Strategi Novel Untuk Menyaring Komponen Aktif dalam Cistanche Tubulosa Berdasarkan Analisis Perhubungan Kesan Spektrum Dan Farmakologi Rangkaian Ⅱ

3. Keputusan dan perbincangan

3.1. Cap Jari HPLC

3.1.1. Pengesahan Kaedah

Pengesahan untuk kaedah HPLC menunjukkan bahawa sisihan piawai relatif (RSD) untuk ketepatan kaedah, kebolehulangan dan kestabilan adalah kurang daripada 2.85 peratus untuk kawasan puncak relatif (n = 11) dan 0.77 peratus untuk masa pengekalan relatif (n = 11). Ketepatan penyelesaian sampel yang sama muncul dalam julat 0.05–{{10}}.77 peratus untuk masa relatif dan 0.28– 2.70 peratus untuk kawasan relatif puncak biasa. Kebolehulangan percubaan adalah dalam julat 0.03–0.20 peratus untuk masa relatif dan 0.23–2.59 peratus untuk luas relatif puncak biasa. Kestabilan sampel adalah 0.09-0.24 peratus untuk masa pengekalan relatif dan 0.75-2.85 peratus untuk kawasan relatif puncak biasa. Keputusan ini menunjukkan bahawa cap jari yang ditetapkan telah berpuas hati. Hubungan linear untuk asid geniposidic,echinacoside, acteoside, tubuloside A, danisoacteosideditunjukkan dalam Jadual S4. Nilai segi empat sama R ialah 1.0000, menunjukkan kelinearan yang baik. Keputusan pemulihan sampel menunjukkan purata pemulihan asid geniposidic, echinacoside,acteoside, tubuloside A, danisoacteosideialah 100.37 peratus , 103.59 peratus , 98.46 peratus , 100.81 peratus dan 101.19 peratus , dan RSD untuk pemulihan sampel adalah kurang daripada 2.68 peratus .

Klik Di Sini untuk Mendapatkan butiran lanjut tentang Komponen Aktif Cistanche

3.1.2. Kawasan Puncak (PA) dan Masa Pengekalan Relatif (RRT)

Cap jari rujukan dan cap jari HM, WE, dan HR daripada 11 kelompok C. tubulosa dibentangkan dalam Rajah 2. Sebelas puncak, yang menunjukkan pemisahan dan resolusi yang baik, telah dikenal pasti sebagai puncak biasa di kalangan HM, WE dan HR. Lima sebatian piawai telah dikenal pasti sebagai asid geniposidik (A2),echinacoside(A8),acteoside (A9), tubulosideA (A10), danisoacteoside(A11). Sebatian piawai,echinacoside, yang terdapat dalam semua kromatogram (purata masa pengekalan 12.86 min) dengan kawasan puncak yang sesuai dan kestabilan yang baik, telah dipilih sebagai puncak rujukan dan digunakan untuk mengira masa pengekalan relatif (RRT) bagi sepuluh yang lain puncak biasa. RRT bagi bentuk berbeza ini berada dalam julat 0.16–1.51. PA dan pekali varians (peratus CV ) bagi puncak biasa ini disenaraikan dalam Jadual S5–S7. Daripada data, nilai peratus CV untuk PA dalam pelbagai bentuk adalah masing-masing 25.78 peratus –142.02 peratus , 23.36 peratus –150.38 peratus dan 28.91 peratus –112.78 peratus untuk HM, WE dan HR. Keputusan ini mendedahkan perbezaan ketara dalam kepekatan setiap satuCistanche tubulosakompaun antara bentuk yang berbeza. Cap jari HM, WE, dan HR ditunjukkan dalam Rajah 3.

Rajah 2 Cap jari HPLC sampel standard

3.1.3. Kandungan HM, WE, dan HR

Lima juzuk piawai bagiC. tubulosatelah diukur. Kandungan komponen utama ditunjukkan dalam Jadual 1. Perbandingan antara HM, WE, dan HR ditunjukkan dalam Jadual 2 dan Rajah 4. PhG dalam C. tubulosa adalah aktif secara biologi tetapi termosensitif. Komponen sensitif haba yang larut dalam air boleh diekstrak dengan cekap menggunakan kaedah yang munasabah. Secara amnya, herba Cistanche diekstrak dengan air dan kemudian disejat ke dalam larutan pekat untuk analisis kimia berikut [26, 27, 30]. Selepas pengekstrakan dan kepekatan, teknologi pengeringan semburan digunakan dan prosedur telah diubah suai daripada artikel sebelumnya. Air dengan cepat dikeluarkan dari wap cecair, dan kemudian ekstrak kering bahan mentah dari tumbuhan diperolehi. Dalam langkah ini, menambah maltodekstrin dianggap sebagai pembawa biasa untuk meningkatkan penyebaran dan memanjangkan masa penyimpanan. Melalui satu siri proses pembuatan, tumbuhan herba kemudiannya ditekan ke dalam butiran formula dengan bahan tambahan. Langkah menambah eksipien ini tidak disertakan dalam percubaan. Secara umumnya, proses pengeluaran kami termasuk pengekstrakan, kepekatan dan pengeringan semburan, seperti yang diterangkan dalam Bahagian 2.2, selari dengan proses pengeluaran butiran formula. Untuk menghasilkan produk separuh siap ini, tiga langkah di atas mesti diikuti. Prosedur membentuk WE melibatkan kepekatan dan pengeringan semburan, yang dengan mudah menyebabkan kehilangan komponen termosensitif, tetapi HR diperoleh selepas pengekstrakan dan pengeringan HM. Kami tertanya-tanya sama ada terdapat kemungkinan komponen aktif kekal dalam HR. Menurut keputusan kami, kandungan verbascoside berkurangan dengan ketara daripada HM kepada WE dan HR ( dan , masing-masing). Kestabilan terma verbascoside disiasat dengan memantau perubahan kawasan puncak melalui HPLC semasa proses pemanasan. Selepas dipanaskan selama 4 jam, 41.6 peratus verbascoside tertinggal. Ia menunjukkan bahawa verbascoside adalah termosensitif [31]. Isoacteoside, tubuloside A, dan echinacoside dalam WEs kekal stabil selepas prosedur pemprosesan yang kompleks. Semasa proses pengeringan jangka panjang, pengumpulan PhG menunjukkan penurunan yang ketara, yang mungkin dikaitkan dengan kemerosotan haba komponen termosensitif ini [32]. Dari segi komponen sasaran lain, HR dan WE tidak berbeza dengan ketara kecuali verbascoside. Pemahaman kami tentang perbezaan ini akan membolehkan kami membangunkan standard kualiti yang lebih baik untuk ampas herba pada masa hadapan dan memajukannya kepada produk.

Jadual 1 Kandungan 11 kelompok C. tubulosa

Jadual 2 Perbandingan kandungan komponen utama (n = 11).

,

Rajah 4 Penentuan kandungan lima komponen daripada bentuk yang berbeza (n = 11). , ns: tidak ketara.

3.1.4. Analisis Kesamaan Cap Jari

Persamaan antara tiga kumpulan C. tubulosa telah dinilai. Nilai persamaan bahan herba-air, bahan herba-sisa herba dan ekstrak air-sisa herba adalah dalam julat 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995, dan 0.938–1.000, masing-masing (Jadual 3).

Jadual 3 Persamaan HM-WE, HM-HR dan WE-HR untuk 11 kelompok C. tubulosa.

3.2. Keputusan Ujian Aktiviti Antioksidan

Aktiviti antioksidan pelbagai bentuk C. tubulosa telah ditentukan menggunakan ujian kapasiti DPPH, , dan scavenging, dan keputusan yang berkaitan dibentangkan dalam Rajah 5. Dalam Jadual S8, julat untuk DPPH, dan keputusan ujian kapasiti scavenging ialah { {2}}.04–37.80, 0.98–843.90 dan 0.32–27.65 mg/mL untuk tiga bentuk berbeza antara 11 kelompok C. tubulosa. Dalam tiga ujian aktiviti antioksidan, HM dan WE mempamerkan aktiviti perencatan rapat, manakala HR menunjukkan perencatan paling lemah.

WE yang dikeringkan dengan semburan didapati menunjukkan aktiviti penting walaupun pada kepekatan rendah. Laporan sebelumnya menunjukkan bahawa Vernonia amygdalina WE yang dikeringkan semburan mencapai 50 peratus perencatan scavenging pada 0.17 mg/mL [33]. Penggunaan masa pengekstrakan yang panjang dan suhu tinggi adalah pedang bermata dua. Di satu pihak, meningkatkan masa pengekstrakan dan suhu salur pengering semburan meningkatkan hasil dan kecekapan. Selain itu, ekstrak mencapai aktiviti antioksidan yang kuat dan kepekatan komponen biologi yang lebih tinggi daripada tumbuhan tersebut [34]. Sebaliknya, udara masuk yang terlalu panas merendahkan sebatian bioaktif. Suhu masuk udara yang meningkat sedemikian menyebabkan kehilangan aktiviti ekstrak Bidens pilosa antioksidan dan dikaitkan dengan penurunan dalam sebatian fenolik [35]. Keputusan sekarang adalah konsisten dengan laporan yang disebutkan di atas. Sebagai contoh, WE dalam S6 mempamerkan kebolehan perencatan radikal yang lebih lemah daripada kedua-dua HM dan HR. Tambahan pula, HR dalam S5 mempamerkan kebolehan DPPH dan anion superoksida yang lebih kuat daripada HM dan WE. Struktur PhG terdiri daripada ikatan glikosidik dan kumpulan asetil yang mudah dihidrolisiskan di bawah tindakan enzimatik atau terurai pada suhu tinggi. Tindak balas ini mungkin menyumbang kepada penurunan dalam beberapa komponen utama semasa pengeluaran berskala besar. Walau bagaimanapun, hidrolisis atau pengisomeran komponen tertentu mungkin mempercepatkan sintesis komponen lain. Transformasi sedemikian adalah biasa apabila memproses herba Cistanches [36–38]. PhG adalah larut air membayangkan bahawa kebanyakan komponen biologi boleh digunakan melalui pengekstrakan air. Pertikaian bahawa majoriti komponen aktif kekal dalam WE telah berterusan selama beberapa dekad, jadi nampaknya munasabah untuk mengandaikan bahawa bahan sisa basah boleh dibuang selepas pengekstrakan. Walau bagaimanapun, adalah tidak betul untuk menganggap HR C. tubulosa sebagai sisa. Penyelidik menunjukkan bahawa PhGs tidak stabil, dan mereka terdedah kepada degradasi enzimatik atau hidrolitik [39]. Reaksi hidrolisis atau pengisomeran yang menyumbang kepada penurunan bahan biologi dalam fitoperubatan semasa pemprosesan mungkin pada masa yang sama memberikan peluang baharu untuk mengeksploitasi HR. Dengan menukar kaedah pengekstrakan tradisional, sisa ubat boleh dibangunkan dan digunakan dengan lebih berkesan. Hidrolisis enzimatik dilakukan untuk menukar sisa ginseng Panax kepada gula mono. Hasil polisakarida dan ginsenosida meningkat, seperti gula, asid suksinik, polisakarida ginseng, dan ginsenosida [40]. Sisa Sophora flavescens diekstrak semula oleh gelombang ultrasonik dengan etil asetat [41]. Teknologi terkini untuk menggunakan sisa herba diringkaskan oleh Huang et al. [42].

Berdasarkan keputusan PLSR dan BCA, lima puncak teratas dalam bentuk yang berbeza telah disaring menggunakan DPPH, anion superoksida, dan ujian scavenging radikal hidroksil untuk mengenal pasti puncak yang paling penting. Hasilnya digambarkan dalam carta Venn (Rajah 7). A2, A6, A8, dan A10 ialah puncak biasa yang dikongsi oleh HM, WE, dan HR (Rajah 7(a) dan 7(c)) dalam anion superoksida dan ujian scavenging radikal hidroksil, manakala HM, WE, dan Bahagian HR tiada puncak ujian DPPH. Sementara itu, model BCA menunjukkan bahawa A1, A2, A3, dan A6 adalah puncak biasa yang dikongsi oleh HM, WE, dan HR (Rajah 7(d)–7(f)). Terutamanya, pertindihan dalam rajah Venn menunjukkan bahawa model BCA kelihatan lebih sesuai daripada model PLSR, yang pertama menunjukkan lebih banyak pengulangan. Pekali model BCA dan nilai IC50 keupayaan antioksidan telah dianalisis melalui RDA. Seperti yang ditunjukkan oleh RDA dalam Rajah 8, A1, A3, dan A6 daripada HM dan HR berkaitan secara positif dengan indeks antioksidan, kecuali A3 berkaitan secara negatif dengan kapasiti pemusnahan radikal hidroksil. A1 dan A6 dari WE mempunyai korelasi yang kuat dengan DPPH dan anion superoksida. Puncak A6 yang dicatatkan daripada pelbagai bentuk mempamerkan sambungan paling kuat kepada DPPH, anion superoksida, dan radikal hidroksil. A1 dan A3 juga mempamerkan sambungan yang serupa.

Rajah 7

Gambar rajah Venn model PLSR dan BCA: (a) ujian DPPH. (b) ujian scavenging. (c) ujian scavenging dianalisis oleh model PLSR. (d) ujian DPPH. (e) ujian scavenging. (f) ujian scavenging dianalisis oleh model BCA. Bahagian bertindih ialah serpihan puncak biasa oleh HM, WE, dan HR.

3.4. Analisis Berasaskan Farmakologi Rangkaian

3.4.1. Pembinaan Rangkaian CT

Sebanyak 4359 sasaran yang berkaitan dengan aktiviti antioksidan diperoleh daripada pangkalan data GeneCards dan pangkalan data OMIM. Pada masa yang sama, komponen aktif telah disaring daripada pangkalan data TCMSP dan pangkalan data SwissTargetPrediction. Kemudian, 198 sasaran telah dikumpulkan dan diseragamkan melalui pangkalan data UniPort. Terdapat 159 gen sasaran yang dikongsi oleh komponen aktif dan penyakit berkaitan antioksidan (lihat Rajah S1). Rangkaian CT telah dibina untuk menggambarkan korelasi antara sebatian dan sasaran gen utama (Rajah 9).

Rajah 9 Rangkaian CT. Rangkaian menunjukkan korelasi antara komponen aktif dan sasaran gen utama.

3.4.2. Pembinaan Rangkaian PPI dan Penapisan Sasaran Utama

PPI telah divisualisasikan menggunakan pangkalan data STRING (Rajah 10). Rangkaian ini termasuk 159 nod dan 2528 tepi. Dalam keseluruhan rangkaian interaksi, komponen penghubung atau nod dengan lebih banyak titik sasaran mungkin merupakan komponen utama atau gen sasaran yang memainkan peranan antioksidan dalam C. tubulosa. Hasilnya telah dimuat turun dan diperkenalkan ke Cytoscape untuk visualisasi. Semakin tinggi nilai DC, semakin gelap warnanya, dan semakin besar nilai skor gabungan, semakin tebal tepinya. Kami mendapati bahawa RAC-alpha serine/threonine-protein kinase (AKT1), interlukin-6 (IL6), tumor necrosis factor (TNF), dan vascular endothelial growth factor A (VEGFA) terletak di tengah-tengah (Rajah 11), menunjukkan bahawa mereka adalah sasaran utama apabila komponen aktif memberikan kesan antioksidan. Dilaporkan bahawa echinacoside mengurangkan disfungsi mitokondria melalui pengawalan kinase protein diaktifkan mitogen (MAPK) dan AKT dan bentuk fosforilasi mereka [43]. Penyelidik membuat spekulasi bahawa kesan antidiabetik glikosida C. tubulosa mungkin disebabkan oleh aktiviti antioksidan PhG dengan menurunkan kawal selia sitokin proinflamasi, seperti IL-6 dan TNF- [44]. Di samping itu, echinacoside boleh menjejaskan pertumbuhan sel kanser ovari dengan merendahkan ekspresi VEGFA untuk menghalang angiogenesis [45], yang berkait rapat dengan sistem ROS untuk ROS mendorong ekspresi isyarat VEGF [46].

Rajah 10 Rangkaian PPI.

3.4.3. Analisis Pengayaan dan Penubuhan Rangkaian CTP

Sebatian antioksidan yang berpotensi bertindak ke atas pelbagai fungsi biologi, termasuk BP, CC, dan MF. Dalam Rajah 12(a), 10 laluan teratas ditunjukkan. Sasaran yang diramalkan daripada rangkaian PPI terutamanya bertindak balas kepada banyak proses biologi, seperti sebatian kitaran organik, rangsangan xenobiotik, bahan bukan organik, paras oksigen dan pengawalan positif pergerakan komponen selular. Analisis komponen selular menunjukkan bahawa gen terutamanya berkaitan dengan rakit membran, matriks ekstraselular, lumen granul rembesan, kompleks pengatur transkripsi, dan bahagian apikal sel. Sasaran ini juga terlibat dalam banyak fungsi molekul, termasuk pengikatan faktor transkripsi pengikat DNA, aktiviti homodimerisasi protein, pengikatan khusus domain protein, dan pengikatan reseptor sitokin.

Rajah 12 Analisis pengayaan: (a) Analisis pengayaan GO. (b) Analisis pengayaan KEGG.

Untuk menyiasat fungsi biologi hab utama ini, analisis pengayaan laluan telah dijalankan. Daripada hasil pengayaan KEGG, gambar rajah gelembung telah dilukis untuk menunjukkan 20 laluan teratas. Lebih besar tempat itu, lebih banyak gen dimasukkan ke dalam laluan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 12(b), laluan utama C. tubulosa adalah berkaitan dengan laluan dalam kanser, lipid dan aterosklerosis, laluan isyarat AGE-RAGE dalam komplikasi diabetes, pengaktifan reseptor karsinogenesis kimia dan laluan isyarat MAPK. Kesan C. tubulosa pada apoptosis dan homeostasis redoks selular telah disiasat. Data menunjukkan bahawa C. tubulosa boleh menjadi calon yang menjanjikan untuk terapi anti-kolon-kanser [47]. C. ekstrak deserticola ditemui pada orang yang berumur [48].

Rajah 13 menggambarkan korelasi antara laluan dan sasaran berkaitannya dan hubungan antara gen sasaran bertindih dan komponen aktif secara biologi C. tubulosa. Pandangan global rangkaian CTP telah dihasilkan, yang terdiri daripada 12 ramuan, 159 sasaran dan 20 laluan. Kebanyakan sasaran dikongsi oleh sebatian aktif calon. Bahan-bahan aktif calon dengan darjah kesalinghubungan yang tinggi ini bertanggungjawab untuk kesalinghubungan rangkaian CTP yang tinggi, terutamanya kuersetin (darjah = 131). Majoriti sasaran, seperti AKT1, IL6, TNF, dan VEGFA, dipetakan ke laluan KEGG yang dikaitkan dengan laluan dalam kanser.

Rajah 13 Rangkaian CTP.

4. Kesimpulan

Dalam kajian ini, kami terutamanya menyiasat situasi yang kompleks apabila mempertimbangkan hubungan kesan spektrum antara HM, WE, dan HR bagiC. tubulosa. Cap jari HPLC danujian antioksidandigunakan untuk mengenal pasti perbezaan antara Hs, WEs, dan HRsC. tubulosa. Menurut cap jari HPLC, 11 puncak adalah biasa di kalangan 11 kelompok Hs, WEs dan HRs. Asid Genipositic,echinacoside, verbascoside, tubuloside A, danisoacteosidedikenal pasti di antara puncak-puncak ini. Kandungan lima komponen ini ditentukan. Selain itu, kesan antioksidan daripadaC. tubulosaHs, WEs, dan HRs berbeza-beza disebabkan oleh perubahan dalam komposisi kimia yang disebabkan oleh keadaan pembuatan yang kompleks. Berdasarkan model statistik yang dipelbagaikan, kajian perhubungan kesan spektrum menunjukkan bahawa puncak A6 mungkin merupakan komponen yang paling menentukan antara tiga bentukC. tubulosa. Kajian ini berdasarkan farmakologi rangkaian untuk meneroka mekanisme potensiC. tubulosapadaantioksidamelalui penapisan sebatian, ramalan sasaran utama, pembinaan rangkaian, dan pengaliran analisis pengayaan. Keputusan kami menyediakan asas teori untuk mengitar semula sisa herba dan potensiC. tubulosadalam rawatanpenyakit berkaitan antioksidan.