Kesan Neuroprotektif Bergantung Dos Akut Poli(pro-17 estradiol) dalam Model Tetikus Kecederaan Lebam Tulang Belakang

Abstrak

17 -Estradiol (E2) memberikan perlindungan saraf dalam model praklinikal kecederaan saraf tunjang apabila diberikan secara sistemik. Matlamat kajian ini adalah untuk menggunakan E2 secara tempatan pada saraf tunjang yang cedera untuk tempoh yang berterusan menggunakan biomaterial filem poli(pro-E2).

Apabila orang ramai mengetahui lebih lanjut tentang kecederaan saraf tunjang, kami mula menyedari kesannya terhadap kesihatan fizikal dan mental orang ramai. Walaupun kecederaan saraf tunjang boleh menyebabkan banyak kesan buruk, mujurlah kesannya terhadap ingatan boleh dikawal.

Pertama, kita perlu menjelaskan apa itu kecederaan saraf tunjang. Saraf tunjang adalah saraf yang dilindungi di tulang belakang yang bertanggungjawab untuk menghantar arahan dari otak ke pelbagai bahagian badan. Jika saraf tunjang cedera, beberapa bahagian badan akan kehilangan hubungan yang baik dengan otak, mengakibatkan pergerakan anggota badan terjejas, sensasi, dan kawalan autonomi.

Kecederaan saraf tunjang mungkin mempunyai kesan tertentu terhadap ingatan orang, terutamanya pada peringkat awal pemulihan pesakit yang mengalami kecederaan saraf tunjang. Kecederaan saraf tunjang boleh menyebabkan perhatian seseorang, ingatan bekerja dan keupayaan pemprosesan emosi merosot, yang akan menjejaskan keupayaan ingatan seseorang.

Walau bagaimanapun, kesan negatif ini akan beransur-ansur berkurangan apabila pesakit menjalani rawatan pemulihan. Pesakit boleh meningkatkan ingatan mereka dengan mengambil bahagian dalam permainan memori dan latihan kognitif yang lain. Pada masa yang sama, pemulihan fizikal juga kondusif untuk memulihkan fungsi motor dan deria badan, seterusnya meningkatkan fungsi emosi dan kognitif.

Kita harus menggalakkan pesakit yang mengalami kecederaan saraf tunjang untuk mengambil bahagian secara aktif dalam rawatan pemulihan dan meneruskan latihan pemulihan untuk meningkatkan kesihatan fizikal dan mental. Sila percaya bahawa dengan bantuan kognisi yang betul dan rawatan selepas pembedahan, pesakit boleh mengatasi kesan kecederaan saraf tunjang pada ingatan dan terus menjalani kehidupan yang aktif. Ia dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche boleh meningkatkan ingatan dengan ketara kerana Cistanche juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan, yang sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak memperoleh nutrisi dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Berikutan kecederaan saraf tunjang contusives pada tikus jantan dewasa, filem poli(pro-E2) ditanam secara subdural, dan perlindungan saraf dinilai menggunakan imunohistokimia 7 hari selepas kecederaan dan implantasi. Dalam kajian ini, filem poli(pro-E2) telah meningkatkan perlindungan saraf secara sederhana tanpa menjejaskan tindak balas keradangan. jika dibandingkan dengan kawalan yang cedera.

Untuk meningkatkan dos E2 yang dikeluarkan, filem poli(pro-E2) yang melepaskan bolus telah direka dengan memasukkan E2 yang tidak terikat ke dalam filem poli(proE2).

Walau bagaimanapun, berbanding dengan kawalan yang cedera, filem poli(pro-E2) yang melepaskan bolus tidak meningkatkan perlindungan saraf atau menghadkan keradangan sama ada pada 7 atau 21 hari selepas kecederaan. Kerja akan datang akan menumpukan pada pembangunan biobahan poli(pro-E2) yang mampu lebih tepat mengeluarkan dos terapeutik E2.

PENGENALAN

Kecederaan saraf tunjang traumatik (SCI) ialah keadaan melemahkan yang menjejaskan lebih 18,000 orang setiap tahun di Amerika Syarikat,1 manakala kelaziman global SCI dianggarkan antara 236 dan 1009 setiap juta.2

Pesakit yang terjejas oleh SCI mengalami defisit neurologi yang teruk termasuk kehilangan sensasi, fungsi usus/pundi kencing terjejas, dan lumpuh.3,4 Kesan utama pada saraf tunjang mengakibatkan kematian neuron di tapak kecederaan yang diburukkan lagi oleh beberapa lata kecederaan sekunder yang melibatkan astrosit dan makrofaj .

Lama kelamaan, astrosit ini membentuk parut glial yang menghalang pemanjangan akson di luar tepi lesi.5 Tiada ubat neuroprotektif yang diluluskan oleh FDA setakat ini untuk merawat SCI.

Penyelidikan yang merangkumi beberapa dekad telah menumpukan pada pentadbiran sistemik biomolekul untuk mencegah kehilangan neuron akibat kecederaan sekunder dan/atau untuk menggalakkan penjanaan semula aksonal, yang akhirnya membawa kepada pemulihan fungsi yang hilang.6 Satu biomolekul yang telah menunjukkan janji yang ketara dalam model praklinikal SCI ialah wanita hormon seks, 17 -estradiol(E2).

Pentadbiran E2 secara meluas memberi manfaat kepada sistem saraf pusat dengan mengurangkan keradangan,7–9 mengurangkan kereaktifan sel glial,10 mengehadkan tekanan oksidatif,11–14 dan mengurangkan kematian neuron eksitotoksik yang disebabkan oleh glutamat.15 E2 meningkatkan pemulihan fungsi dalam pelbagai model tikus SCI.10, 16,17 Menariknya, pentadbiran sistemik berbilang dos E2 mendorong pemulihan fungsi lebih cepat18,19 berbanding haiwan yang hanya menerima satu dos.17

Memandangkan E2 menggalakkan pemulihan fungsi dengan lebih berkesan melalui rejimen berbilang dos, matlamat kami adalah untuk melepaskan E2 secara stabil secara tempatan di tapak kecederaan (untuk mengelakkan sebarang kesan luar sasaran) untuk mengelakkan masalah yang timbul daripada berbilang dos/suntikan sistemik E2.

Untuk itu, kami menggunakan strategi biomaterial poli(prodrug) di mana ubat asli (E2) mula-mula difungsikan dengan kumpulan allil reaktif dan kemudian dipolimerkan melalui penambahan radikal photoinitiatedthiol-ene dengan dithiol oligo-(etilena glikol) fleksibel, seperti yang dinyatakan sebelum ini. .20 Kami memperoleh rantai polimer berat molekul tinggi, yang terdiri daripada E2prodrug sebagai unit berulang dalam polimer.

Selepas degradasi hidrolitik, polimer secara beransur-ansur membebaskan E2 ke dalam media sekeliling. Satu-satunya hasil sampingan lain daripada pelepasan itu ialah karbon dioksida dan oligo(etilena glikol) (oEG) (Rajah 1). Rantaian poli(pro-E2) yang difabrikasi ke dalam filem atau gentian mikro boleh membebaskan E2 pada kepekatan nanomolar secara in vitro pada skala masa bulan hingga tahun .20

E2 yang dilepaskan daripada perancah poli(pro-E2) ini adalah bioaktif, dan perancah ini menggalakkan neurotropisme dan perlindungan neuroproteksi secara in vitro dengan melindungi neuron daripada tekanan oksidatif yang disebabkan oleh hidrogen peroksida. Di sini, kami menggunakan filem poli (pro-E2) dalam model murine kontusi SCI, serta-merta selepas kecederaan, dan menilai keupayaan neuroprotektif mereka dalam vivo.

Reka bentuk filem poli(pro-E2) awal kami meningkatkan perlindungan saraf secara akut (7 hari selepas kecederaan) di tapak kecederaan tanpa menjejaskan tindak balas keradangan. Memandangkan filem poli(pro-E2) mengeluarkan nanogram E2 setiap hari, kami membangunkan strategi keluaran lain di mana unboundE2 telah dimasukkan ke dalam matriks poli(pro-E2). Kami membuat hipotesis bahawa pelepasan bolus E2 yang tidak terikat mungkin memberikan faedah pelindung saraf tambahan.

Filem poli(pro-E2) yang dikeluarkan E2 dalam cara pecah diikuti dengan pelepasan berterusan E2 daripada polimer pada kepekatan yang lebih rendah. Pewarnaan imunohistologi menilai neuron, astrocytes, dan makrofaj/mikroglia yang terdapat di tapak kecederaan secara akut (7 hari selepas kecederaan) dan secara kronik (21 hari selepas kecederaan) selepas SCI dengan kehadiran filem poli (pro-E2) yang mengeluarkan bolus ini.

KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

Filem poli(pro-E2) melepaskan E2 pada kepekatan nanomolar, menggalakkan pertumbuhan neuron daripada ganglion akar dorsal, dan melindungi neuron daripada tekanan oksidatif akibat hidrogen peroksida secara in vitro.20 Kajian yang dibentangkan di sini bertujuan untuk menentukan keupayaan poli(pro-E2) filem untuk menyediakan perlindungan saraf dalam vivo menggunakan model murine SCI lebam.

SCI lebam sederhana telah diinduksi pada tikus jantan dewasa, dan sejurus selepas kecederaan, filem poli (pro-E2) diletakkan terus di atas kecederaan (Rajah 2A). Untuk memastikan filem poli(pro-E2) kekal di tempatnya selepas implantasi, filem poli(pro-E2) yang dimuatkan dengan rhodamine B telah diimplan ke dalam saraf tunjang haiwan yang cedera. Tujuh hari selepas implantasi, saraf tunjang dikumpul dan diimej menggunakan mikroskop cahaya (Rajah2B). Dalam semua haiwan, filem poli(pro-E2) yang dimuatkan rhodamine B yang diimplan kekal di tempat yang mengesahkan protokol implantasi.

Untuk menguji keupayaan filem poli(pro-E2) memberikan perlindungan saraf dan mengurangkan keradangan, filem poli(pro-E2) (tanpa rhodamine B) telah diimplan berikutan kecederaan contusion tulang belakang, dan saraf tunjang dikumpulkan 7 hari selepas kecederaan dan implantasi. Bahagian membujur (tebal 10 μm) dipotong, berpusat di sekitar pusat kecederaan, dan dilabel imuno untuk menggambarkan neuron dan makrofaj dalam saraf tunjang (Rajah 3).

Bahagian dilabelkan untuk NeuN untuk menilai kehadiran neuron, dan analisis kuantitatif pewarnaan mendedahkan bahawa filem poli (pro-E2) dengan ketara meningkatkan kawasan positif NeuN di sekitar pusat kecederaan berbanding dengan kawalan yang cedera yang tidak menerima implan filem (Rajah 3A; p=0.0002). Pewarnaan tambahan untuk akson menggunakan NFH (rantai berat neurofilamen) juga mendedahkan kesan neuroprotektif akut bagi filem poli(pro-E2) yang diimplan (Rajah 3B; p=0.0017).

Kami mendapati bahawa perubahan dalam neuroprotection ini bukan disebabkan oleh perubahan dalam apoptosis (caspase 3) di tapak kecederaan (Rajah S1; p=0.9966).Pewarnaan untuk makrofaj diaktifkan (CD68) juga tidak mendedahkan sebarang perbezaan ketara antara haiwan poli(pro-E2) yang dirawat dengan filem dan haiwan yang tidak dirawat (Rajah 3C; p= 0.7207).

Secara keseluruhan, filem poli(pro-E2) secara sederhana meningkatkan perlindungan saraf secara akut tanpa mengubah tindak balas keradangan. Filem poli(pro-E2) meningkatkan ketumpatan neuron secara akut hampir 20%, tetapi filem itu tidak mempunyai kesan anti-radang yang jelas (berdasarkan kuantifikasi kawasan yang diduduki oleh makrofaj yang diaktifkan) (Rajah 3).

Kekurangan pengurangan keradangan ini mungkin menunjukkan bahawa dos anti-radang dan neuroprotektif E2 adalah berbeza dan kedua-duanya tidak dicapai dengan formulasi filem semasa.20 Kami membuat hipotesis bahawa peningkatan pelepasan E2 daripada filem poli(pro-E2) secara akut boleh mengurangkan keradangan. dan membolehkan tindak balas neuroprotektif yang lebih mantap.

Untuk meningkatkan dos E2 yang dikeluarkan secara akut, filem poli(pro-E2) telah diubah suai supaya pelepasan bolus E2 akan berlaku serta-merta selepas implantasi. Selepas pembebasan bolus E2, degradasi polimer akan menyusuli untuk membebaskan E2 pada kepekatan yang sama seperti sebelumnya. Percubaan yang diterangkan di atas telah diulang menggunakan filem poli (pro-E2) yang mengeluarkan bolus ini, dan perlindungan saraf dan keradangan dinilai pada 7 hari selepas kecederaan (dpi).

Walau bagaimanapun, bukannya manfaat tambahan, filem poli(pro-E2) yang mengeluarkan bolus tidak meningkatkan kawasan positif NeuN dengan ketara berbanding dengan kawalan yang cedera dan tidak dirawat (Rajah 4A; p=0.6770). Filem poli(proE2) yang mengeluarkan bolus meningkatkan ekspresi CD68, tetapi peningkatan itu tidak berbeza secara statistik (p= 0.1780).

Peningkatan trend dalam kereaktifan glial dan keradangan mikroglial juga diperhatikan dengan kehadiran filem poli (pro-E2) yang mengeluarkan bolus disebabkan oleh peningkatan dalam ekspresi GFAP (astrocytes) dan Iba1 (mikroglia); walau bagaimanapun, peningkatan ini secara statistik tidak lebih besar daripada apa yang diperhatikan dalam kawalan yang cedera dan tidak dirawat (masing-masing p=0.3233dan p=0.3053). Diambil bersama, filem poli(pro-E2) yang mengeluarkan bolus telah meningkatkan perlindungan saraf, dan kereaktifan astrosit dan kehadiran makrofaj/mikroglia tidak dikurangkan seperti yang dihipotesiskan pada awalnya.

Oleh kerana perbezaan antara haiwan yang cedera, tidak dirawat dan cedera, haiwan yang dirawat filem poli(proE2) yang melepaskan bolus tidak diperhatikan pada titik masa akut, 7 dpi, titik masa kronik telah dipilih untuk siasatan lanjut sejak filem poli(pro-E2). boleh mengeluarkanE2 jangka panjang.20 Percubaan yang diterangkan di atas telah diulang dengan filem bolus-releasingpoly(pro-E2), tetapi haiwan itu dinilai secara kronik pada 21 dpi (Rajah 5).

Spinalcords dilabelkan untuk jenis sel yang sama yang dinyatakan sebelum ini. Berikutan analisis, terdapat kecenderungan ke arah peningkatan dalam pecahan kawasan NeuN dalam haiwan yang diimplan filem poli(pro-E2) yang melepaskan bolus berbanding haiwan yang cedera dan tidak dirawat (Rajah 5A; p=0.0897) .Selain itu, trend diperhatikan apabila filem poli(pro-E2) yang mengeluarkan bolus mengurangkan pecahan kawasan bagi ekspresi CD68 dan GFAP berbanding dengan data daripada kawalan haiwan yang tidak dirawat dan cedera (Rajah 5B, C; p=0.0859 dan p=0.2780).

Walau bagaimanapun, tiada satu pun daripada trend itu berbeza secara statistik. Sebaliknya, bahagian tisu yang dilabel Iba1 daripada haiwan dirawat poli (pro-E2) yang mengeluarkan bolus menunjukkan peningkatan ekspresi berbanding data daripada kawalan yang tidak dirawat dan cedera (p < 0.0001). Kerja kami sebelum ini menunjukkan bahawa poli(pro -E2) filem yang dipancarkan pada liputan penutup 15 mm × 15 mm mengeluarkan kira-kira 266 ng E2 sehari,20 yang diterjemahkan kepada kira-kira 2 ng E2 sehari daripada filem (1 mm × 1.8 mm) yang digunakan di sini. Filem poli(pro-E2) yang mengeluarkan bolus mengeluarkan tambahan 40 ug E2 yang tidak terikat secara akut selepas implantasi.

Penyelidikan yang memfokuskan kepada penggunaan E2 dalam model SCI tikus menunjukkan bahawa estrogen dos rendah (10 ug/kg) yang ditadbir secara intravena melemahkan gliosis reaktif dan menyediakan perlindungan saraf sambil melemahkan kejadian keradangan, menghalang apoptosis, dan meningkatkan angiogenesis.21 Sebaliknya, dos estrogen yang tinggi dan sistemik mempunyai kesan buruk yang termasuk peningkatan kadar veintrombosis dalam dan kanser22,23 dan perkembangan sifat fizikal feminin pada lelaki. Ini patut diberi perhatian kerana kebanyakan penyelidikan E2 telah memberi tumpuan kepada penghantaran E2 secara sistemik sama ada secara intravena atau intraperitoneal.

Memandangkan kebimbangan keselamatan dengan penggunaan dos tinggi E2 secara sistemik, adalah penting untuk mengoptimumkan kepekatan E2 untuk penghantaran tempatan ke saraf tunjang yang cedera untuk mengelakkan kesan sampingan. Sehingga kini, hanya satu kajian telah menyampaikan E2 daripada biomaterial dengan menggunakan zarah nano untuk menyampaikan E2 secara fokus (2.5 ug atau 25 ug). Pelepasan daripada nanopartikel dengan cepat mengurangkan keradangan secara akut dalam model tikus lebam SCI.9Ketiadaan tindak balas yang signifikan secara statistik dalam data kami (Rajah 4 dan 5) mungkin disebabkan oleh ketidakseimbangan dalam jumlah E2 yang kami hantar secara tempatan ke saraf tunjang dengan toomich E2 (40 ug) dikeluarkan secara akut manakala sangat sedikit (2 ng) dikeluarkan secara kronik.

Walaupun apa yang kami perhatikan daripada data ini adalah trend sederhana, kajian ini menyerlahkan kepentingan dos E2 untuk menggalakkan perlindungan saraf dalam vivo. Mengurangkan dos awal E2 dan melaraskan kinetik degradasi biomaterial poli(pro-E2) boleh membantu mengurangkan masalah ini dan berpotensi memberikan hasil neuroprotektif yang lebih baik.

Walaupun kajian ini dilakukan semata-mata pada lelaki, adalah penting untuk menilai kesan filem poli(pro-E2) dalam kedua-dua jantina untuk mewujudkan potensi translasi yang sah untuk biomaterial ini. Penyelidikan telah menunjukkan bahawa berikutan SCI, peningkatan tahap estrogen pada wanita mungkin sebahagiannya bertanggungjawab untuk hasil fungsi mereka yang lebih baik berbanding lelaki.24Oleh kerana terdapat peningkatan kehadiran estrogen pada wanita, mana-mana strategi biomaterial yang menggunakan estrogen perlu mengambil kira tahap peningkatan ini dan mengubah suai bahan tersebut. lepaskan kinetik mengikut untuk memastikan dos yang dihantar kekal sama untuk lelaki dan perempuan.

KAEDAH

Fabrikasi Filem Poli(pro-E2).

Polimer poli(pro-E2) P1 telah disintesis dan dicirikan seperti yang diterangkan secara terperinci sebelum ini.20 Polimer mempunyai berat molekul purata berat MW ~ 80 kDa dan keterserakanan Đ ~ 3, mengikut kromatografi resapan gel (GPC). Filem poli(pro-E2) telah difabrikasi dengan melarutkan polimer dalam kloroform (5 wt %/wt; polimer/kloroform), menuang titis larutan ke atas slip penutup kaca 15 mm × 15 mm (100 μLsolution setiap coverlip), dan meninggalkannya kering semalaman di bawah vakum (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Untuk mencipta filem poli(pro-E2) dengan E2 yang tidak terikat, filem telah direka dengan menambahkan E2 yang tidak terikat (Abcam, Cambridge, MA) kepada larutan polimer (0.0625 wt %/wt; E2/chloroform) sebelum tuangan titisan larutan ke atas slip penutup. Sebelum implantasi, slip penutup dengan filem telah disterilkan menggunakan sinaran ultraungu (UV) selama 30 minit dan filem itu dikupas daripada slip penutup dalam kabinet biokeselamatan steril. Filem poli(pro-E2) kemudiannya dipotong menjadi kepingan 1 mm × 1.8 mm, sesuai untuk implantasi dalam tetikus dewasa seperti yang diterangkan di bawah.

Contusion Kecederaan Saraf Tunjang dan Implantasi Filem Poli(pro-E2).

Semua prosedur penjagaan pembedahan dan pasca operasi telah diluluskan oleh Rensselaer PolytechnicInstitute dan The Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committees(IACUC). Untuk mendorong SCI lebam, tikus C57BL/6 jantan dewasa (10- hingga 12-minggu), dibeli daripada Makmal Jackson (no. stok 000664; Bar Harbor, ME), telah dibius dengan suntikan intraperitoneal ketamin (80 mg/kg) dan xylazine (10 mg/kg). Bahagian belakang haiwan dicukur dan disediakan secara aseptik menggunakan 70% etanol dan betadine.

Selepas penempatan haiwan pada pad pemanas dikekalkan pada 37 darjah , lapisan kulit dan otot dibuka untuk mendedahkan lajur vertebra, dan laminektomi dorsal dilakukan pada vertebra toraks kesembilan (T9) untuk mendedahkan saraf tunjang. Lebakan sederhana (75 kdyn)SCI telah diinduksi pada tahap ini menggunakan impak Infinite Horizons (Sistem dan Instrumen Ketepatan, Lexington, KY).

Selepas hemostasis dicapai, dura dibuka (Rajah 2) dan filem poli (pro-E2) atau filem poli (pro-E2) yang melepaskan bolus (1 mm × 1.8 mm) diletakkan di bawah dura dan di atas saraf tunjang, meliputi tapak kecederaan. Dalam haiwan kawalan, dura dibuka tetapi filem poli (pro-E2) tidak diimplan. Lapisan otot kemudiannya ditutup menggunakan jahitan steril, dan kulit ditutup menggunakan klip luka logam steril.

Tikus-tikus tersebut menerima 2 mL garam steril yang disuntik secara subkutan dan dikembalikan ke sangkarnya dan diletakkan di atas slaid warmer yang ditetapkan pada suhu 37 darjah semalaman. Untuk memastikan penghidratan yang betul dan untuk mengelakkan jangkitan, tikus disuntik secara subkutan dengan 1–2 mL garam steril dan Gentocin (1 mg/kg) setiap hari untuk 5 hari pertama selepas kecederaan (dpi). Pundi kencing dinyatakan secara manual dua kali sehari untuk tempoh eksperimen. Semua haiwan ditempatkan dalam keadaan konvensional pada 12-kitaran gelap-gelap jam dengan akses ad libitum kepada makanan dan air.

Penuaian Tisu.

Pada titik masa terminal yang ditetapkan iaitu 7 atau 21 dpi, tikus disuntik dengan lethaldose ketamin/xylazine (1.5× dos pembedahan) dan diperas secara transkardi dengan 0.1 Mphosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4) diikuti oleh 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Saraf tunjang telah dikeluarkan, selepas ditetapkan selama 2 jam dalam 4% PFA, dan kemudian dipindahkan ke 0.2M penampan fosfat (PB; pH 7.4) semalaman.

Saraf tunjang telah dilindungi dalam 30% sukrosa selama 48 jam pada 4 darjah dan kemudian disekat ke dalam segmen 10 mm berpusat di sekitar tapak kecederaan dengan lajur dorsal menghadap ke atas. Bahagian ini dibenamkan dalam medium suhu pemotongan optimum Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) dan dibekukan dengan cepat di atas ais kering. Semua saraf tunjang dibelah pada 10 μm pada kriostat Microm HM505E, diletakkan pada slaid ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), dan kemudian disimpan pada -20 darjah sehingga digunakan untuk imunostaining.

Imunohistokimia dan Kuantifikasi.

Slaid dicairkan pada pemanasan slaid selama 1 jam dan kemudian dibilas 3 kali dalam 0.1 MPBS. Aktiviti peroksidase endogen telah dipadamkan dengan mengeramkan slaid dalam 6% H2O2 yang dicairkan dalam metanol selama 15 minit di RT. Selepas mencuci 3 kali dalam 0.1 M PBS, bahagian tersebut diinkubasi dengan 4% BSA dan 0.1% Triton X-100 dalam 0.1 M PBS untuk 1 h diikuti dengan pengeraman semalaman antibodi utama pada 4 darjah atau RT (Jadual 1).

Slaid telah diinkubasi dengan antibodi sekunder terbiotinilasi yang sesuai (1: 1000; Makmal Vektor, Burlingame, CA) di RT selama 1 jam. Untuk menggambarkan antibodi terikat, slaid diinkubasi dengan Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) selama 1 jam dan dibangunkan dengan ImmPACT3,3′-diaminobenzidine (DAB) atau substrat Vector SG (Vector Laboratories) selama 10 minit.

Bahan-bahan ini telah didehidrasi melalui pengeraman 2 × 2 min berturut-turut dalam 70% dan 90% etanol, 2 × 3 min dalam etanol 100%, diikuti oleh 3 × 3 minit dalam Histoclear, dan akhirnya ditutup dengan Permount (ThermoFisher Scientific). Enam bahagian setiap haiwan, jarak 100 μm antara saraf tunjang yang cedera, digunakan untuk analisis kuantifikasi.

Bahagian immunolabeled telah diimej menggunakan mikroskop pengimejan Axioplan 2 yang dilengkapi dengan kamera AxioCamdigital dan perisian AxioVision versi 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Jerman) dan objektif 5x.

Bilangan piksel positif dalam setiap bahagian telah dikira menggunakan perisian analisis imej MIPAR (MIPAR, Worthington, OH) untuk mengira peratus pecahan kawasan positif setiap bahagian. Purata peratus kawasan positif enam bahagian bagi setiap haiwan dikira untuk setiap kesan dan dilaporkan.

Analisis Statistik.

Semua data dilaporkan sebagai min ± sisihan piawai. Analisis statistik dilakukan menggunakan Perisian Statistik GraphPad Prism 9 (Perisian GraphPad, San Diego, CA). Dalam semua eksperimen, 5-6 haiwan digunakan setiap kumpulan, berasal dari sekurang-kurangnya dua lot haiwan yang berbeza. Untuk menguji perbezaan antara kumpulan filem kawalan dan poli(pro-E2), ujian-t Pelajar (Rajah 3, 4, dan 5) telah digunakan. Kepentingan telah diwujudkan pada p Kurang daripada atau sama dengan 0.05.

Bahan Tambahan

Rujuk versi Web di PubMed Central untuk bahan tambahan.

PENGHARGAAN

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Wenmin Lai atas bantuannya dengan pembedahan tikus.

Pembiayaan

Kerja ini mendapat sokongan daripada Craig H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) dan Paralyzed Veteransof America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) kepada MKG dan daripada NIH R01 (Grant NS092754) dan New York State State Spinal Cord Injury Review Board Geran Sokongan Institusi C32245GG kepada RJG Semua kerja haiwan dilakukan dengan bantuan daripada The Ohio State University Neuroscience Department Surgical Core disokong oleh NINDS Grant P30NS104177.

RUJUKAN

(1). Pusat Perangkaan Kecederaan Saraf Tunjang Kebangsaan. (2020) Fakta dan Angka Kecederaan Saraf Tunjang Sepintas lalu, Universiti Alabama di Birmingham, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J, dan Brown D (2011) Peta Global untuk Epidemiologi Kecederaan Saraf Tunjang Traumatik: Ke Arah Repositori Data Hidup untuk Pencegahan Kecederaan. Saraf Tunjang. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Kecederaan Saraf Tunjang - Dahulu, Kini dan Masa Depan. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ, dan Wilson DA (2010) Penyiasatan Seluruh Negeri Mengenai Keadaan Kesihatan Buruk Orang Yang Mengalami Kecederaan Saraf Tunjang. J. Saraf Tunjang Med. 33 (3),221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J, dan Miller JH (2004) Regeneration beyond the Glial Scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2),146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, dan Banik NL (2013) Kecederaan SpinalCord: Tinjauan Terapi Semasa, Rawatan Masa Depan dan Asas Sains Frontiers.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, andBeyer C (2018) Estrogen Melemahkan Ekspresi dan Pengaktifan Inflammasom Setempat selepas Kecederaan SpinalCord. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG, dan Yune TY (2018) Estrogen Mengurangkan Sakit Neuropatik yang Disebabkan selepas Kecederaan Saraf Tulang Belakang dengan Menghalang Pengaktifan Mikroglia dan Astrocyte. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Asas Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, dan Banik N (2015) Estrogen Nanopartikel dalam Kecederaan Saraf Tunjang Tikus Menimbulkan Kesan Anti-Radang yang Pantas dalam Plasma, Cecair Serebrospinal dan Tisu.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK, dan Banik NL (2010)Rawatan Estrogen Selepas Kecederaan Kecederaan Saraf Tunjang Kronik Meningkatkan Fungsi Lokomotor dalam Tikus. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H, dan Akaike A (2001)Transduksi Isyarat Antiapoptotik Nongenomik oleh Estrogen dalam Neuron Kortikal Berbudaya. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK, dan Banik NL (2003) Estrogen sebagai Ejen Neuroprotektif dalam Rawatan Kecederaan Saraf Tunjang. Ann. NY Acad. Sci. 993,125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com