2.6. Ungkapan Caspase-3 dan Caspase-6

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik Di Sini Untuk Mengetahui Cistanche Tubulosa Untuk Antioksidan

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Tikus TgAPP menunjukkan peningkatan dalam ekspresi gen caspase {{0}} (Rajah 8C1, H1), yang ketara dan lebih besar daripada 30 peratus berbanding dengan hippocampi tikus WT (Rajah 8H1; p <0.05). Bagi ungkapan caspase-6, tiada perbezaan diperhatikan antara tikus transgenik dan bukan transgenik (Rajah 8C2, H2).

Rawatan Quercetin dan rutin dapat menurunkan paras mRNA caspase{{0}} dalam hippocampus dengan cara yang ketara secara statistik (Rajah 8H1; p < 0.05), dengan peratusan perencatan sekitar 17 peratus dan 27 peratus untuk tikus betina dan jantan, masing-masing. Dalam korteks serebrum, perbezaan ketara hanya diperhatikan dalam rawatan dengan rutin pada lelaki (Rajah 8C1; p <0.05).

Mengenai rawatan caspase-6, quercetin dan rutin tidak memberikan sebarang kesan ketara secara statistik dalam korteks atau hippocampus (Rajah 8C2, H2), walaupun dalam rawatan terakhir Caspase-6 dalam lelaki TgAPP menunjukkan kecenderungan untuk berkurangan (Rajah 8H2).

2.7. Penanda Keradangan

Keputusan yang diperoleh untuk ekspresi gen pengantara radang IL-1 , TNF- dan IFN- ditunjukkan dalam Rajah 9.

Dalam TgAPP, terdapat peningkatan ketara dalam ekspresi gen IL{{0}} sekitar 20 peratus dalam korteks dan hippocampus dalam kedua-dua jantina berbanding tikus WT (Rajah 9C1, H1; p < 0.05). Berkenaan dengan TNF- , walaupun tahap mRNA yang lebih tinggi ditunjukkan dalam TgAPP, mereka tidak signifikan secara statistik dalam tikus WT (Rajah 9C2, H2). Mengenai IFN-, terdapat peningkatan sekitar 30 peratus dalam ekspresinya pada lelaki, yang hanya signifikan secara statistik dalam korteks (Rajah 9C3; p <0.05).

Rawatan dengan quercetin dan rutin, baik pada wanita dan lelaki, dapat mengurangkan ekspresi IL{{0}} dalam korteks serebrum dan hippocampus berbanding dengan mengawal tikus TgAPP (Rajah 9C1, H1; p < {{8 }}.05), memperoleh nilai yang sama dengan tikus WT, dan terutamanya lebih rendah dalam hippocampi tikus jantan (Rajah 9H1; p <0.05).

Kesan keseluruhan kedua-dua rawatan flavonoid pada ekspresi IL{{0}} tidak diperhatikan dengan TNF- mahupun dengan INF-. Oleh itu, lelaki TgAPP, selepas rawatan kuersetin, mengalami penurunan ketara dalam TNF- hippocampal (Rajah 9H2; p < 0.05) dan dalam ekspresi IFN- kortikal (Rajah 9C3; p < 0.05).

2.8. Penilaian Neuron Merosot dan Unjurannya

Tiada tanda-tanda ciri neurodegenerasi diperhatikan pada usia di mana tikus TgAPP transgenik diuji, berbanding dengan tikus WT, dan rawatan dengan quercetin dan rutin tidak menunjukkan sebarang perubahan selama 4 minggu berbanding dengan TgAPP (Rajah S1, Data Tambahan).

2.9. Ekspresi Reseptor Glutamat Ionotropik

Tiada perbezaan ketara ditemui dalam ekspresi reseptor, membandingkan nilai yang diperoleh untuk tikus kawalan TgAPP dengan yang diperoleh untuk tikus WT. Terdapat juga tiada kesan ketara pada ekspresi reseptor ionotropik ini dengan kehadiran rawatan quercetin atau rutin (Jadual S5, Data Tambahan).

3. Perbincangan

Tujuan kajian kami sekarang adalah untuk menilai kesan dua flavonoid, quercetin, dan rutin, pada peringkat pertama patogenesis AD, tanpa mengira kesannya terhadap neurodegenerasi dan/atau fungsi kognitif. Korteks dan hippocampus adalah kawasan otak yang dianalisis, kerana ia adalah struktur otak yang paling terjejas dalam AD. Perlu diambil kira bahawa quercetin dan rutin diberikan melalui diet terrumus yang mengandungi salah satu daripada dua flavonoid, untuk meniru, dalam model haiwan AD, pengambilan diet manusia yang sihat, yang mengandungi bahan aktif.

Khususnya, APPswe transgen dalam tetikus C57B6 memberikan kesan yang ketara pada nisbah GSH/GSSG, tahap MDA, kapasiti enzim antioksidan, ekspresi APP, aktiviti BACE1 dan ekspresi caspase-3 dan IL-1. Walaupun mutasi APP pada manusia biasanya mengakibatkan AD tipikal, mereka kebanyakannya dikaitkan dengan patologi amiloid semata-mata dalam tikus transgenik APP dan tidak ada degenerasi neuro yang ketara [14,15], kerana tiada tanda ciri yang diperhatikan dalam tikus transgenik kami TgAPP, bertentangan dengan tikus WT (data tambahan, Rajah S1). Membalas dengan 40 -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) neuron hippocampal membolehkan kami memerhati morfologi nuklear, kerana sebatian ini ialah pewarna pendarfluor untuk asid nukleik. Kami tidak memerhatikan nukleus serpihan atau lobular, biasanya apoptosis; kami juga tidak melihat sebarang perbezaan yang luar biasa membandingkan bahagian histologi hippocampal bagi garis transgenik kawalan TgAPP berkenaan bahagian WT; kami juga tidak melihat sebarang perbezaan antara rawatan quercetin dan rutin mengenai tikus kawalan TgAPP.

Dalam panel ciri biokimia AD yang akan dianalisis, kami memberi tumpuan terutamanya pada menentukan nisbah GSH / GSSG pada salah satu daripada dua diet flavonoid, kerana pengurangan tahap GSH mewakili salah satu penanda biokimia awal yang paling penting dalam AD [16,17]. ] dan telah diperhatikan semasa patogenesis dan perkembangan penyakitnya. Pengukuran tahap GSH otak [18] dan, lebih baru-baru ini, tahap GSH darah [19] telah menjanjikan sebagai penanda diagnostik untuk peringkat awal AD. Selain itu, usaha juga telah dibuat untuk menambah stor GSH endogen sendiri atau pendahulunya [20-22]. Dalam kajian kami, penurunan dalam kuasa pengurangan selular (GSH / GSSG) diperhatikan dalam tikus TgAPP mengenai haiwan WT, dalam kedua-dua lelaki dan perempuan, dan di kedua-dua kawasan otak. Dalam korteks dan hippocampus kedua-dua tikus WT dan TgAPP, nisbah GSH / GSSG adalah lebih rendah pada lelaki berbanding wanita. Diet Quercetin dan rutin meningkatkan nisbah GSH/GSSG dengan ketara berbanding tikus TgAPP yang tidak dirawat, dan peningkatan ini lebih ketara dalam hippocampus. Perubahan dalam tahap GSH dan GSSG dan nisbah GSH/GSSG apabila rawatan kuersetin atau rutin lelaki, mengenai peningkatan kuasa redoks, adalah lebih ketara berbanding wanita. Keputusan daripada penentuan kami mungkin mendedahkan asas penting yang mendasari perbezaan berkaitan seks dalam tikus Tg2576 dalam kerentanan terhadap kerosakan oksidatif makromolekul di satu pihak, kerana sistem glutation adalah reduktor serba boleh dalam pelbagai fungsi biologi, dan dalam kesan pencegahan. diet flavonoid dalam memulihkan status fisiologinya sebaliknya. Seperti yang akan kita lihat sepanjang perbincangan ini, kami telah menetapkan peningkatan dalam nisbah GSH/GSSG sebagai paksi utama yang mungkin menjelaskan set kesan yang diperhatikan dalam tikus TgAPP.

Baru-baru ini telah dicadangkan bahawa nisbah GSH/GSSG, dan bukannya hanya berfungsi sebagai penampan redoks, sebaliknya akan beroperasi sebagai mekanisme pengawalseliaan utama, membolehkan protein mencapai konformasi dan fungsi asalnya dengan mengawal ketat keseimbangan tiol-disulfida sel. proteom. Ringkasnya, sistem glutation timbul sebagai penting untuk mengekalkan proteom yang sihat, menunjukkan bahawa gangguan homeostasis redoks glutathione (iaitu, secara genetik atau farmakologi) meningkatkan pengagregatan protein akibat gangguan dalam keberkesanan autophagy [23]. Oleh itu, strategi yang bertujuan untuk mengekalkan homeostasis redoks glutathione mungkin mempunyai potensi terapeutik dalam penyakit yang berkaitan dengan pengagregatan protein, seperti AD. Berkait rapat dengan pemeliharaan proteom ialah jentera degradasi ubiquitin-proteasome, yang terlibat dalam patogenesis AD. Proteasome secara selektif merendahkan berbilang substrat yang penting dalam mengekalkan homeostasis neuron, termasuk katabolisme protein teroksida dan terkumpul. BACE1 mengalami ubiquitination, dan telah ditunjukkan bahawa menyekat laluan ubiquitin–proteasome akan menghalang degradasi BACE1 dan seterusnya membawa kepada peningkatan pengeluaran aktiviti enzim BACE1, lebih banyak produk belahan C99 dan peningkatan dalam kedua-dua A 1-40 dan A { {8}} dalam sel neuron dan bukan neuron [10]. Kajian terdahulu kami mendapati bahawa kedua-dua flavonoid, quercetin, dan rutin, mempengaruhi pelbagai laluan isyarat dan rangkaian molekul yang berkaitan dengan modulasi fungsi proteasome dalam sel neuroblastoma [9]. Di samping itu, telah ditunjukkan bahawa neuron yang ditambah dengan pengurangan glutation (GSH) memulihkan aktiviti proteasome dan mengurangkan pembentukan agregat [11] kerana fungsi proteasome dikawal oleh status redoks [24]. Oleh itu, peningkatan dalam nisbah GSH/GSSG yang dialami oleh haiwan apabila mempunyai diet quercetin atau rutin adalah konsisten dengan modulasi proteasome oleh quercetin dan rutin, yang ditunjukkan ex vivo sebelum ini.

Seperti yang dinyatakan sebelum ini, ketidakseimbangan redoks membawa kepada protein yang diubah suai secara oksidatif yang cenderung terkumpul dan mencipta agregat yang mengakibatkan kerosakan proteasome [25]. Oleh itu, memandangkan peranan penting tekanan oksidatif dalam patogenesis AD, biomarker tekanan oksidatif, termasuk peroksidasi lipid (tahap MDA) dan enzim antioksidan, telah dinilai dalam korteks dan hippocampus dalam tikus TgAPP dan WT. SOD, CAT, GR, dan GPx adalah enzim antioksidan terpenting yang bertindak menentang radikal bebas oksigen dan mengawal metabolisme radikal bebas dalam badan dan memainkan peranan dalam sistem penghapusan radikal bebas, melindungi sel-sel dalam badan daripada peroksidasi lipid . Dalam kajian kami, akibat daripada overexpression APP, penurunan umum dalam aktiviti enzim antioksidan diperhatikan dalam tikus TgAPP berbanding dengan tikus WT, yang signifikan secara statistik untuk CAT. Selaras dengan tahap GSH yang dikurangkan, peroksidasi lipid meningkat dengan ketara dalam tikus TgAPP. Walaupun sumber tekanan oksidatif dalam AD manusia adalah sangat kompleks dan multifaktorial, patologi amiloid yang dibangunkan pada tikus nampaknya mencukupi untuk memulakan proses patologi yang membawa kepada peningkatan tekanan oksidatif dalam otak [26]. Haiwan yang dirawat dengan rutin mengalami peningkatan dalam aktiviti CAT dalam korteks dan aktiviti GR dalam hippocampus, dalam kedua-dua lelaki dan perempuan. Hanya haiwan yang dirawat dengan rutin mengalami perubahan dalam ekspresi gen CAT dan GR dalam korteks dan hippocampus dalam kedua-dua lelaki dan perempuan dan GPx dalam hippocampi tikus betina. Dalam konteks ini, beberapa sebatian semula jadi telah ditunjukkan untuk mempengaruhi crosstalk antara peraturan proteasome dan redoks. Lebih tepat lagi, quercetin ialah pengaktif Nrf2 yang dikenali [27] yang mempamerkan sifat antioksidan melalui rangsangan fungsi proteasome, menggalakkan peningkatan rintangan tekanan oksidatif dan memberikan umur panjang sel yang dipertingkatkan [28].

Ekspresi BACE1 khusus tisu adalah penting untuk pemprosesan APP biasa, dan ekspresi disregulasinya mungkin memainkan peranan dalam patogenesis AD. BACE1 kebanyakannya dinyatakan dalam neuron hippocampal, korteks, dan lapisan berbutir cerebellar [10]. Perlu diingatkan bahawa kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa tikus transgenik APP mutan Sweden telah meningkatkan tahap otak A dengan ketara pada keadaan mantap [29], menunjukkan bahawa BACE1 memainkan peranan penting dalam laluan amyloidogenik dalam patogenesis AD dan merupakan sasaran terapeutik yang baik. untuk rawatan AD. Dalam kajian kami, kami melihat pengurangan ketara aktiviti BACE1 apabila rawatan kuersetin dan rutin, yang mungkin menyumbang kepada penurunan pemendapan A pada tikus. Kami berpendapat bahawa lebih daripada hanya beroperasi sebagai perencat BACE1 bagi enzim, kuersetin dan rutin mungkin mengurangkan aktiviti BACE1 yang berkaitan dengan peningkatan nisbah GSH/GSSG, berdasarkan hipotesis untuk meningkatkan pemulihan aktiviti proteasome. Dalam pengertian ini, diketahui bahawa penyasaran perencat BACE1 ke tapak belahan APPswe (mutasi Sweden) berlaku sebelum ia mencapai membran plasma, manakala APPwt (jenis Liar) diproses dalam endosom awal yang berasal dari permukaan sel. Oleh itu, BACE1 yang membelah APPwt kadangkala terikat kepada perencat BACE1 pada permukaan sel sebelum pemprosesan APP, walau bagaimanapun, enzim yang memproses APPswe tidak [30]. Atas sebab inilah penyetempatan menyimpang pemprosesan APPswe mungkin menurunkan potensi quercetin dan rutin sebagai perencat BACE1 dengan ketara. Oleh itu, kami lebih cenderung untuk menyokong bahawa penurunan aktiviti BACE dalam model in vivo ini bukan disebabkan oleh perencatan enzim tetapi peningkatan nisbah GSH/GSSG. Walau apa pun, aktiviti BACE1 yang dikurangkan boleh ditafsirkan sebagai percubaan untuk mengurangkan pengeluaran -amyloid dalam tikus TgAPP. Bagi kesan quercetin dan rutin yang paling luar biasa dalam hippocampus pada pengecilan aktiviti BACE1, perlu diperhatikan bahawa korteks mempunyai ketumpatan neuron yang jauh lebih tinggi daripada hippocampus [31], dan kemerosotan selektif proteasome dalam fenotip patologi AD menjadikan korteks lebih terdedah dan terjejas daripada hippocampus [32].

Selepas menentukan kesan rawatan pada aktiviti enzim BACE1, kami berminat untuk menilai ekspresinya. Anehnya, tiada perbezaan ketara dalam ekspresi BACE1 ditemui antara tikus TgAPP berbanding tikus WT, dan tiada perubahan ketara diperhatikan dengan rawatan quercetin atau rutin. Oleh itu, nampaknya peningkatan dalam aktiviti enzim BACE1 tidak dikaitkan dengan peningkatan dalam ekspresi. Dalam konteks ini, adalah luar biasa bahawa Apelt et al. [14] mendapati peningkatan dalam aktiviti BACE1 kortikal dalam tikus Tg2576 antara umur 9 dan 13 bulan manakala tahap ekspresi protein BACE1 dan mRNA tidak berubah mengikut umur. Tambahan pula, bukti telah dijumpai menyokong bahawa amiloid fibrillar A 1–42., dan bukannya amiloid A 1–42 larut, boleh mengimbangi ekspresi protein BACE1, dan dengan itu pengubahsuaian kecil dalam nisbah isoform amiloid boleh memodulasi konformasi agregat amiloid dan kerosakan sel [ 33]. Oleh itu, ketiadaan perubahan dalam ekspresi BACE1 apabila peningkatan aktivitinya yang kami dapati mungkin menyumbang kepada kelaziman amiloid larut A 1-42 ke atas isoform fibrillar amyloid A 1-42 dalam model tetikus kami TgAPP.

Berikutan penentuan ekspresi gen enzim yang terlibat dalam pemprosesan APP, kami menilai kesan kuersetin dan rutin pada enzim -secretase yang terlibat dalam pemprosesan bukan amyloidogenik APP. Kami memberi tumpuan kepada ADAM10 kerana ia adalah isoform konstitutif yang paling penting dari segi fisiologi bagi -secretase. ADAM10 mengatasi penjanaan plak neurotoksik oligomerik A melalui membelah APP dalam domain A untuk menghasilkan serpihan sAPP dan C-terminal (-CTF) [34,35]. Walaupun perubahan dalam ekspresi ADAM10 yang terdapat dalam kajian kami tidak signifikan secara statistik, sedikit penurunan dalam ekspresi ADAM10 diperhatikan dalam tikus TgAPP berbanding tikus WT. Terutamanya, rawatan rutin menunjukkan kecenderungan untuk meningkatkan ekspresi gen ADAM10 di kedua-dua kawasan otak yang dikaji. Postina et al. [36] menunjukkan bahawa peraturan naik ADAM10 jenis liar dalam hippocampus model tetikus AD mengantarkan rembesan sAPP, yang membawa kepada perencatan penjanaan plak A. Kesan kuersetin telah dikaji dalam model tikus AD yang disebabkan oleh aluminium klorida yang menunjukkan peningkatan ketara -secretase (ADAM10 dan ADAM17) dalam hippocampus berbanding dengan yang tidak dirawat. Ini menunjukkan bahawa quercetin mempunyai potensi untuk meningkatkan laluan bukan amyloidogenik melalui pengaktifan gen -secretase [37]. Data praklinikal menguatkan hipotesis bahawa meningkatkan tahap sAPP otak adalah strategi yang berpotensi untuk memperbaiki gejala berkaitan AD dan mengurangkan defisit sinaptik. ADAM10 dan BACE1 bersaing untuk belahan APP, oleh itu mempotensikan aktiviti ADAM10 mungkin menghalang penjanaan amiloid neurotoksik. Selain itu, sAPP boleh menghalang pengaktifan laluan isyarat JNK tekanan, yang membawa kepada pengaktifan aktiviti fosforilasi yang disebabkan oleh NF-κB, yang membawa kepada degradasi proteasome [38]. Oleh itu, pembentukan dan pengumpulan agregat protein yang berkaitan dengan penyakit dikurangkan dengan ketara, dan aktiviti proteasom selular dipertingkatkan, dengan itu memberikan bukti untuk fungsi sAPP dalam peraturan proteostasis [39]. Tambahan pula, telah ditunjukkan bahawa sAPP secara khusus mengimbangi sintesis reseptor AMPA glutamat dan pemerdagangannya [40]. Dalam kajian kami, kami meneroka sama ada peningkatan sedikit ekspresi ADAM10 pada rawatan rutin memberi pengaruh pada penghantaran sinaptik glutamatergik. Seperti yang ditunjukkan dalam bahagian data Tambahan, tiada kesan ketara pada ekspresi reseptor ionotropik ini diperhatikan pada diet quercetin dan rutin, mungkin disebabkan oleh peningkatan lemah dalam ekspresi ADAM10, yang tidak mencukupi untuk pengawalseliaan reseptor AMPA (Data tambahan , Rajah S2 dan Jadual S5).

Perlu diambil kira bahawa kajian in vitro telah menunjukkan pelbagai jenis substrat ADAM10 [41], dan oleh itu, kesan tidak diingini yang diperolehi oleh penyasaran ADAM10-yang tidak spesifik mungkin ditemui dalam percambahan kanser, lekatan sel, promosi. sel T/sel NK prekursor dan keradangan, dsb. [42]. Untuk mengelakkan kekangan ini, kajian kami mencadangkan strategi yang bertujuan untuk mempromosikan pembebasan sAPP secara lebih fisiologi. Pendekatan ini mungkin berdasarkan pengambilan jangka panjang bahan aktif (quercetin atau rutin), yang dimakan melalui diet manusia yang sihat. Walau bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan untuk mengetahui sama ada peningkatan ADAM10 bergantung kepada dos flavonoid dan sama ada potensi kesan berfaedah melebihi kesan sampingan yang diduga.

Bagi ungkapan APPswe, walaupun pemasukan transgen APP manusia dalam genom tetikus menjamin bahawa APPswe diekspresikan secara berlebihan sejak lahir, telah dilaporkan bahawa mRNA APP dan tahap hippocampal protein menunjukkan turun naik yang ketara semasa pembangunan haiwan, menjadi maksimum apabila tikus tanpa gejala (1-bulan) dan berkurangan apabila simptomologi penuh berlaku [43]. Walau apa pun isu ini, ekspresi APP dalam korteks dan hippocampus jauh lebih tinggi berbanding tikus WT dalam kajian kami. Rawatan lanjut dengan quercetin atau rutin dapat mengurangkan ekspresi sedemikian dengan ketara untuk kedua-dua tikus jantan dan betina, di kedua-dua kawasan otak. Penemuan ini selari dengan yang dilaporkan oleh Augustin et al. [44] yang mengkaji ekstrak piawai Ginkgo biloba (Egb761), kaya dengan flavonol seperti quercetin, dalam 4-tikus TgAPP betina berusia sebulan, mendapati tahap mRNA dan protein APP menurun. Dengan mengambil kira bahawa regulasi translasi APP dalam tikus Tg2576 berlaku pada peringkat prodromal dan gejala awal [45], kemungkinan besar pemulihan terjemahan APP oleh quercetin atau rutin mungkin berlaku pada tikus TgAPP kami dan, mungkin, pada awalnya. peringkat simptomatik, mengakibatkan pengurangan tahap kortikal dan hippocampal APP, aktiviti BACE1 dan pengaktifan{10}} caspase.

Tambahan pula, telah dilaporkan di tempat lain bahawa pada tikus Tg2576 (tanpa kehilangan neuron) terdapat peningkatan dalam pengaktifan caspase-3 dalam hippocampus [46], seperti yang terdapat dalam kajian kami, pada permulaan gangguan ingatan. , bersama-sama dengan pengurangan duri dendritik sebelum pemendapan amiloid ekstraselular [46]. Terdapat bukti yang menyokong peranan bukan apoptosis untuk caspases dalam sistem saraf tanpa kematian neuron [47], dan aktiviti caspase-3 telah disetempatkan kepada duri dendritik yang boleh meningkatkan tahap calcineurin. Sebaliknya, defosforilasi subunit GluR1 reseptor seperti AMPA, yang dicetuskan oleh calcineurin dianggap mengakibatkan disfungsi postsynaptic. Nilai ekspresi caspase-3 kami, akibat transgenesis, adalah selaras dengan nilai yang diperoleh oleh penyelidik lain yang melaporkan peningkatan ekspresi caspase-3 pada tahap duri dendritik dalam hippocampus tikus TgAPP [48]. Memandangkan APP mengandungi tiga tapak belahan yang berbeza untuk caspase-3 dalam jujukan asid aminonya, dua daripadanya terletak pada tahap domain ekstraselular dan satu dalam bahagian terminal C intraselular ekor APP [49], hidrolisis APP melalui caspase-3 boleh mengubah pemprosesan proteolitik APP yang memihak kepada laluan amiloidogenik [50], yang membawa kepada pembebasan peptida terbitan C-terminal sitotoksik daripada 31 asid amino panjang (C31), untuk contoh [51]. Ini menunjukkan bahawa, memandangkan caspase-3 boleh mengantara penguatan pembebasan serpihan toksik daripada APP, menurunkan ekspresi caspase-3 oleh quercetin atau rutin mungkin membenarkan pembersihan protein terkumpul. Selain itu, seperti yang dinyatakan sebelum ini, kami telah meneroka pengaruh kedua-dua peningkatan dan penurunan ekspresi caspase-3 dalam penghantaran sinaptik glutamatergik, berdasarkan keupayaan caspase diaktifkan calcineurin-3 untuk menyahfosforilasi subunit GluR1 reseptor AMPA pada tahap postsynaptic. Pengubahsuaian molekul ini mengubah penghantaran sinaptik glutamatergik dan keplastikan neuron pada tahap duri dendritik dalam hippocampus [48]. Secara teorinya, perencatan farmakologi aktiviti caspase-3 dalam tikus TgAPP mungkin menyelamatkan fenotip seperti AD daripada mekanisme yang mendorong kegagalan sinaptik. Walau bagaimanapun, walaupun penambahan dalam ekspresi caspase-3 dalam tetikus TgAPP kami, kami mendapati tiada perbezaan yang ketara dalam ekspresi reseptor AMPA berbanding dengan ekspresi WT tetikus, seperti yang dinyatakan sebelum ini. Mungkin perubahan dalam ekspresi caspase{32}} tidak cukup menonjol untuk menghasilkan pengubahsuaian ketara dalam ekspresi reseptor AMPA (Data tambahan, Rajah S2 dan Jadual S5).

Bagi nilai ungkapan caspase-6, tiada perbezaan ketara ditemui antara tikus TgAPP dan WT. Pengaktifan caspase-6 telah dikenal pasti sebagai perantara penting bagi tekanan neuron yang membelah protein sitoskeletal yang penting (Tau dan -tubulin), sekali gus mengganggu kemerosotan ubiquitin–proteasome protein tersalah lipatan, dan beberapa ketumpatan pasca sinaptik yang mengawal selia aktin protein [52]. Ungkapan caspase yang tidak berubah-6 dalam kajian kami bersetuju dengan ketiadaan tanda ciri neurodegenerasi pada usia di mana tikus transgenik ini dinilai, berbanding dengan tikus WT (Data tambahan, Rajah S1).

Peningkatan ketara dalam mediator neuroinflamasi telah diperhatikan pada pesakit AD, terutamanya di sekitar plak nyanyuk [53-55]. Astrocytes adalah pembekal utama GSH kepada mikroglia dan neuron. Semasa keradangan kronik dan tekanan oksidatif, astrosit melepaskan mediator keradangan toksik dan radikal bebas, mempercepatkan pengaktifan mikroglia dan neurodegenerasi [56]. Perlu diingat bahawa penurunan glutation intraselular berkaitan dengan pengaktifan laluan keradangan, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-κB, dalam mikroglia manusia dan astrocytes [57]. Dalam hal ini, kami memutuskan untuk mengukur tahap IL-1 , IFN- dan TNF- dalam model haiwan kami dan menentukan kesan kuersetin dan rutin pada mereka. Seperti yang diketahui, keradangan menggalakkan pemprosesan A peptida dan APP yang rosak, menggalakkan pengagregatan peptida A dan seterusnya mengubah suai kereaktifan A [58]. Oleh itu, dalam kajian kami, kami mendapati bahawa tikus TgAPP telah meningkatkan tahap mRNA pengantara pro-radang IL-1 , TNF- dan IFN- , berbanding tikus WT, menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan APPswe mungkin menyebabkan lata neuro-radang. mencetuskan satu siri laluan molekul dalam glia dan neuron, yang akan mengaktifkan tindak balas keradangan. Quercetin dan rutin dapat melemahkan ekspresi gen IL{18}} dalam kedua-dua lelaki dan perempuan serta kawasan otak yang dikaji. Beberapa bukti menyokong kesan antiradang yang diberikan oleh kuersetin pada tahap CNS, kerana ia boleh menghalang pengaktifan faktor transkripsi seperti faktor nuklear-kappa B (NF-κB) [59], yang terlibat dalam induksi iNOS, dan oleh itu, kurangkan pelepasan mediator seperti IL-1 , TNF- dan IFN- [60]. Mengenai kesan GSH terhadap tindak balas keradangan, perlu diingatkan bahawa GSH terlibat dalam penyelenggaraan tahap sitokin optimum sedemikian rupa sehingga ekspresi sitokin pro-radang (TNF- , IL-1 , dan IL -6) meningkat disebabkan oleh pengurangan GSH, manakala ekspresi sitokin anti-radang (iaitu, IL-10) kekal tidak berubah. Perubahan homeostasis GSH ini berlaku disebabkan oleh pengawalseliaan dalam laluan isyarat NF-κB dan JNK yang boleh menjadi laluan apoptosis yang boleh dilaksanakan ke arah kematian sel neuron [61]. Dalam kajian kami, pengawalan turun NF-κB oleh quercetin dan rutin mungkin merupakan mekanisme yang munasabah untuk memulihkan homeostasis GSH / GSSG dan oleh itu punca keseimbangan antara sitokin pro-radang dan anti-radang. Akhir sekali, memandangkan promotor BACE1 mempunyai tapak pengikat NF-κB, pengaktifan NF-κB yang disebabkan oleh keradangan memudahkan penyelarasan ekspresi BACE1, dan seterusnya meningkatkan pengeluaran A [62]. Oleh itu, jika regulasi rendah NF-κB berlaku semasa diet quercetin dan rutin, aktiviti BACE1 akan berkurangan akibat daripada peraturan pelepasan sitokin pro-radang dan bukan anti-radang.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Haiwan Eksperimen

Tikus transgenik (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) yang menyatakan mutasi berganda Sweden protein prekursor amiloid manusia (hAPP) telah digunakan sebagai model haiwan AD eksperimen [14]. Tikus ialah garis heterozigot ketukan yang mengekspresikan isoform A PP695 manusia dengan mutasi Sweden berganda (K670N/M671L; Lys670→Asn dan Met671→Leu) di bawah kawalan penganjur protein prion hamster [63]. Akibatnya, tetikus ini mempamerkan tahap protein amiloid-prekursor manusia (A PP), enam kali lebih tinggi daripada tahap A PP tetikus. Di samping itu, tetikus ini menunjukkan tahap yang lebih tinggi iaitu A 40 dan A 42. Deposit A ​​bermula pada umur 9 bulan [63]. Dalam Tg2576 hippocampus dan korteks, ekspresi transgene APPswe terutamanya neuron [64].

Sebagai kawalan negatif, tikus jenis liar (WT) dari koloni yang sama [65,66] telah digunakan. Koloni tikus Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) telah dibangunkan di makmal kami daripada jantan heterozigot Tg2576 dan betina jenis liar. Ibu bapa transgenik telah disumbangkan oleh Dr. Diana Frechilla dari Bahagian Neurosains di Pusat Penyelidikan Perubatan Gunaan di Universiti Navarra (Pamplona, ​​Sepanyol) [67].

Haiwan ditempatkan dalam sangkar pengudaraan individu dan disimpan pada suhu 22–24 ◦C pada 12-kitaran terang/gelap dalam kelembapan 50–60 peratus. Protokol haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) di Complutense University of Madrid dan mematuhi sepenuhnya Arahan Eropah 2010/63/tentang perlindungan haiwan yang digunakan untuk tujuan saintifik dan perundangan Sepanyol mengenai Kebajikan Haiwan ( Titah Diraja 53/2013, 1 Februari 2013).

4.2. Analisis Genotaip Tikus

Transgenisiti ditentukan dalam masa 30 hari kelahiran melalui biopsi ekor. Analisis genotaip haiwan telah dijalankan oleh PCR. Memandangkan Tg2576 (TgAPP) adalah garis heterozigot, gen penyisipan (PrP, daripada protein prion) digunakan sebagai kawalan tindak balas positif. DNA genom diekstrak daripada ekor tikus yang dicerna dengan proteinase K (0.1 µg/µL) dalam penimbal NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM MgCl2, 0.05 peratus gelatin, 0.45 peratus NP-40 dan 0.4 peratus Tween 20) pada suhu 56 ◦C selama 3 jam dan digoncang. Serpihan DNA dimendakkan dengan isopropanol dan dibasuh dengan 70 peratus etanol. Mendakan DNA telah dilarutkan dalam 30 µL penimbal TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). Ketulenan dan kepekatan DNA ditentukan pada 260 dan 280 nm.

Gen PrP dan APP telah dikuatkan oleh PCR. Urutan primer yang digunakan untuk menyaring tikus transgenik adalah seperti berikut: PrP ke hadapan: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP terbalik: GTGGATACCCCCTCCCCAGCCTAGAGACC; APP terbalik: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Langkah-langkah tindak balas PCR adalah seperti berikut: denaturasi pada 94 ◦C selama 90 s, 39 kitaran pada 60 ◦C selama 60 s dan 72 ◦C selama 90 s, kemudian lanjutan akhir pada 72 ◦C selama 7 minit.

Dalam semua kes, kawalan negatif (tanpa acuan DNA) dan kawalan positif gen APP telah dipertimbangkan. Produk PCR yang diperolehi diasingkan dengan elektroforesis dalam 1.5 peratus gel agarosa dalam 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) pada 70 V (voltan malar) dan kemudian diimej dengan pewarnaan dengan GelRed (Millipore).

4.3. Rawatan Haiwan

Tikus TgAPP dan sampah jenis liar, kedua-duanya berumur 6–7 minggu dengan berat badan awal 16.2 ± 0.8 g, telah rawak ke dalam empat kumpulan berikut (n=8/kumpulan): ( a) TgAPP yang tidak dirawat; (b) TgAPP yang dirawat kuersetin; (c) TgAPP yang dirawat dengan Rutin; dan (d) Jenis liar yang tidak dirawat. Oleh kerana kedua-dua tikus jantan dan betina telah dikaji, dua set kumpulan telah ditubuhkan. Pada usia 45 minggu, tikus mula dirawat dengan quercetin atau rutin selama 4 minggu.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavone) dan rutin hidrat (quercetin-3-O-rutinoside hydrate) adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 95 peratus tulen dan dibeli daripada Sigma–Aldrich. Setiap satu daripada flavonoid telah dimasukkan ke dalam diet standard (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Sepanyol) pada kepekatan 200 ppm, sepadan dengan pengambilan 30 mg flavonoid/kg berat badan/hari. Tikus yang tidak dirawat menerima secara eksklusif diet standard tanpa tambahan. Diet dan air disediakan untuk pengambilan ad libitum.

4.4. Penyediaan Tisu Otak untuk Ujian Biokimia dan Histologi

Pada akhir rawatan, tikus dipuasakan semalaman, mereka disingkirkan menggunakan dislokasi serviks, dan seluruh otak dikeluarkan dengan cepat. Otak dibilas dalam garam pada suhu 4 ◦C dan membran araknoid dikeluarkan dengan berhati-hati. Kemudian, hippocampus dan korteks diasingkan. Sampel segera disimpan pada suhu -80 ◦C sehingga digunakan selanjutnya.

Keseluruhan otak sesetengah haiwan digunakan untuk mendapatkan bahagian histologi, yang mana, setelah dieutanasi menggunakan kehelan serviks, otak dibekukan dengan rendaman dalam isopentane pada -80 ◦C. Sejurus selepas itu, bahagian koronal otak (30 µm ketebalan) dibuat daripada mentol olfaktori ke otak kecil, 120 µm dalam kriostat (Leica CM1850, Nussloch, Jerman). Keseluruhan prosedur dilakukan pada -20 ◦C. Bahagian histologi dikumpulkan pada slaid dan disimpan pada -80 ◦C sehingga analisis (Lihat Kaedah Tambahan).

4.5. Glutathione

Untuk ujian glutation, sampel korteks serebrum dan hippocampus dihomogenkan dalam penimbal pelindapkejut redoks{1}} peratus asid asetik Triklorida (RQB-5 peratus TCA) (sebelum ini berbuih dengan N2 selama 15 minit di atas ais) pada kepekatan sebanyak 25 mg/mL (w/v). Sampel digantung semula dengan sonikasi selama 10 saat, kemudian disentrifugasi pada 12,000 × g selama 10 minit pada 4 ◦C, dan supernatan dikumpulkan.

Kemudian, dalam supernatan yang diperoleh, kaedah spektrofluorometrik telah diterima pakai untuk menentukan tahap GSH dan GSSG menggunakan kaedah o-phthalaldehyde, yang diterangkan oleh Senft et al. [68]. Nilai GSH dan GSSG telah diperbetulkan untuk tindak balas spontan tanpa ketiadaan sampel biologi. Dalam kedua-dua kes, supernatan diinkubasi selama 30 minit pada suhu bilik dan selepas itu, pendarfluor diukur menggunakan pembaca plat mikro FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Jerman), dengan penapis pengujaan ditetapkan pada 360 nm (lebar jalur 5 nm) dan penapis pelepasan ditetapkan pada 460 nm (lebar jalur 5 nm). Kepekatan GSH dan GSSG dalam setiap sampel telah diinterpolasi daripada piawaian GSH yang diketahui. Kepekatan kedua-dua GSH dan GSSG dinyatakan sebagai protein nmol GSH/mg, yang membenarkan pengiraan nisbah redoks glutation GSH/GSSG.

Pelet selebihnya dipusingkan sehingga dibubarkan sepenuhnya dalam 240 µL 0.1 M NaOH untuk mengukur kepekatan protein dengan kaedah asid bicinchoninic (BCA), menggunakan albumin serum lembu sebagai piawai.

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】