusi kolagenase. Suspensi sel pada 4 - 104 sel dalam 100 lL medium William's E yang mengandungi FBS (10 peratus ), penisilin G (100 unit/mL) dan streptomycin (100lg/mL) telah diinokulasi dalam 96-plat mikro telaga dan pra-kultur selama 4 jam pada 37 darjah di bawah atmosfera CO2 5 peratus. Medium telah ditambah dengan 100 lL medium segar yang mengandungi D-GalN(2 mM) dengan atau tanpa sampel ujian dan hepatosit dibiakkan selama 44 jam. Medium ditukar dengan 100 lL medium segar, dan 10 lL MTT [5 mg/mL dalam larutan fosfat-bufferedsaline (PBS)] telah ditambah ke dalam medium. Selepas 4 jam pengeraman, medium telah dikeluarkan, dan 100 lL isopropanol yang mengandungi 0.04 M HCl kemudiannya ditambah untuk melarutkan formazan yang dihasilkan dalam sel. Ketumpatan optik (OD) larutan formazan diukur oleh pembaca plat mikro pada 570 nm (rujukan: 655 nm). Perencatan ( peratus ) diperoleh dengan formula berikut.

Perencatan ( peratus )= [(OD(sampel) - OD(kawalan))/(OD(normal)-OD(kawalan))] x 100

3.5.5. Kesan pada pengeluaran NO dalam makrofaj peritoneal tikus yang dirangsang LPS

Ujian saringan untuk pengeluaran NO menggunakan makrofaj peritoneal tikus yang disebabkan oleh TGC telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini.43,46,

3.5.6. Kesan ke atas pengeluaran TNF-a dalam makrofaj peritoneal tikus yang dirangsang LPS

TNF-a yang dikeluarkan dalam medium ditentukan seperti yang diterangkan sebelum ini28 dengan sedikit pengubahsuaian. Secara ringkas, makrofaj peritoneal tikus (5 - 105 sel/telaga) yang disebabkan oleh TGC telah dikumpulkan daripada rongga peritoneal tikus ddY jantan, digantung dalam 100 lLof RPMI 1640 ditambah dengan 5 peratus FBS, penisilin (100 unit/ mL), dan streptomycin (100 lg/mL), dan diprakultur dalam 96-plat mikro perigi pada 37 darjah dalam 5 peratus CO2 di udara selama 1 jam. Sel-sel yang tidak melekat telah dikeluarkan dengan mencuci dengan PBS, dan 100 lL medium segar yang mengandungi pelbagai kepekatan sebatian ujian telah ditambah. Selepas 10 minit, 100 lL medium yang mengandungi 10 lg/mL LPS telah ditambah dan diinkubasi selama 4 jam. Pengeluaran TNF-a dalam setiap telaga ditentukan menggunakan kit ELISA (kit TNF-a ELISA Mouse, Invitrogen). Setiap sebatian ujian telah dibubarkan dalam DMSO, dan larutan itu ditambah kepada medium (kepekatan akhir DMSO 0.5 peratus)

3.5.7. Kesan perencatan pada kematian sel akibat TNF-a dalam sel L929

Sel L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Jepun) dikekalkan dalam Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma–Aldrich) yang mengandungi 10 peratus FBS, 1 peratus MEM Non-Essential Amino acids(Invitrogen), penisilin G (100 unit /mL), dan streptomycin (100 lg/mL) pada 37 C di bawah atmosfera CO2 5 peratus. Sel-sel telah diinokulasi dalam 96-plat kultur tisu telaga [3 -104 sel/telaga dalam100 lL/telaga dalam MEM]. Selepas 44 jam pengeraman dalam mediumTNF-a (20 ng/mL) dengan atau tanpa sampel ujian, daya maju sel telah dinilai oleh ujian kolorimetrik MTT (videante).49,50 Setiap sebatian ujian telah dibubarkan dalam DMSO, dan larutan itu ditambah kepada medium (kepekatan akhir dalam DMSO0.5 peratus ).

3.6. Perangkaan

Nilai dinyatakan sebagai min ± SEM Analisis sehala varians (ANOVA) diikuti dengan ujian Dunnett digunakan untuk analisis statistik. Nilai kebarangkalian (p) kurang daripada 0.05 dianggap penting.

Ucapan terima kasih

TM, KN dan OM disokong oleh Geran-in-Aid untuk Penyelidikan Saintifik daripada Projek 'Pusat Penyelidikan Berteknologi Tinggi' untuk Universiti Swasta: subsidi dana padanan daripada Geran-in-Aid untuk Penyelidikan Saintifik daripada Kementerian Pendidikan, Kebudayaan , Sukan, Sains dan Teknologi (MEXT) Jepun, 2007–2011 dan turut disokong oleh Geran-in-Aid untuk Penyelidikan Saintifik daripada MEXT. MYdan HM disokong oleh Program COE ke-21, Projek Sempadan Akademik dan Geran-in-Aid untuk Penyelidikan Saintifik daripada MEX

Daripada: ' Berasilatphenylethanoidoligoglycosides dengan aktiviti hepatoprotektif dari tumbuhan padang pasirCistanche tubulosa' olehToshio Morikawa et al

---Kimia Bioorganik & Perubatan 18 (2010) 1882–1890.