Peralihan Aktif Fasa Ingatan Ketakutan Daripada Penyatuan Semula Kepada Kepupusan Melalui Pencegahan Penyatuan Semula ERK-Mediated

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Themendapatkan semula ingatan ketakutanmendorong dua proses ingatan yang bertentangan, iaitu, penyatuan semula dan kepupusan. Pendapatan ringkas mendorong penyatuan semula untuk mengekalkan ataumeningkatkan ingatan ketakutan,manakala pengambilan berpanjangan memadamkan ingatan ini. Walaupun mekanisme penyatuan semula dan kepupusan telah disiasat, masih tidak diketahui bagaimana fasa ingatan ketakutan dialihkan daripada penyatuan semula kepada kepupusan semasa pengambilan semula ingatan. Di sini, kami menunjukkan bahawa proses peralihan memori yang bergantung kepada kinase (ERK) yang dikawal oleh isyarat ekstraselular selepas pengambilan mengawal suis fasa ingatan daripada penyatuan semula kepada kepupusan dengan menghalang induksi penyatuan semula dalam tugas pengelakan perencatan (IA) pada tikus jantan. Pertama, fasa ingatan peralihan, yang membatalkan induksi penyatuan semula, tetapi tidak mencukupi untuk pemerolehan kepupusan, dikenal pasti selepas penyatuan semula, tetapi sebelum fasa kepupusan. Kedua, fasa penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan selepas pengambilan semula ingatan menunjukkan tandatangan molekul dan selular yang berbeza melalui protein pengikat unsur (CREB) responsif cAMP dan fosforilasi ERK dalam amygdala, hippocampus, dan korteks prefrontal medial (mPFC). Fasa penyatuan semula menunjukkan peningkatan fosforilasi CREB, manakala fasa kepupusan memaparkan beberapa populasi saraf dengan pelbagai kombinasi fosforilasi CREB dan/atau ERK, di kawasan otak ini. Menariknya, tiga fasa ingatan, termasuk fasa peralihan, menunjukkan pengaktifan ERK sementara sejurus selepas pengambilan semula. Paling penting, sekatan ERK dalam amygdala, hippocampus, atau mPFC pada fasa memori peralihan menghalang peningkatan memori IA yang disebabkan oleh penyatuan semula. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa laluan isyarat ERK secara aktif mengawal peralihan fasa ingatan daripada penyatuan semula kepada kepupusan dan proses ini berfungsi sebagai suis yang membatalkan penyatuan semula ketakutan.ingatan.

Kata kunci: ERK; kepupusan;takut ingatan; penyatuan semula; peralihan

1Jabatan Biosains, Fakulti Sains Hayat, Universiti Pertanian Tokyo, Tokyo 156-8502, Jepun dan

2Pusat Pengajian Siswazah Pertanian dan Sains Hayat, Universiti Tokyo, Tokyo 113-8657, Jepun

Kenyataan Kepentingan

Mendapatkan semula ingatan ketakutanmendorong dua proses ingatan yang bertentangan; penyatuan semula dan kepupusan. Penyatuan semula mengekalkan/meningkatkan ingatan ketakutan, manakala kepupusan melemahkan ingatan ketakutan. Ia masih tidak diketahui bagaimana fasa memori ditukar daripada penyatuan semula kepada kepupusan semasa pengambilan semula. Di sini, kami mengenal pasti proses peralihan memori aktif yang berfungsi sebagai suis yang menghalang penyatuan semula. Fasa peralihan ingatan ini menunjukkan peningkatan sementara fosforilasi kinase dikawal isyarat ekstraselular (ERK) dalam amygdala, hippocampus, dan korteks prefrontal medial (mPFC). Menariknya, perencatan ERK di kawasan ini pada fasa peralihan menghalang peningkatan pengantaraan penyatuan semula ingatan pengelakan (IA). Penemuan ini mencadangkan bahawa proses memori peralihan secara aktif mengawal suis fasa ingatan ketakutan memori ketakutan dengan menghalang induksi penyatuan semula melalui pengaktifan laluan isyarat ERK.

pengenalan

Pengambilan semula ingatanbukanlah proses pasif tetapi lebih merupakan proses dinamik yang membolehkan penyelenggaraan, pengukuhan, melemahkan, atau mengubah/mengemaskini ingatan asal (Misanin et al., 1968; Schneider dan Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. , 1979; Gordon, 1981; Nader et al., 2000; Nader dan Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima et al., 2014). Yang penting, ingatan ketakutan terkondisi yang diperoleh semula dengan pendedahan semula ringkas kepada rangsangan terkondisi (CS) menjadi labil dan memerlukan penyatuan semula yang bergantung kepada ekspresi gen untuk penyelenggaraan atau peningkatannya (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Tronel et al., 2005; Fukushima et al., 2014). Sebaliknya, pendedahan semula berterusan atau berulang kepada CS mendorong kepupusan ingatan, yang melemahkan ingatan ketakutan (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers dan Davis, 2002). Oleh itu,mendapatkan semula ingatan ketakutanmendorong dua proses ingatan yang bertentangan, iaitu, penyatuan semula dan kepupusan, walaupun kedua-dua proses itu disebabkan oleh pendedahan semula kepada CS yang sama, tetapi berbeza mengikut tempoh pendedahan semula kepada CS.

Ciri biokimia yang biasa dan kritikal bagi penyatuan semula dan kepupusan adalah keperluan untuk ekspresi gen pengantara unsur-unsur (CREB) responsif cAMP (Mamiya et al., 2009). Menariknya, kami telah menunjukkan tandatangan molekul, anatomi, dan tingkah laku yang berbeza antara fasa penyatuan semula dan kepupusan ingatan ketakutan kontekstual (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Menyekat sintesis protein semasa fasa penyatuan semula mengganggu ingatan ketakutan asal, manakala menyekat sintesis protein semasa fasa kepupusan gagal melakukan ini, walaupun memori ketakutan kontekstual diaktifkan semula. Keperluan kawasan otak yang memaparkan pengaktifan ekspresi gen pengantara CREB berbeza antara penyatuan semula dan kepupusan; penyatuan semula bergantung pada amygdala dan hippocampus, manakala kepupusan bergantung pada amygdala dan korteks prefrontal medial (mPFC). Walau bagaimanapun, tempoh masa pengaktifan CREB amygdaloid berbeza antara fasa penyatuan semula dan ingatan kepupusan. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa fasa penyatuan semula dan kepupusan tidak bebas, sebaliknya berinteraksi antara satu sama lain. Menariknya, kajian baru-baru ini telah mengenal pasti tetingkap masa (fasa peralihan) yang tidak menunjukkan pengaktifan kinase terkawal isyarat ekstraselular (ERK) dalam amygdala selepas penyatuan semula, tetapi sebelum fasa kepupusan berikutan pengambilan semula ingatan ketakutan pendengaran (Merlo et al., 2018). ). Secara keseluruhan, penemuan ini mencadangkan kemungkinan mekanisme yang mana fasa ingatan dialihkan daripada penyatuan semula kepada kepupusan semasamendapatkan semula ingatan ketakutan. Dalam erti kata lain, ada kemungkinan bahawa proses peralihan memori secara aktif mengawal suis ini.

Dalam tugas pengelakan perencatan (IA), tikus menerima kejutan kaki elektrik selepas mereka memasuki petak gelap dari petak terang dan membentukingatanuntuk mengelakkan petak gelap. Sebelum ini, dengan menggunakan tugas ini, kami menunjukkan bahawa fasa penyatuan semula dan kepupusan boleh didiskriminasi pada titik masa apabila tetikus memasuki petak gelap dari petak cahaya semasa sesi pendedahan semula (Fukushima et al., 2014). Oleh itu, tugas ini membolehkan kita mencirikan tandatangan molekul perspektif fasa penyatuan semula dan kepupusan, berbeza dengan paradigma pelaziman ketakutan kontekstual klasik di mana pengaktifan semula ingatan ketakutan terkondisi dengan pendedahan semula kepada CS memulakan kedua-dua penyatuan semula dan kepupusan; pendedahan semula pendek (3 minit) kepada konteks terkondisi mendorong penyatuan semula, manakala pendedahan semula yang panjang (30 minit) atau berulang kepada konteks ini mendorong kepupusan (Eisenberg et al., 2003; Pedreira dan Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee et al., 2008; Mamiya et al., 2009). Tambahan pula, kami mendapati bahawa memori IA yang diperolehi dipertingkatkan melalui penyatuan semula ingatan dalam tugas ini (Fukushima et al., 2014).

Untuk memahami mekanisme peralihan daripada penyatuan semula kepada kepupusan semasamendapatkan semula ingatan ketakutan, kami bertujuan untuk mengenal pasti dan mencirikan tandatangan molekul, selular dan tingkah laku bagi fasa penyatuan semula, peralihan dan kepupusan memori IA. Kami menganalisis pengaktifan CREB dan ERK dalam amygdala, hippocampus, dan mPFC dalam fasa penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan dan mengkaji peranan pengaktifan ERK dalam proses ingatan ini.

Bahan dan Kaedah

Tikus Semua eksperimen dijalankan mengikut Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal (Persatuan Neurosains Jepun dan Universiti Pertanian Tokyo). Semua eksperimen haiwan yang dilakukan dalam kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Universiti Pertanian Tokyo (kebenaran #280037). Semua prosedur pembedahan dilakukan di bawah anestesia Nembutal dan segala usaha dilakukan untuk meminimumkan penderitaan. Tikus C57BL/6N jantan diperolehi dari Sungai Charles. Tikus ditempatkan dalam sangkar lima atau enam, dikekalkan pada kitaran terang/gelap 12/12 jam, dan membenarkan akses kepada makanan dan air secara ad libitum. Tikus berusia sekurang-kurangnya lapan minggu ketika diuji. Pengujian dilakukan semasa fasa cahaya kitaran. Semua eksperimen dijalankan secara buta terhadap keadaan rawatan tikus.

Ujian IA Radas IA langkah-langkah (OHARA Pharmaceutical) terdiri daripada kotak dengan petak terang dan gelap yang berasingan (kedua-duanya 15.5 12.5 11.5 cm). Petak cahaya diterangi oleh lampu pendarfluor (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016). Sebelum permulaan latihan IA, tikus dikendalikan secara individu selama 2 minit setiap hari selama satu minggu. Semasa sesi latihan, setiap tetikus dibenarkan untuk membiasakan diri ke petak cahaya selama 30 saat, dan pintu guillotine dinaikkan untuk membolehkan akses ke petak gelap. Latensi untuk memasuki petak gelap dianggap sebagai ukuran pemerolehan. Sebaik sahaja tetikus memasuki ruang gelap, pintu guillotine ditutup. Selepas 5 s, satu kejutan kaki (0.2 mA) dihantar untuk tempoh 2 s (latihan). Pada 24 jam selepas sesi latihan, tetikus diletakkan semula dalam petak terang sehingga ia memasuki petak gelap (purata 459 6 15.49 s). Sejurus selepas tetikus memasuki petak gelap, pintu guillotine ditutup dan tetikus kekal dalam petak gelap untuk jangka masa yang berbeza-beza (0, 1, atau 10 min) tanpa hentakan kaki (pengaktifan semula). Memori dinilai 48 jam kemudian [ujian ingatan jangka panjang pasca pengaktifan (PR-LTM)] sebagai kependaman silang untuk tetikus memasuki petak gelap apabila diganti dalam petak cahaya, seperti dalam pengaktifan semula.

Untuk percubaan pertama, kami meneliti kesan perencatan sintesis protein selepas pengaktifan semula (pendedahan semula kepada petak gelap selama 0, 1 atau 10 min; Rajah 1). Perencat sintesis protein anisomycin (ANI; Wako) telah dilarutkan dalam salin (pH diselaraskan kepada 7.0–7.4 dengan NaOH). Tikus telah dilatih seperti yang diterangkan di atas, dan pada 24 jam kemudian, mereka menerima kenderaan (VEH) atau ANI (150 mg/kg, ip) sejurus selepas terdedah semula kepada petak gelap selama 0, 1, atau 10 minit tanpa kejutan kaki. (pengaktifan semula). Pada dos ini, ANI menghalang .90 peratus sintesis protein dalam otak semasa 2 jam pertama (Flood et al., 1973). Pada 48 jam selepas sesi pengaktifan semula, tikus individu sekali lagi diletakkan di dalam petak cahaya dan kependaman crossover dinilai.

Untuk eksperimen kedua [imunohistokimia ERK (pERK) berfosforilasi CREB (pCREB) dan terfosforilasi; Ara. 2–5], kami memeriksa kawasan otak yang diaktifkan selepas pendedahan semula kepada cahaya (sehingga tikus memasuki petak gelap, pendedahan semula kepada petak gelap selama 0 min) atau petak gelap (semula pendedahan kepada petak gelap selama 1 atau 1{17}} min). Tikus dibahagikan kepada empat Fukushima et al. · Peralihan Fasa Ingatan Ketakutan selepas Retrieval J. Neurosci., 10 Februari 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289kumpulan. Pada 24 jam selepas latihan, tikus individu didedahkan semula kepada petak cahaya dan kemudian tinggal di petak gelap berikutan kemasukan mereka dari petak gelap [pengaktifan semula: 0 min dalam petak gelap, kumpulan penyatuan semula (Recon); 1 min, kumpulan peralihan (Tran); 10 min, kumpulan kepupusan (Ext)]. Satu lagi kumpulan tikus tidak dikembalikan ke petak terang/gelap [kumpulan tidak diaktifkan semula (NR)]. Tikus kemudian dibius dengan Nembutal (750 mg/kg, ip) pada 5, 15, atau 30 minit selepas pengaktifan semula.

Untuk percubaan ketiga (microinfusion U{{20}}}126; Rajah 6,7), kami telah mengkaji kesan perencatan ERK dalam amygdala, hippocampus atau mPFC pada penyatuan semula/peningkatan memori, peralihan, dan kepupusan. Perencat MEK U0126 (Sigma-Aldrich) telah dilarutkan dalam cecair serebrospinal buatan yang mengandungi tiga titis Tween 80 (Sigma) dalam 2.5 ml 7.5 peratus dimetil sulfoksida (Wako) dan diselaraskan kepada pH 7.4 dengan NaOH. Tikus telah dilatih seperti yang diterangkan di atas, dan 24 jam kemudian, mereka diletakkan semula di dalam petak cahaya (pengaktifan semula). Tikus-tikus telah diserap secara mikro dengan U0126 (1 mg) atau VEH ke dalam pelbagai kawasan otak sejurus selepas (Rajah 6A, C, E-H, 7A-C) atau pada 30 minit selepas pengaktifan semula (Rajah 6B, D). Pada 48 jam selepas pengaktifan semula, tikus individu sekali lagi diletakkan di dalam petak cahaya dan kependaman crossover dinilai (PR LTM). Penyerapan mikro ke dalam hippocampus dan mPFC (0.5 ml) dibuat pada kadar 0.25ml/min. Penyerapan mikro ke dalam amigdala (0.2 ml) dibuat pada kadar 0.1ml/min. Kanula suntikan dibiarkan di tempat selama 2 minit selepas mikroinfusi dan tikus kemudian dikembalikan ke sangkar rumah mereka. Perencat MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) telah dibubarkan dalam dimetil sulfoksida dan dicairkan dengan garam. Tikus telah dilatih seperti yang diterangkan di atas, dan 24 jam kemudian, tikus individu diletakkan semula di dalam petak cahaya (pengaktifan semula). Tikus telah disuntik secara sistemik dengan SL327 (10 atau 20 mg/kg) atau VEH sejurus selepas pengaktifan semula (Rajah 7D–F). Pada 48 jam selepas pengaktifan semula, tikus individu sekali lagi diletakkan di dalam petak cahaya dan kependaman crossover dinilai (PR-LTM).

Imunohistokimia dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Selepas bius, semua tikus telah direndam dengan 4 peratus paraformaldehid. Otak dikeluarkan, diperbaiki semalaman, dipindahkan ke 30 peratus sukrosa, dan disimpan pada suhu 4 darjah . Bahagian koronal (30mm) dipotong dalam kriostat.

Untuk pewarnaan pCREB dan pERK, bahagian terapung bebas dirawat dengan 1 peratus H2O2 dan diinkubasi semalaman dengan antibodi poliklonal anti-phospho-CREB (serine 133; S133) arnab (1:1000; #{{10} }}, Millipore) dan/atau antibodi monoklonal anti-phospho-ERK1/2 (T202/Y204) arnab (1:300; #4370; Teknologi Isyarat Sel) dalam larutan penyekat (salinan penimbal fosfat ditambah 1 peratus albumin serum kambing, 1 mg/ml albumin serum lembu, dan 0.05 peratus Triton X-100). Bahagian itu dibasuh dengan garam penampan fosfat dan diinkubasi dengan IgG anti-arnab keldai peroksidase-konjugasi lobak pedas (1:500; Jackson ImmunoResearch) untuk pCREB atau lobak pedas peroksidase-konjugasi kambing anti-arnab IgG untuk pERK selama 1 jam pada suhu bilik. Isyarat pCREB telah dikuatkan oleh biotin tyramide dan divisualisasikan menggunakan Alexa Fluor-conjugated streptavidin (Invitrogen). Isyarat pERK telah dikuatkan dengan TSA-FCM (Invitrogen). Bahagian-bahagian itu dipasang pada slaid dan ditutup dengan menggunakan medium pelekap (Millipore).

Kuantifikasi telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008). Struktur ditakrifkan secara anatomi mengikut atlas Franklin dan Paxinos (1997). Semua neuron imunoreaktif dikira oleh penguji buta terhadap keadaan rawatan

Keputusan

Pencirian fasa ingatan selepas dapatan semula dalam tugas IA

Tugas IA membolehkan kita mendiskriminasi fasa penyatuan semula dan kepupusan pada titik masa apabila tetikus memasuki petak gelap dari petak terang (Fukushima et al., 2014). Untuk memahami mekanisme yang mendasari peralihan fasa ingatan daripada penyatuan semula kepada kepupusan, kami mencirikan fasa ingatan IA berikutan pengambilan semula ingatan dengan mengkaji kesan menghalang sintesis protein yang diperlukan untuk penyatuan semula dan kepupusan memori IA (Fukushima et al., 2014). Tikus-tikus itu mula-mula diletakkan di dalam petak cahaya. Pada 5 s selepas mereka memasuki petak gelap, kejutan elektrik ringkas telah dihantar (latihan). Tikus telah didedahkan semula kepada petak cahaya 24 jam selepas latihan (sesi pengaktifan semula; Rajah 1A) dan kependaman crossover mereka untuk memasuki petak gelap dinilai (Rajah 1B). Tikus telah dikembalikan ke dalam sangkar rumah mereka serta-merta selepas mereka masuk ke dalam petak gelap dari petak terang (0-pendedahan semula min kepada petak gelap; fasa penyatuan semula) atau tinggal di petak gelap selama 1, 3 atau 10 min tanpa menerima kejutan kaki (fasa kepupusan; Rajah 1C–E). Sejurus selepas sesi pengaktifan semula, tikus menerima suntikan sistemik VEH atau perencat sintesis protein ANI. Pada 48 jam kemudian, kependaman silang telah dinilai PR-LTM.

Selaras dengan kajian terdahulu kami (Fukushima et al., 2014), pendedahan semula kepada petak cahaya (0 kumpulan min) mendorong penyatuan semula dan peningkatan memori IA. ANOVA dua hala mendedahkan kesan ketara masa (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), dadah (F(1 ,24)=23.197, p , 0.0001) dan interaksi ubat masa (F(1,24)=25.022, p, 0.0001; Rajah 1B). Ujian Post hoc Bonferroni dan ujian t berpasangan mendedahkan bahawa kumpulan VEH dan ANI, masing-masing menunjukkan peningkatan atau penurunan yang ketara, kependaman silang pada PR-LTM berbanding dengan sesi pengaktifan semula (ps , 0.05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; Rajah 1B). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa pengambilan memori IA dalam petak cahaya meningkatkan ingatan, manakala perencatan sintesis protein mengganggu ingatan yang diperoleh, mengesahkan pemerhatian sebelumnya bahawa pengambilan memori IA meningkatkan memori melalui penyatuan semula dalam cara yang bergantung kepada sintesis protein.

Sebaliknya, pendedahan semula kepada petak gelap menyebabkan kepupusan jangka panjang [ANOVA dua hala, masa (Rajah 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Rajah 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), dadah (Rajah 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; Rajah 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), interaksi ubat masa (Rajah 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; Rajah 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], seperti yang diperhatikan sebelum ini (Fukushima et al., 2014). Kumpulan VEH yang tinggal di dalam petak gelap selama 3 atau 10 minit menunjukkan kependaman silang merentas dengan ketara pada PR-LTM berbanding dengan sesi pengaktifan semula, manakala kumpulan ANI memaparkan kependaman crossover yang setanding di PR-LTM berbanding dengan sesi pengaktifan semula dan ke Kumpulan VEH (ujian post hoc Bonferroni, ps , 0.05; ujian t berpasangan, Rajah 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, ms 0.05; Rajah 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0.0001, ANI, t(9)=1.02, ms 0.05 ). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa pendedahan semula kepada petak gelap selama 3 atau 10 minit memadamkan memori IA dan perencatan sintesis protein menyekat kepupusan jangka panjang. Oleh itu, pengambilan memori IA dalam petak gelap memadamkan memori IA dalam cara ekspresi gen-de bergantung.

Yang penting, kumpulan VEH menunjukkan kependaman silang silang yang setanding pada PR-LTM berbanding dengan sesi pengaktifan semula dan kepada kumpulan ANI apabila mereka berada di dalam petak gelap selama 1 min [ANOVA dua hala, masa (F(1,36) {{ 5}}.03, hlm. 0.05), dadah (F(1,36)=0.019, hlm. 0.05), interaksi ubat masa (F(1,36)=0.011, ms 0.05); ujian Bonferroni post hoc, ps. 0.05; ujian-t berpasangan, VEH, t(9)=0.091, hlm. 0.05, ANI, t(9)=0.328, hlm. 0.05; Rajah 1E]. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa kumpulan VEH tidak menunjukkan peningkatan atau kepupusan memori IA dan kumpulan ANI tidak menunjukkan gangguan memori IA. Oleh itu, pendedahan semula kepada petak gelap selama 1 minit menyekat kedua-dua peningkatan dan gangguan akibat ANI bagi memori IA yang diaktifkan semula, tetapi tidak memadamkan memori IA, menunjukkan bahawa pendedahan semula 1-min ini membatalkan aruhan penyatuan semula , tetapi tidak mencukupi untuk memadamkan memori IA.

Secara ringkasnya, keputusan ini menunjukkan bahawa pendedahan semula kepada petak cahaya mendorong fasa penyatuan semula, manakala pendedahan semula yang lebih lama kepada petak gelap (3 atau 10 min) mendorong fasa kepupusan. Lebih penting lagi, tinggal selama 1 minit dalam petak gelap mendorong fasa peralihan daripada penyatuan semula kepada kepupusan, yang, menghalang penyatuan semula ingatan ketakutan tanpa mendorong kepupusan.

Tandatangan molekul fasa penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan dalam amygdala, hippocampus, dan mPFC selepas pengambilan semula ingatan IA

Penyatuan semula dan kepupusan ingatan ketakutan kontekstual menunjukkan peningkatan dalam fosforilasi CREB pada S133, penanda pengaktifan ekspresi gen yang diperlukan untuk penyatuan semula dan kepupusan jangka panjang, tetapi menunjukkan dinamik berbeza fosforilasi CREB (Mamiya et al., 2009 ). Menariknya, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa tiada peningkatan dalam fosforilasi ERK, pengawal selia hulu CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001), di kawasan basolateral amygdala pada peralihan daripada penyatuan semula kepada kepupusan ingatan ketakutan isyarat, walaupun fosforilasi ini meningkat di kawasan basolateral apabila ingatan ketakutan isyarat disatukan semula dan dipadamkan (Merlo et al., 2014, 2018). Kajian lain menunjukkan bahawa ERK hippocampal diaktifkan hanya apabila ingatan ketakutan kontekstual dipadamkan, tetapi tidak disatukan semula (Tronson et al., 2009). Penemuan ini mencadangkan bahawa fasa penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan menunjukkan tandatangan molekul dan selular yang berbeza. Oleh itu, kami mengukur dan membandingkan tahap pCREB dan pERK dalam fasa penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan menggunakan imunohistokimia. Kami melakukan jadual eksperimen yang sama seperti dalam Rajah 1B, D, E menggunakan empat kumpulan eksperimen. Tikus telah didedahkan semula kepada petak cahaya pada 24 jam selepas latihan dan kemudian tinggal di petak gelap [pengaktifan semula: 0 min dalam petak gelap, kumpulan penyatuan semula (Recon); 1 min, kumpulan peralihan (Tran); 10 min, kumpulan kepupusan (Ext)]. Satu lagi kumpulan tikus tidak dikembalikan ke petak terang/gelap (tidak diaktifkan semula, kumpulan NR). Kami mengira neuron pCREB-positif (pCREB1), neuron pERK-positif (pERK1), dan neuron berganda positif (pCREB1 / pERK1) dalam amygdala, hippocampus, dan mPFC pada 30 minit selepas sesi pengaktifan semula.

Amygdala (rantau sisi) CREB telah diaktifkan dalam fasa kepupusan dan penyatuan semula, manakala ERK hanya diaktifkan dalam fasa kepupusan (Rajah 2A–C). ANOVA sehala mendedahkan kesan ketara kumpulan (Rajah 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Sama seperti penemuan sebelumnya (Mamiya et al., 2009), ujian post hoc Newman-Keuls mendedahkan bahawa kumpulan Recon dan Ext menunjukkan lebih banyak neuron pCREB1 daripada kumpulan lain (p, 0.05). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa sama seperti pemerhatian pada tahap tingkah laku (Rajah 1), pendedahan kepada petak gelap selama 1 minit (fasa peralihan) membatalkan "menghidupkan" fosforilasi CREB yang akan ditingkatkan dalam fasa penyatuan semula. Sebaliknya, lebih banyak neuron pERK1 diperhatikan dalam kumpulan Ext berbanding kumpulan lain, walaupun terdapat lebih sedikit neuron pERK1 daripada neuron pCREB1 dalam kumpulan Ext (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; Rajah 2C).

Secara konsisten, lebih banyak neuron positif berganda (pCREB1/pERK1) diperhatikan dalam kumpulan Ext (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; Rajah 2D), manakala lebih banyak neuron pCREB1/ pERK– (pCREB tunggal positif) diperhatikan dalam kumpulan Recon dan Ext (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; Rajah 2E). Oleh itu, fasa penyatuan semula menunjukkan hanya satu populasi pCREB1 / pERK- neuron. Sebaliknya, fasa kepupusan menunjukkan dua populasi pCREB1 / pERK- dan pCREB1 / pERK1 neuron, menunjukkan bahawa ERK diaktifkan hanya dalam subset neuron pCREB1. Yang penting, keputusan yang sama diperhatikan di kawasan basolateral amygdala (Rajah 2G, F(3,29)=13.042, p, 0.0001; Rajah 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Rajah 2I, F(3,29)=12.633, p , 0.0001; Rajah 2J, F(3,29)=12 .505, hlm , 0.0001).

Pengaktifan dwifasa ERK dalam fasa kepupusan ERK ialah pengaktif huluan CREB dan oleh itu, pengaktifan ERK diperlukan untuk penyatuan dan penyatuan semula ingatan ketakutan (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci et al., 2005). Walau bagaimanapun, secara tidak konsisten, tiada pengaktifan ERK diperhatikan dalam amygdala, hippocampus atau mPFC dalam fasa penyatuan semula apabila pERK diukur pada 30 min selepas sesi pengaktifan semula (Rajah 2-4). Oleh itu, kami mengkaji kursus masa fosforilasi ERK dan CREB. Kami melakukan percubaan serupa seperti dalam Rajah 2-4, kecuali tahap pCREB dan pERK diukur pada 5, 15 dan 30 min selepas sesi pengaktifan semula (pendedahan semula kepada petak gelap untuk {{ 66}}, 1 atau 10 min; Rajah 5A). Selaras dengan data yang ditunjukkan dalam Rajah 2-4, peningkatan ketara dalam neuron pCREB1 diperhatikan pada 30 minit, tetapi tidak pada 5 minit, selepas sesi pengaktifan semula dalam Recon (amygdala, mPFC dan hippocampus) dan Ext (amygdala dan mPFC ) kumpulan, tetapi bukan kumpulan Tran (Rajah 5E, ANOVA sehala, amygdala, 5 min, F(3,23)=0.346, ms 0.05, 30 min, F(3,23)=15.272, p , 0.0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1.169, ms 0.05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p , 0.0001; hippocampus, 5 min, F(3,23)=0.154, ms 0.05, 30 min, F(3,23)=16.197, p , 0.0001; ujian t tidak berpasangan, amygdala, penyatuan semula, 5 lwn 30 min, t(12)=7.807, p , 0.0001, kepupusan, 5 lwn 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, penyatuan semula, 5 lwn 30 min, t(12)=5.727, p , 0.0001, kepupusan, 5 lwn 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; rantau CA1 hippocampal, penyatuan semula, 5 lwn 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Menariknya, peningkatan ketara dalam neuron pERK1 diperhatikan dalam amygdala, mPFC dan hippocampus kumpulan Recon, Tran, dan Ext pada 5 minit selepas sesi pengaktifan semula berbanding dengan kumpulan NR (Rajah 5F, amygdala, F(3,23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa ERK diaktifkan serta-merta selepas sesi pengaktifan semula dalam semua fasa ingatan. Walau bagaimanapun, peningkatan dalam bilangan neuron pERK1 ini kembali ke tahap basal (setanding dengan kumpulan NR) pada 15 minit selepas sesi pengaktifan semula (Rajah 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, p 0.05; mPFC, F(3,23)=0.683, ms 0.05; hippocampus, F(3,20)=0.74, ms 0.05). Tambahan pula, selaras dengan penemuan yang ditunjukkan dalam Rajah 2-4, lebih banyak neuron pERK1 diperhatikan dalam amygdala, mPFC, dan hippocampus pada 30 minit selepas sesi pengaktifan semula hanya dalam kumpulan Ext (Rajah 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Oleh itu, fasa penyatuan semula dan peralihan menunjukkan pengaktifan sementara ERK hanya pada titik masa awal (5 min), manakala fasa kepupusan menunjukkan pengaktifan biphasic ERK pada titik masa awal (5 min) dan lewat (30 min) selepas pengaktifan semula. sesi. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa mekanisme untuk pengawalan pengaktifan ERK berbeza dalam fasa penyatuan semula/ peralihan dan kepupusan. Secara kolektif, pemerhatian kami menunjukkan bahawa fasa penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan menunjukkan tandatangan molekul yang berbeza.

Peranan pengaktifan ERK dalam penyatuan semula dan fasa kepupusan memori IA

Fasa penyatuan semula/peralihan dan kepupusan masing-masing menunjukkan pengaktifan ERK monophasic dan biphasic. Kami seterusnya menyiasat dan membandingkan peranan pengaktifan ERK awal (5 minit) dan lewat (30 minit) dalam mPFC dalam fasa penyatuan semula dan kepupusan dengan mengkaji kesan menghalang ERK (Rajah 6).

Perbincangan

Dalam kajian ini, kami menyiasat mekanisme untuk peralihan ingatan daripada penyatuan semula kepada fasa kepupusan selepas pengambilan semula memori IA. Kami mula-mula mencirikan tandatangan tingkah laku fasa ingatan IA selepas pengambilan semula. Selaras dengan kajian terdahulu kami (Fukushima et al., 2014), penyatuan semula dan kepupusan yang disebabkan pengambilan semula memori IA dengan pendedahan semula kepada cahaya (0 min dalam petak gelap) dan gelap ( 3 atau 10 min) petak, masing-masing. Menariknya, ingatan IA tidak dipertingkatkan atau dipadamkan dan menunjukkan ketahanan terhadap perencatan sintesis protein apabila tikus didedahkan semula kepada petak gelap selama 1 minit sahaja. Oleh itu, pemerhatian ini mencadangkan bahawa 1-min pendedahan semula kepada petak gelap membatalkan aruhan penyatuan semula, tetapi tidak mencukupi untuk memadamkan memori IA. Tambahan pula, kami mendapati bahawa ERK telah diaktifkan dalam amygdala, hippocampus, dan mPFC pada titik masa awal (5 min) selepas pendedahan semula kepada petak gelap selama 0, 1, atau 10 min. Secara konsisten, perencatan ERK di kawasan otak ini menyekat penyatuan semula / peningkatan dan kepupusan memori IA. Paling penting, perencatan ERK dalam amygdala, hippocampus dan mPFC berikutan 1-min pendedahan semula kepada petak gelap menghalang peningkatan pengantaraan penyatuan semula memori IA, mencadangkan pengaktifan ERK berikutan pendedahan semula ringkas (1 min) ke petak gelap diperlukan untuk menghalang penyatuan semula ingatan IA. Sebaliknya, 1-pendedahan semula min kepada petak gelap tidak mencukupi untuk memadamkan memori IA, walaupun pendedahan semula yang dilanjutkan kepada petak gelap (3 atau 10 min) memadamkan memori ini. Oleh itu, keputusan kami mencadangkan bahawa 1-min pendedahan semula kepada petak gelap mendorong proses peralihan memori yang membatalkan penyatuan/peningkatan semula tetapi tidak memulakan pembelajaran kepupusan. Secara kolektif, kami mencadangkan bahawa proses peralihan memori menyumbang kepada peralihan fasa ingatan daripada penyatuan semula kepada kepupusan melalui pencegahan penyatuan semula yang dimediasi ERK.

Sama seperti pemerhatian semasa kami, kajian baru-baru ini menggunakan penyaman ketakutan pendengaran menunjukkan bahawa persembahan CS tunggal (1) atau berpanjangan (10) mendorong penyatuan semula dan kepupusan memori, masing-masing, melalui peningkatan tahap pERK di kawasan basolateral amygdala. Sebaliknya, persembahan CS pertengahan (4-7) tidak mengubah tahap pERK di kawasan basolateral amygdala. Yang penting, perencatan ERK pada pembentangan CS perantaraan tidak menjejaskan ingatan ketakutan. Kajian ini mencadangkan bahawa terdapat peralihan fasa ingatan daripada penyatuan semula kepada kepupusan selepas pengambilan semula ingatan ketakutan (Merlo et al., 2018). Dalam kajian ini, kami melanjutkan penemuan ini dan mencadangkan bahawa fasa peralihan secara aktif menukar fasa ingatan daripada penyatuan semula kepada kepupusan melalui pengaktifan laluan transduksi isyarat ERK. Berbeza dengan penemuan sebelumnya (Merlo et al., 2018), kami mendapati bahawa fasa peralihan melibatkan fosforilasi ERK dalam amygdala, hippocampus, dan mPFC. Percanggahan ini mungkin kerana perbezaan titik masa yang memeriksa fosforilasi ERK; kajian terdahulu mengukur tahap pERK pada; 12 minit selepas pembentangan CS (Merlo et al., 2018), manakala kajian kami menunjukkan bahawa peningkatan tahap pERK kembali ke tahap asas pada sekitar titik masa ini (15 minit selepas pendedahan semula). Di samping itu, adalah penting untuk ambil perhatian bahawa tugas IA membolehkan pemerhatian peningkatan memori IA melalui penyatuan semula, dengan itu membawa kepada penemuan kami bahawa perencatan ERK pada fasa peralihan menghalang peningkatan memori IA.

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa fosforilasi ERK meningkat di kawasan basolateral amygdala pada 20-60 minit selepas pembelajaran kepupusan ingatan ketakutan isyarat (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), manakala hippocampus menunjukkan pengaktifan ini pada 1 jam berikutan pembelajaran kepupusan ingatan ketakutan kontekstual (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). Dalam kajian ini, kami memperoleh pemerhatian yang sama bahawa pERK meningkat pada 30 minit selepas sesi pengaktifan semula dalam fasa kepupusan. Penemuan ini mencadangkan bahawa fosforilasi ERK adalah tandatangan molekul biasa fasa kepupusan lewat (20-60 min).

Tambahan pula, kami mendapati bahawa pengaktifan ERK berlaku secara dwifasa pada titik masa awal dan lewat (5 dan 30 min) selepas sesi pengaktifan semula dalam fasa kepupusan, manakala pengaktifan ini berlaku secara monofasis pada titik masa awal dalam fasa penyatuan semula (Rajah 5) . Secara konsisten, menghalang ERK di kawasan otak pada titik masa fasa penyatuan semula dan kepupusan ini masing-masing menyekat penyatuan/peningkatan dan kepupusan jangka panjang (Rajah 6A, C–H). Pemerhatian ini mencadangkan bahawa pengaktifan ERK monophasic dan biphasic diperlukan untuk peningkatan pengantaraan penyatuan semula dan kepupusan memori IA, masing-masing. Adalah penting untuk diperhatikan bahawa ERK berfungsi sebagai pengawal selia huluan fosforilasi CREB. Oleh itu, pengaktifan sementara ERK dalam fasa ingatan awal mungkin, sekurang-kurangnya sebahagiannya, menyumbang kepada fosforilasi CREB ini, yang mengaktifkan ekspresi gen yang diperlukan untuk penyatuan semula dan kepupusan jangka panjang.

Sama seperti penemuan kami sebelum ini menggunakan penyesuaian ketakutan kontekstual (Mamiya et al., 2009), CREB telah diaktifkan dalam penyatuan semula (amygdala / hippocampus / mPFC) dan fasa ingatan kepupusan (amygdala / mPFC), manakala ERK diaktifkan hanya dalam fasa kepupusan pada 30 minit selepas sesi pengaktifan semula. Secara konsisten, hanya satu populasi neuron pCREB1 / pERK- diperhatikan dalam fasa penyatuan semula, manakala populasi neuron yang berbeza diperhatikan dalam fasa kepupusan: neuron pCREB1 / pERK- dan pCREB1 / pERK1 dalam amygdala (Rajah 2); neuron pCREB– /pERK1 dalam hippocampus (Rajah 3); dan neuron pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 dan pCREB1/pERK1 dalam mPFC (Rajah 4). Pemerhatian ini, terutamanya pemerhatian kontras pCREB-/ pERK1 dan pCREB1/pERK- neuron, mencadangkan bahawa pengaktifan CREB dan ERK dikawal secara berbeza di setiap kawasan otak apabila ingatan dipadamkan dan pengaktifan fasa akhir ERK memainkan peranan yang spesifik dan berbeza. peranan untuk kepupusan ingatan ketakutan berbanding dengan proses ingatan lain seperti penyatuan dan penyatuan semula seperti yang dibincangkan di bawah. Menariknya, kami mendapati bahawa neuron pERK1 lebih banyak dalam mPFC berbanding dengan hippocampus dan amygdala, kerana mPFC menunjukkan nisbah neuron pERK1 yang lebih tinggi (fasa kepupusan) dan neuron pCREB1 (fasa penyatuan semula) berbanding dengan hippocampus dan amygdala, menunjukkan bahawa pengaktifan ERK dalam mPFC memainkan peranan yang lebih khusus dalam kepupusan ingatan.

Masih tidak jelas sama ada populasi neuron yang sama atau berbeza diaktifkan dalam fasa penyatuan semula, peralihan, dan ingatan kepupusan. Kajian terdahulu mengenal pasti pengaktifan "neuron ketakutan" dan "neuron kepupusan" dalam amygdala apabila ingatan ketakutan isyarat diaktifkan semula atau dipadamkan, masing-masing (Herry et al., 2008). Oleh itu, ada kemungkinan ERK dan CREB diaktifkan dalam populasi neuron yang berbeza dengan profil temporal yang berbeza (iaitu, "neuron penyatuan semula" dan neuron kepupusan). Seperti yang dibincangkan di atas, neuron pCREB1, termasuk neuron pCREB1 / pERK1, boleh mengawal penyatuan semula dan kepupusan jangka panjang memori IA melalui pengaktifan ekspresi gen sebagai neuron penyatuan semula dan kepupusan, masing-masing. Sebaliknya, pengaktifan ERK dalam neuron pCREB– / pERK1 boleh menyumbang kepada pembatalan pengaktifan transkrip pengantara CREB yang diperlukan untuk penyatuan semula kerana pengaktifan ERK ini diperhatikan secara khusus dalam fasa kepupusan lewat; ERK telah diaktifkan dalam neuron penyatuan semula untuk membatalkan pengaktifan ekspresi gen dalam fasa kepupusan. Menariknya, kajian terdahulu menunjukkan bahawa pengaktifan ERK hippocampal menghalang induksi c-fos apabila ingatan ketakutan kontekstual dipadamkan (Guedea et al., 2011), meningkatkan kemungkinan pengaktifan ERK ini menentang laluan isyarat CREB. Adalah penting untuk mengenal pasti populasi neuron yang mengawal penyatuan semula, peralihan, dan kepupusan dan untuk menyiasat tandatangan molekul dan kepentingan fungsi neuron tersebut. Selain itu, interaksi antara populasi saraf yang dikenal pasti dalam kajian ini masih tidak diketahui. Ada kemungkinan bahawa "neuron kepupusan (peralihan)" memodulasi fungsi neuron penyatuan semula untuk membatalkan menghalang penyatuan semula melalui interaksi antara mereka (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Oleh itu, adalah penting juga untuk mengkaji interaksi ini di dalam dan di antara amygdala, mPFC, dan hippocampus.

Sebelum ini, kami menunjukkan bahawa hippocampus tidak menunjukkan perubahan fosforilasi CREB dan ekspresi Arka berikutan pembelajaran kepupusan ketakutan kontekstual, dan secara konsisten, perencatan sintesis protein dalam hippocampus dalam fasa kepupusan gagal menyekat kepupusan jangka panjang (Mamiya et al. , 2009). Pemerhatian ini telah menimbulkan kemungkinan bahawa hippocampus tidak diperlukan untuk kepupusan jangka panjang. Walau bagaimanapun, kami menunjukkan bahawa ERK diaktifkan dalam hippocampus selepas pembelajaran kepupusan memori IA, dan secara konsisten, menyekat pengaktifan ERK dalam hippocampus menjejaskan kepupusan jangka panjang. Oleh itu, pemerhatian semasa kami menunjukkan peranan penting untuk hippocampus dalam kepupusan ingatan. Diambil bersama dengan penemuan kami sebelum ini, kami mencadangkan bahawa hippocampus diperlukan untuk kepupusan ingatan tetapi bukan untuk proses seperti penyatuan untuk menstabilkan "ingatan kepupusan" melalui pengaktifan ekspresi gen.