Skrin Novel Untuk Pengatur Ekspresi Protein Telomerik TRF2 Mengenalpasti Molekul Kecil Yang Menjejaskan Imunosupresi Bergantungan TRF2 Dan Pertumbuhan Tumor

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Ringkasan ringkas:Protein telomerik TRF2 (faktor pengikat berulang Telomerik 2) dikawal dalam kanser manusia dan dikaitkan dengan prognosis yang buruk. Sifat onkogenik TRF2 bergantung pada peranan pelindung telomere intrinsiknya, tetapi juga pada kesan sel-ekstrinsik melalui aktiviti imunosupresif dan angiogenik. Oleh itu, penyasaran TRF2 muncul sebagai strategi anti-kanser terapeutik yang menjanjikan. Dalam kajian ini, kami membangunkan kaedah berasaskan sel untuk menyaring perencat TRF2 yang membolehkan kami mengenal pasti dua sebatian yang menumpulkan sifat pro-onkogenik TRF2 dalam vivo.

Abstrak: Telomeric repeat-binding factor 2 (TRIF2) ialah subunit kompleks protein shelterin, yang mengikat dan melindungi telomer daripada pengaktifan tindak balas kerosakan DNA (DDR) yang tidak diingini. Ekspresi TRF2 memainkan peranan penting dalam penuaan dan kanser, dikurangkan semasa penuaan selular dan terlalu tertekan semasa onkogenesis. Kanser yang mengekspresikan TRF2 secara berlebihan sering menunjukkan prognosis yang buruk. Dalam sel kanser, TRF2 memainkan pelbagai fungsi, termasuk perlindungan telomere dan peranan autonomi bukan sel, menggalakkan neo-angiogenesis dan imunosupresi.puritans vitamin cKami membentangkan di sini strategi penyaringan asal, yang membolehkan pengenalpastian molekul kecil yang mengurangkan atau meningkatkan ekspresi TRF2. Dengan menyaring perpustakaan kecil ubat-ubatan yang diluluskan Agensi Makanan dan Dadah (FDA), kami mengenal pasti dua molekul (AR-A014418dan alexidine-2HCl) yang menjejaskan pertumbuhan tumor, neo-angiogenesis dan imunosupresi dengan merendahkan ekspresi TRF2 dalam tetikus model xenograf. Keputusan ini menyokong strategi kemoterapeutik untuk merendahkan ekspresi TRF2 untuk merawat tumor manusia yang agresif dan mengesahkan ujian berasaskan sel ini yang mampu menyaring molekul anti-kanser dan anti-penuaan yang berpotensi dengan memodulasi tahap ekspresi TRF2.

Kata kunci:TRF2; kanser; penuaan; ujian saringan berasaskan sel; neo-angiogenesis; penindasan imun

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Telomere ialah struktur nukleoprotein khusus yang terdapat pada hujung kromosom linear yang dikawal oleh faktor berkaitan telomer seperti telomerase, kompleks protein shelterin dan RNA yang mengandungi ulangan telomer bukan pengekodan [1]. Apabila dikawal dengan betul, telomer melindungi kromosom daripada ketidakstabilan dan penuaan. Pemendekan DNA telomerik berlaku sebagai sebahagian daripada perkembangan fisiologi dan penuaan yang diprogramkan [2]. Walau bagaimanapun, pemendekan DNA telomer yang berlebihan mendorong sindrom progeroid yang jarang berlaku, seperti dyskeratosis congenita [3]. Selain itu, keadaan telomere yang tidak terkawal terlibat dalam pelbagai penyakit yang biasa berlaku di seluruh populasi umum, termasuk hampir semua jenis kanser dan beberapa penyakit degeneratif [4]. Oleh itu, membangunkan rawatan farmakologi untuk menyasarkan komponen telomere tertentu menjanjikan untuk mencegah dan merawat penyakit tersebut.

Setakat telomer dan kanser, pusat pemeriksaan tindak balas kerosakan DNA (DDR) yang penting kadangkala gagal; ini boleh membawa kepada pemendekan DNA telomerik yang berlebihan dan penyusunan semula kromosom yang menyimpang, yang seterusnya boleh menyumbang kepada onkogenesis. Tambahan pula, regulasi telomerase adalah peristiwa penting dalam pembangunan kira-kira 90 peratus daripada semua kanser, kerana ini boleh memberikan pertumbuhan tanpa had kepada sel-sel kanser [5]. Atas sebab ini, perencatan telomerase telah menjadi sasaran beberapa kajian yang ingin membangunkan rawatan kanser [6]. Walaupun kemajuan baru-baru ini, terdapat beberapa batasan untuk penggunaan klinikal ubat anti-telomerase. Sebagai contoh, untuk menghentikan percambahan sel kanser, panjang DNA telomerik yang sangat pendek mesti dicapai, dan kesan anti-onkogenik telomer yang dipendekkan hilang jika tiada gen penekan tumor p53 [7,8]. Tempoh lag ini mengurangkan keberkesanan terapeutik dan meningkatkan kesan sampingan pro-penuaan dengan mengehadkan pembaharuan sel dan memihak kepada pengaktifan mekanisme pemanjangan telomere berasaskan rekombinasi alternatif [9,10].sistancheOleh itu, strategi anti-telomerase mungkin lebih sesuai untuk menyasarkan sel-sel kanser yang sudah mempunyai telomer pendek yang kritikal [11].

Selain telomerase, perubahan dalam ekspresi dan aktiviti subunit kompleks shelterin (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 dan POT1) terlibat dalam tumorigenesis, dan dalam beberapa kes secara bebas daripada panjang telomer [12-16]. Oleh itu, menyasarkan shelterin untuk rawatan kanser boleh menjadi alternatif yang menarik untuk campur tangan anti-telomerase. Subunit shel-terin TRF2 mewakili calon yang menarik; TRF2 diekspresikan secara berlebihan dalam beberapa keganasan manusia, baik dalam kanser dan sel vaskular dan ini biasanya dikaitkan dengan prognosis yang buruk [17-20]. Terutamanya, ekspresi berlebihan TRF2 boleh menggalakkan tumorigenesis bukan sel secara autonomi, yang membawa kepada imunosupresi dan neo-angiogenesis[13,18-20]Secara khususnya, peningkatan TRF2 mewujudkan persekitaran mikro imunosupresif yang kuat. Dengan mengubah ekspresi proteoglycans heparan sulfat, TRF2 secara langsung merekrut dan mengaktifkan sel penindas yang berasal dari myeloid (MDSCs) melalui laluan TLR2 [21]. Walaupun overexpression TRF2 dalam sel kanser sangat menghalang pengambilan sel NK dalam persekitaran mikro tumor dengan peraturan sintesis HSPG [13], pengaktifan TLR2 MDSC yang disebabkan oleh overexpression TRF2 membawa kepada perencatan yang kuat terhadap imunosurveillance sel NK dengan penurunan yang kuat. degranulasi sel NK, pengeluaran dan pembunuhan IFNgamma [21].apa itu cistancheOleh itu, overexpression TRF2 sangat menumpulkan peringkat awal imunosurveillance anti-tumor dengan secara langsung menghalang pengambilan sel NK dan secara tidak langsung kefungsian sel NK melalui pembentukan persekitaran mikro imunosupresif yang bergantung kepada MDSC. Akibatnya, menyasarkan TRF2 dalam kanser boleh menjadi strategi multi-hit yang berharga melalui proses autonomi sel dan bukan sel autonomi dengan menggalakkan penuaan serta menjejaskan neo-angiogenesis dan pelarian imun.

cistanche boleh anti penuaan

Sehingga kini, semua sebatian kecil yang dikenal pasti yang menyasarkan TRF2 menjejaskan keupayaannya untuk melindungi hujung kromosom daripada DDR dengan itu dengan potensi kesan sampingan pro-penuaan [22]. Kerja kami sebelum ini menunjukkan bahawa pengurangan separa ekspresi TRF2 boleh membalikkan tumorigenisiti dalam model tetikus melalui kesan bukan autonomi sel, tanpa mendorong DDR [13]. Oleh itu, kami beralasan bahawa memberi tumpuan kepada mengurangkan TRF2 yang berlebihan dalam kanser akibat daripada ekspresi berlebihannya boleh menjadi strategi yang menarik untuk merawat kanser tanpa kesan sampingan pro-penuaan. Dalam kajian ini, kami membentangkan platform penyaringan asal untuk mengenal pasti sebatian kecil yang menyasarkan kestabilan TRF2. Kami menunjukkan bahawa dua hits teratas menghalang aktiviti tumorigenik TRF2 overexpression. Kajian ini menunjukkan bahawa ekspresi TRF2 boleh dimodulasi secara farmakologi dan bahawa ujian saringan kami adalah kaedah yang boleh dipercayai untuk pemilihan ubat yang mampu memodulasi tahap ekspresi TRF2, dengan potensi anti-kanser dan sifat anti-penuaan.

2. Bahan dan Kaedah 2.1.Sel

Buah pinggang embrio manusia (HEK)293-Sel T(ATCC CRL-1573) dan sel BJ-HELTRas[13] telah ditanam dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM) (Lonza,Levallois Perret, Perancis) ditambah dengan 10 peratus serum anak lembu janin (FCS), 100 IU/mL penisilin dan 100ug/mL streptomycin（Invitrogen,Cergy Pontoise,Perancis）.

2.2.SDS-PAGE dan Western Blotting

Jumlah lisat sel telah disediakan, dipisahkan oleh elektroforesis dan dipadamkan seperti yang diterangkan sebelum ini [14]. Secara ringkasnya, sel telah dituai dan dilisiskan dalam penimbal lisis (8.76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2,0.1 peratus SDS,0.1 peratus Triton X -100,10 g/L sodium deoxycholate, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA),1{{50}} ug/mL leupeptine,1 mM AEBSF dan 19 ug/mL aprotinin). Sampel kemudian dititrasi menggunakan kit ujian protein BCA (Interchim, Monlucon, Perancis). Sampel (60 ug/lorong) dipanaskan pada 95 darjah selama 5 minit dalam penimbal pemuatan (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 peratus SDS, 0.1 peratus bromofenol biru, 10 peratus gliserol pH 6.8). Kemudian sampel dimuatkan pada 10 peratus gel polyacrylamide dan dijalankan selama 45 minit pada 160 V. Protein kemudiannya dipindahkan ke membran Immobilon-FL (Millipore, Upstate New York, Amerika Syarikat) menggunakan Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio- Rad, Hercules, CA, USA).Membran telah disekat selama 1 jam dalam penampan Penyekatan Intercept (LI COR, Lincoln, NE, USA) sebelum pengeraman semalaman pada 4 darjah dengan campuran antibodi primer (mouselgGl anti-TRF2 dicairkan pada1: 250;dan arnab IgGanti-Beta-actin dicairkan pada 1:10,000) dalam penimbal Menghalang Pintas yang mengandungi 0.5 peratus Tween20. Selepas dibasuh dalam PBS 0.1 peratus Tween20, membran diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dalam Penampan penyekat Intercept yang mengandungi 0.25 peratus Tween20 dengan campuran antibodi sekunder: kambing-anti-tikus IRDye 680 untuk antibodi anti-TRF2 dan kambing anti-arnab IRDye 800CW untuk antibodi anti-Beta-aktin (pencairan 1:15,000).Cistanche anti penuaanAntibodi sekunder primer dan IRDye yang digunakan disenaraikan di bawah dalam jadual antibodi (Jadual 1). Akhirnya, jalur protein divisualisasikan menggunakan sistem pengimejan LiCor Odyssey 9120 (LI-COR). Ekspresi TRF2 diukur dengan menormalkan keamatan jalur TRF2 kepada keamatan jalur aktin dan latar belakang.

2.3.Strategi Pengklonan

Urutan cDNA TRF2 manusia telah diklon antara tapak sekatan BamHI/BclI plasmid SFFV-GPR lentiviral yang merupakan derivatif HIV-SFFV-GFP-WPRE [23]. Plasmid SFFV-GPR mengandungi promoter virus pembentuk fokus limpa (SFV) yang mengawal gen polycistronic GPR yang terdiri daripada jujukan cDNA untuk protein pendarfluor hijau (GFP), protein rintangan puromisin dan protein pendarfluor Tag-merah (RFP)-T (Tag bermutasi S158T -RFP), setiap satu dipisahkan oleh urutan E2 dan T2 Picornaviridae. cDNA hTRF2 telah dimasukkan di kawasan terminal C RFP-T, untuk membolehkan ekspresi protein gabungan RFP-TRF2.

2.4.Pengeluaran Lentivirus

Untuk pengeluaran lentivirus,5 × 10* HEK 293-sel T telah ditransfeksi dengan 8.6 ug SFFV-GPR atau RFP-TRF kosong2-yang menyatakan vektor SFFV-GPR,8.6 ug Lenti -Delta 8.91 dan 2.8 ug VSV-g melalui pemindahan pengantara kalsium fosfat. Sel yang ditransmisikan telah dibiakkan dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FCS pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2 dalam 10-cm hidangan. Supernatan yang mengandungi virus yang baru dibina dikumpulkan selepas 48 jam, kemudian melalui penapis Millipore 0.45-μm. Selepas pentitratan virus, nisbah 1∶1 （virus∶sel） digunakan untuk menjangkiti garisan sel BJ-HELTRas, dipilih untuk ketahanannya terhadap kecacatan TRF2[13].cistanche beefíciosKlon yang menyatakan GFP dan protein RFP-TRF2 yang digabungkan ke tahap sederhana kemudian diasingkan oleh penyisihan sel diaktifkan pendarfluor (FACS).

2.5.Saringan Sitometri Aliran

Sel garis klon BJ-HELTRas yang mengandungi vektor SFFV-GPR dan mengekspresikan protein gabungan RFP-TRF2 telah dikultur dalam 96-plat telaga dalam medium DMEM ditambah dengan 10 peratus FCS dan 1 peratus penisilin/streptomisin. Selepas 24 jam rawatan dadah, sel kemudiannya ditrypsin dan dibasuh dalam garam penimbal fosfat (PBS) yang mengandungi 0.5 mM EDTA dan 2 peratus FCS sebelum dibetulkan dengan 0.5 peratus formaldehid (FA). Sel-sel tetap kemudian dikenakan untuk mengalirkan sitometri menggunakan pensampel pemprosesan tinggi FacsCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

2.6.Tindak balas Rantaian Polimerase Kuantitatif Masa Nyata(RT-qPCR)

Jumlah RNA telah diasingkan menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Belanda). Transkripsi terbalik dilakukan menggunakan transkripase terbalik Superscript II (Invitrogen) dengan 1 ug daripada jumlah RNA. Ekspresi setiap gen telah dinormalisasikan kepada GAPDH. Primer berikut telah digunakan: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5'-GTCAAACCATA 14}}. 2.7.AlamarBiru

Dalam 96-plat bawah rata telaga, 5 × 103 sel setiap telaga telah disemai dalam 200 uL DMEMsup-suplemen dengan 10 peratus FCS. Pada 24 jam selepas rawatan dadah, 10 uL AlamarBlue (Bio-Rad) telah ditambah dan penyerapan diukur pada 570 nm dan 600 nm selama 36 jam dalam pembaca plat Spectrostar Nano (BMGLabtech, Ortenberg, Jerman). Peratusan pengurangan pengoksidaan AlamarBlue ditentukan seperti yang diterangkan oleh pengilang.

2.8.Haiwan

Percubaan telah dilakukan pada 8- hingga 12-tikus betina bogel NMRI berusia seminggu dari Janvier Labs (Perancis). Semua eksperimen tetikus telah dijalankan mengikut garis panduan institusi tempatan dan antarabangsa dan telah diluluskan oleh sama ada Jawatankuasa Penjagaan Haiwan IRCAN dan serantau (CIEPAL Cote d'Azur #187 dan #188) dan kebangsaan (Kementerian Penyelidikan Perancis #03482.01/02482.2 dan #02973.01/02973.2)pihak berkuasa.

2.9.Eksperimen Pertumbuhan Tumor

Setiap tetikus bogel NMRI disuntik secara subkutan di bahagian belakang dengan 1 x 106 sel BJ-HELTRas digantung dalam 100 μL tikus PBS （n=8 setiap kumpulan）. Tikus telah dirawat pada hari 16, 18, 20 dan 22 dengan suntikan intraperitoneal sebanyak 100 uL DMSO (45 peratus ), alexidine -2HCl (1 mg/kg) atau AR-A014418(5 mg/kg), kemudian disusuli sehingga hari ke 26. Kemunculan tumor dinilai dengan palpasi setiap hari. Saiz tumor diukur setiap 2-3 hari menggunakan angkup. Isipadu tumor kemudiannya ditentukan menggunakan formula hemi-ellipsoid:π×(L×1× h)/6, di mana L sepadan dengan panjang, I kepada lebar dan h kepada ketinggian tumor, masing-masing.

2.10.Matrigel Plug Assays

Sel BJ-HELTRas dirawat dengan DMSO (1 peratus ), alexidine-2HCl (1 uM) atau AR-A014418 （10 μM） selama 2 hari. Kemudian, 100 μL sel dirawat 1 × 10 darjah digantung dalam PBS bersama-sama dengan 400 uL Matrigel yang dikurangkan faktor pertumbuhan (Corning, New York, Amerika Syarikat) telah disuntik secara subkutan ke belakang tikus bogel NMRI di bawah anestesia isoflurane. Pada hari ke-5 selepas inokulasi, palam Matrigel dituai, dan sel-sel yang menyusup dikumpulkan dengan pemisahan enzimatik melalui dispase (Corning), kolagenase A (Roche, Bale, Switzerland) dan pencernaan DNAseI (Roche) selama 30 minit pada 37 darjah [13]. ]. Sel telah tepu selama 15 minit di atas ais dengan antibodi anti-CD16/CD32 Fe-Block (klon 2.4G2) sebelum pewarnaan dengan antibodi berganding selama 30 minit pada 4 darjah. Antibodi terkonjugasi yang digunakan disenaraikan dalam jadual antibodi. Sel telah dibasuh dalam PBS dengan 0.5 mM EDTA, 2 peratus FCS dan tetap dengan 0.5 peratus FA. Sel bernoda dianalisis menggunakan cytometer ARIA III dengan perisian DIVA6 (BD Biosciences) dan FlowJo 10 (LLC).

2.11. Perangkaan

Semua graf dan analisis statistik dihasilkan menggunakan perisian GraphPad Prism (San Diego,CA,USA).Semua keputusan diwakili sebagai min ± sisihan piawai (sd) atau min ± ralat piawai min (SEM). Perbezaan ketara antara min ditentukan menggunakan ujian dua ekor Mann-Whitney. Ujian peringkat log (Mantel-Cox) digunakan untuk menentukan pengambilan tumor. Bagi setiap ujian, hlm<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Keputusan

3.1.Pengenalpastian Molekul Perencatan TRF2

Untuk menyaring ubat-ubatan yang mampu memodulasi tahap protein TRF2, kami menggunakan sistem lentiviral untuk mentranskripsikan gen GFP dan RFP yang digabungkan ke terminal N TRF2. Berikutan strategi umum yang diterangkan di tempat lain [23], kami membina lentivirus GRT, di mana promoter SFFV mengawal ekspresi pengekodan gen poli-cistronik GFP, protein rintangan puromisin dan sama ada RFP-TRF2 atau RFP sahaja sebagai kawalan (Rajah 1A). Akibatnya, semua sel transduksi menyatakan kedua-dua GFP dan RFP-TRF2. Sistem ini direka bentuk untuk mengenal pasti ubat-ubatan yang memodulasi ekspresi TRF2, dengan mengukur keamatan RFP menggunakan sitometri aliran, manakala keamatan GFP berfungsi sebagai kawalan dalaman untuk transkripsi konstruk wartawan.

Kami memindahkan lentivirus GRT ke dalam fibroblas BJ-HELTRas manusia yang diabadikan oleh SV40 dan hTERT dan dijadikan onkogenik oleh Ras v12[13]. Untuk memudahkan pengukuran kedua-dua peraturan atas dan bawah TRF2, klon tahan puromisin yang secara sederhana menyatakan kedua-dua protein GFP dan RFP-TRF2 telah diasingkan menggunakan pengisihan FACS dan dinamakan GRI-BJ-HELTRas (Rajah 1A). Sebagai kawalan positif, kami merawat sel GRT-BJ-HELTRas dengan 10 uM gemcitabine, modulator kestabilan TRF2 yang diterangkan sebelum ini [24], selama 24 jam. Walaupun tiada modulasi RFP dikesan dalam sel yang ditransduksi dengan vektor kosong, pengurangan ketara dalam nisbah intensiti pendarfluor min RFP/GFP (MFI) diperhatikan dalam sel GRT-BJ-HELTRas yang dirawat gemcitabine berbanding kawalan yang dirawat DMSO (82 peratus daripada kawalan; p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Menggunakan sitometri aliran, kami kemudiannya menyaring 396 sebatian farmakologi yang diluluskan oleh Pentadbiran Makanan dan Dadah (FDA) yang mampu menyasarkan enam kategori utama proses biologi: saluran ion, fosfatase, kinase, faktor epigenetik, ligan reseptor nuklear dan laluan Wnt (Rajah S1C). ).Sel GRT-BJ-HELTRas pertama kali dirawat dengan 10 uM setiap satu daripada 396 sebatian atau DMSO selama 24 jam sebelum analisis sitometri aliran (Rajah S1D). Dalam kes ini, 84 sebatian didapati memodulasi tahap protein TRF2 (Rajah S1D, panel kanan; Jadual S1), dan digunakan untuk skrin sekunder (Rajah S1E; ​​Jadual S1). Dalam skrin sekunder ini, sebagai tambahan kepada merawat sel GRT-BJ-HELTRas dengan 10 uM sebatian terpilih, sel BJ-HELTRas yang tidak ditransduksi atau sel BJ-HELTRas yang ditransduksi dengan vektor kosong telah dirawat dengan cara yang sama untuk membuang positif palsu yang memancarkan warna merah. atau autofluoresensi hijau atau menjejaskan protein RFP atau GFP. 18 sebatian terbaik kemudiannya dipilih untuk menentukan keupayaan mereka untuk memodulasi ekspresi TRF2 nous endoge dalam sel BJ-HELTRas yang tidak ditransduksi, berdasarkan pembongkaran Barat (Rajah S2A, B Jadual S1). Kami mentakrifkan hits sebagai sebatian yang memodulasi sekurang-kurangnya 20 peratus daripada dos TRF2 (sama ada naik atau turun). Menggunakan kriteria ini, daripada 18 ubat yang dinilai oleh Western blotting, 9 daripadanya dikurangkan dan satu peningkatan tahap protein TRF2 endogen (Rajah S2A, Jadual S1) Kami kemudian memutuskan untuk memilih dua sebatian antara ubat-ubatan ini untuk eksperimen in vivo untuk menentukan sama ada mereka boleh mengatasi kesan pro-onkogenik daripada ekspresi berlebihan TRF2. Untuk mengelakkan pengaktifan DDR dan kesan sampingan dalam sel bukan tumorigenik, kami memilih sebatian yang tidak dikurangkan kepada dos TRF2 yang tertinggi atau ke tahap terendah. Antaranya, AR dan AD adalah sepadan dengan kriteria tersebut. Kedua-dua sebatian menurunkan kawalan RFP-TRF2 dalam sel GRT-BJ-HELTRas seperti yang dianalisis oleh sitometri aliran (Rajah 1C), tahap protein TRF2 endogen seperti yang ditunjukkan oleh analisis Western blotting (Rajah 1D; Rajah S2A, B) dan tahap mRNA TERF2 seperti yang ditentukan melalui RT -qPCR (Rajah 1E). Selain itu, rawatan dengan kepekatan LD50 khusus AR dan AD mengurangkan ekspresi mRNA TERF2 dalam kedua-dua sel BJ-HELTRas dan dalam sel BJ-HELTRas TRF2-yang terlalu mengekspresikan (Rajah S3A-C).

3.2.AR-A014418 dan Alexidine-2HCl Membalikkan Tumorigenicity yang Diberikan oleh Tahap Ungkapan TRF2 Tinggi

Kami seterusnya menilai kesan AR dan AD pada pertumbuhan tumor. Untuk mengawal keupayaan mereka untuk menyasarkan TRF2-kanser yang terlalu mengekspresikan, kami menganalisis potensi kesan anti-tumorigenik AR dan AD pada kedua-dua sel BJ-HELTRas standard dan TRF2-sel BJ-HELTRas yang terlalu mengekspresikan. Sel BJ-HELTRas telah ditransduksi dengan vektor TRF2lentiviral atau vektor kosong, kemudian disuntik secara subkutan ke dalam tikus bogel. Tikus kemudian dirawat dengan DMSO, 1 mg / kg AD atau 5 mg / kg AR pada hari 16,18,20 dan 22 selepas suntikan [26,27] (Rajah 2A). Seperti yang dilaporkan sebelum ini [13,21], overexpression TRF2 menggalakkan tumor ini. hubungan dan pertumbuhan dalam vivo (Rajah 2B-D;p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 dan Alexidine-2HCI Counteracted TRF2-Imunosupresi Bergantung dan Neo-Angiogenesis

Untuk menentukan sama ada kesan antitumor AR dan AD boleh menyasarkan sifat onkogenik autonomi bukan sel TRF2, kami memeriksa penyusupan dan pengaktifan sel imun serta angiogenesis dalam tumor yang dirawat. Kami merawat sel BJ-HELTRas standard dan TRF2-yang terlalu mengekspresikan (Rajah S3A) dengan 1 uM AD, 10 uM AR atau DMSO selama 48 jam sebelum suntikan subkutaneus mereka dengan Matrigel ke dalam tikus bogel. Palam matrigel kemudiannya dikumpulkan pada 5 hari selepas suntikan untuk menganalisis persekitaran mikro tumor oleh sitometri aliran (Rajah 3A). Seperti yang dijangkakan [13,21], overexpression TRF2 tidak mengubah penyusupan sel imun global (CD45 plus cell) (Rajah 3B; Rajah S4A), tetapi menghalang pengambilan sel pembunuh semulajadi (NK) (Rajah 3C; Rajah S4B) dan fungsi NK -ality (Rajah 3C-E; Rajah S4C), dan meningkatkan penyusupan MDSC (Rajah 3F). Dalam TRF2-terlebih mengekspresikan sel BJ-HELTRas secara khusus, rawatan dengan sama ada ubat meningkatkan penyusupan imun global (Rajah 3B; Rajah S4A), serta kuantiti dan kefungsian sel NK intra-tumoral (Rajah 3C-E; Rajah S4B,C). Terutama, kedua-dua ubat menyelamatkan sepenuhnya perencatan pengawasan imun pengantara sel NK (CD107a plus dan CD69 plus NK sel) yang disebabkan oleh overexpression TRF2 (Rajah 3C). Ini dikaitkan dengan penurunan dramatik dalam pengambilan MDSC (Rajah 3F; Rajah S4D) dan dengan peningkatan pengambilan monosit dan makrofaj (Rajah 3G).

Seperti yang dilaporkan sebelum ini [14,20], angiogenesis tumor adalah lebih tinggi dalam TRF2-tumor yang terlalu mengekspresikan berbanding tumor kawalan. Walaupun ekspresi berlebihan TRF2 meningkatkan kuantiti CD31 tambah45-sel endothelial CD dalam lapisan tumor (Rajah 3H; Rajah S4E), tiada perbezaan dikesan antara vektor kosong atau TRF2-tumor yang terlalu mengekspresikan selepas rawatan dengan mana-mana ubat. dalam TRF2（vektor TRF2） atau vektor kosong dirawat dengan 1uM alexidine-2HCl atau 10 μM AR-A014418 atau DMSO pada 2 hari sebelum suntikan subkutaneus dengan Matrigel (1 × 10 sel darjah) ke dalam tikus bogel NMRI( n{19}}). Penyusupan sel imun dan endothelial kemudian dinilai pada 5 hari selepas suntikan oleh sitometri aliran. (BH). Analisis sitometri aliran penyusupan imun palam Matrigel. Bilangan sel imun yang menyusup pada palam Matrigel di kalangan sel hidup ditunjukkan. Jumlah penyusupan sel imun (sel CD45 tambah) ditunjukkan dalam (B); penyusupan sel pembunuh semula jadi(NK) (sel NKp46 tambah) ditunjukkan dalam (C); penyusupan sel NK yang diaktifkan (CD107a plus dan CD69 plus NK sel) ditunjukkan dalam (D,E); sel penindas terbitan myeloid (MDSC; CD11b tambah GR1 tambah ))penyusupan ditunjukkan dalam (F);penyusupan monosit-makrofaj ditunjukkan dalam (G) dan penyusupan sel endothelial ditunjukkan dalam (H).p Nilai ditentukan menggunakan Mann- Ujian Whitney(*hlm<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Perbincangan

Di sini, kami melaporkan pembangunan ujian berasaskan sel untuk menyaring sebatian yang memodulasi ekspresi protein telomerik TRF2. Dengan menyaring perpustakaan kecil molekul yang diluluskan oleh FDA, kami mengenal pasti sebatian yang sama ada boleh meningkatkan atau mengurangkan tahap ekspresi TRF2. Kami mendapati bahawa AD dan AR menurunkan kawalan TRF2 dan mempamerkan aktiviti anti-tumorigenik khusus untuk sel-sel tumor yang mengekspresikan TRF2 secara berlebihan. Menunjukkan lagi aktiviti khusus TRF2-mereka, rawatan AR dan AD menyelamatkan imunosupresi dan neo-angiogenesis yang diberikan oleh ekspresi berlebihan TRF2. Secara mengejutkan, hakikat bahawa penyusupan imun global meningkat untuk tumor yang mengekspresikan TRF2 secara berlebihan selepas rawatan AR atau AD menunjukkan bahawa ubat tersebut lebih kuat untuk meningkatkan tindak balas imun apabila TRF2 diekspresikan secara berlebihan. Ubat-ubatan tersebut menghalang kesan imunosupresif TRF2 overexpression dengan memulihkan fungsi sel NK (CD107a dan CD69 ditambah sel NK) dan mengurangkan penyusupan MDSC dengan kuat. Ini menunjukkan bahawa ubat-ubatan tersebut menumpulkan program khusus yang bergantung kepada TRF{17}}yang mencetuskan pelepasan imun dan penindasan imun serta boleh meningkatkan pembebasan Molekul Berkaitan Bahaya (DAMP) yang meningkatkan tindak balas imun khususnya apabila TRF2 diekspresikan secara berlebihan. Daripada perhatian, kami melihat bahawa AR dan AD menyelamatkan fungsi imunosupresif dan pro-angiogenik TRF2 overexpression, dua ciri TRF2 overexpres-sion yang sebelum ini kami tunjukkan sebagai bebas DDR. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa kesan AR dan AD pada pertumbuhan tumor adalah bebas DDR, satu mekanisme yang masih akan diterangkan sepenuhnya dalam kajian lanjut. Kajian bukti konsep sekarang memberikan bukti bahawa pengurangan farmakologi ekspresi TRF2 boleh menjadi strategi anti-kanser yang berharga

Walaupun kaedah pemeriksaan menganggap tahap protein TRF2 secara bebas daripada tahap transkrip, kedua-dua ubat menurunkan tahap mRNA TERF2 endogen, membayangkan bahawa AR dan AD menyasarkan beberapa tahap peraturan TRF2. Menyokong ini, AR ialah perencat isyarat Wnt [28], yang merupakan pengaktif transkripsi TERF2 [29]. Secara umumnya, ubat-ubatan yang menyasarkan laluan isyarat Wnt telah diperkaya semasa langkah pemeriksaan (Rajah S1B-D). Bagaimana AD, agen penyasaran mitokondria, mempengaruhi ekspresi TRF2 masih perlu ditentukan. Oleh kerana kanser yang mempamerkan paras TRF2 yang tinggi mempunyai prognosis yang buruk dan menunjukkan peningkatan rintangan kepada kemoterapi [21], AR dan AD adalah agen terapeutik yang menarik untuk tumor tersebut. Potensi untuk menyahgandingkan aktiviti telomerik dan pro-onkogenik TRF2[13] meningkatkan kemungkinan menurunkan kawal selia TRF2 secara farmakologi sekali gus memberikan faedah anti-kanser berbilang hit tanpa kesan sampingan pro-penuaan yang memudaratkan. Oleh itu, kajian masa depan adalah wajar untuk menentukan kesan sinergistik ubat-ubatan ini pada tahap ekspresi TRF2 dalam kajian klinikal.

Walaupun TRF2 dikawal selia dalam pelbagai kanser manusia [13,21], ekspresinya dikurangkan semasa kedua-dua penuaan normal dan patologi banyak tisu [30,31] Selain itu, beberapa laporan yang melibatkan model tetikus TRF2 disregulasi menekankan kepentingan TRF2 pada persimpangan antara penuaan dan kanser [31-35]. Oleh itu, molekul yang dikenal pasti oleh prosedur saringan yang diterangkan di sini adalah calon ubat yang menarik, kedua-duanya sebagai agen anti-kanser untuk downregulation TRF2 seperti yang disahkan dalam kajian ini, dan berpotensi sebagai agen anti-penuaan dengan menaikkan TRF2.

Artikel ini diekstrak daripada Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers