Abstrak:Quercetin telah dikaji secara meluas untuk penyakit anti-Alzheimer (AD) dan kesan anti-penuaannya. Kajian terdahulu kami mendapati bahawa quercetin dan dalam bentuk glikosidanya, rutin, boleh memodulasi fungsi proteasom dalam sel neuroblastoma. Kami berhasrat untuk meneroka kesan quercetin dan rutin pada homeostasis redoks intraselular otak (glutation dikurangkan/glutation teroksida, GSH/GSSG), kaitannya dengan aktiviti enzim 1 (BACE1) membelah tapak APP, dan protein prekursor amiloid (APP) ungkapan dalam tikus TgAPP transgenik (membawa transgen APP mutasi Sweden manusia, APPswe). Atas dasar bahawa protein BACE1 dan pemprosesan APP dikawal oleh laluan ubiquitin-proteasome dan suplemen dengan GSH melindungi neuron daripada perencatan proteasome, kami menyiasat sama ada diet yang mengandungi quercetin atau rutin (30 mg/kg/hari, 4 minggu) mengurangkan beberapa tanda-tanda awal AD. Analisis genotaip haiwan telah dijalankan oleh PCR. Untuk menentukan homeostasis redoks intraselular, kaedah spektrofluorometrik telah digunakan untuk mengukur tahap GSH dan GSSG menggunakan o-phthalaldehyde, dan nisbah GSH/GSSG telah dipastikan. Tahap TBARS ditentukan sebagai penanda peroksidasi lipid. Aktiviti enzim SOD, CAT, GR, dan GPx ditentukan dalam korteks dan hippocampus. Aktiviti BACE1 diukur oleh substrat khusus secretase yang dikonjugasikan kepada dua molekul wartawan (EDANS dan DABCYL). Ekspresi gen enzim antioksidan utama: APP, BACE1, protein yang mengandungi domain Disintegrin dan metalloproteinase 10 (ADAM10), caspase-3, caspase-6 dan sitokin inflamasi ditentukan oleh RT-PCR. Pertama, overexpression APPswe dalam tikus TgAPP menurunkan nisbah GSH/GSSG, meningkatkan tahap malonaldehid (MDA), dan, secara keseluruhan, menurunkan aktiviti enzim antioksidan utama berbanding tikus jenis liar (WT). Rawatan tikus TgAPP dengan quercetin atau rutin meningkatkan GSH/GSSG, mengurangkan tahap MDA dan mengutamakan kapasiti antioksidan enzim, terutamanya dengan rutin. Kedua, kedua-dua ekspresi APP dan aktiviti BACE1 telah berkurangan dengan quercetin atau rutin dalam tikus TgAPP. Mengenai ADAM10, ia cenderung meningkat dalam tikus TgAPP dengan rawatan rutin. Bagi ungkapan caspase-3, TgAPP memaparkan peningkatan yang bertentangan dengan rutin. Akhirnya, peningkatan dalam ekspresi penanda radang IL-1 dan IFN- dalam tikus TgAPP telah diturunkan oleh kedua-dua kuersetin dan rutin. Secara kolektif, penemuan ini mencadangkan bahawa, daripada dua flavonoid, rutin boleh dimasukkan ke dalam diet sehari-hari sebagai satu bentuk terapi pembantu dalam AD.

Klik Pada Gudang Kimia Antioksidan Cistanche

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kata kunci:quercetin; rutin; glutation; APPswe; BACE1; Penyakit Alzheimer

1. Pengenalan

Penurunan fungsi kognitif adalah gejala neurodegenerasi klinikal asas yang berkaitan dengan usia [1]. Kesan pemakanan terhadap penurunan kognitif yang berkaitan dengan usia adalah topik yang semakin berkembang, kerana ia merupakan faktor penting yang boleh diubah suai dengan mudah. Perubahan patologi dalam otak yang diperhatikan semasa penurunan kognitif berlaku sebelum sebarang manifestasi klinikal, yang kebanyakannya berlaku pada usia tua. Ini memberikan tempoh yang lebih lama untuk mewujudkan strategi pencegahan berkaitan penurunan kognitif dan demensia yang berkaitan dengan usia, yang merupakan kebimbangan kesihatan awam utama [2]. Selama bertahun-tahun, penyelidikan intensif mengenai sebatian asal semula jadi, yang terdapat dalam diet sehari-hari, telah dijalankan pada terapi peningkatan kognitif [3].

Salah satu penyakit neurodegeneratif berkaitan usia yang paling biasa ialah penyakit Alzheimer (AD), yang dicirikan oleh dua ciri neuropatologi: plak amyloid- (A ) dan kusut neurofibrillary. Dari segi penyelidikan ke atas haiwan, model haiwan boleh mensimulasikan fasa asimtomatik AD dengan mengubah suai protein prekursor A (APP), contohnya [4,5].

Hebatnya, beberapa fitokimia bioaktif yang diperoleh daripada tumbuhan yang dikaitkan dengan pelbagai manfaat kesihatan dan penurunan risiko banyak penyakit telah disaring untuk membentuk kompleks bukan kovalen dengan peptida amyloid- (A) [3].

Walaupun banyak ubat tradisional dan produk pemakanan semulajadi telah menunjukkan kemajuan yang besar ke arah pengurangan patologi AD, kami menyedari sepenuhnya batasan model haiwan AD, kerana kesan yang menjanjikan bahan tersebut tidak selalu dapat ditiru dalam kajian manusia [6]. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh kesukaran menganalisis tisu otak pada manusia, terutamanya pada peringkat awal perkembangan, kajian dalam model tikus adalah perlu. Akibatnya, model eksperimen ini mungkin menyokong pembangunan ejen pengguna daripada ubat tradisional dan sebatian semula jadi yang selamat untuk melambatkan perkembangan penyakit neurodegeneratif. Oleh itu, ujian sebatian semula jadi, yang terdapat dalam diet harian, untuk pencegahan penyakit dan perlindungan terhadap risiko AD, harus menjadi keutamaan.

Antara agen semulajadi pemakanan yang penting ini ialah quercetin, yang merupakan flavonoid polifenol utama dalam beberapa buah-buahan dan sayur-sayuran [7]. Quercetin terutamanya terdapat dalam bentuk glikosidanya, iaitu rutin. Untuk bahagiannya, rutin (quercetin-3-O-rutinoside) telah menunjukkan kesan mendalam pada pelbagai fungsi selular yang menyokong beberapa keadaan patologi, iaitu antimikrob, antikarsinogenik, antitrombotik, kardioprotektif dan neuroprotektif. Kesan farmakologi ini terutamanya dikaitkan dengan aktiviti anti-radang dan antioksidan rutin. Disebabkan oleh keupayaannya untuk melintasi penghalang darah-otak, dan/atau metabolitnya, telah ditunjukkan bahawa rutin boleh mengubah kedua-dua gejala kognitif dan tingkah laku penyakit neurodegeneratif [8].

Kajian terdahulu kami mendapati bahawa kedua-dua flavonoid, quercetin, dan rutin, mempengaruhi pelbagai laluan isyarat dan rangkaian molekul yang berkaitan dengan modulasi fungsi proteasome dalam sel neuroblastoma [9]. Di samping itu, telah ditunjukkan bahawa ekspresi BACE1 dan pemprosesan APP dikawal oleh laluan ubiquitin-proteasome [10] dan suplemen dengan glutathione terkurang (GSH) melindungi neuron daripada perencatan proteasome [11]. Kekurangan GSH dalam otak adalah penemuan biasa pada pesakit dengan penyakit neurodegenerative, seperti AD, dan boleh menyebabkan neurodegeneration sebelum permulaan penyakit [12]. Ubiquitination BACE1 dan menyekat laluan ubiquitin-proteasome menghalang degradasi BACE1 dan, akibatnya, membawa kepada peningkatan pengeluaran aktiviti enzimatik BACE1 [10].

Berdasarkan penemuan ini, dan tabiat pemakanan serta suplemen boleh menjejaskan status redoks selular, kami berhasrat untuk meneroka kesan diet yang mengandungi quercetin atau rutin pada homeostasis redoks intraselular otak (GSH/GSSG), korelasinya dengan aktiviti BACE1, dan ekspresi APP dalam model tikus AD (membawa mutasi Sweden manusia Amyloid Precursor Protein APP transgene, APPswe).

Akhirnya, kerana terdapat bukti yang meyakinkan tentang kesan suplemen flavonoid dalam meningkatkan domain kognitif tertentu dan / atau penemuan MRI [13], kami cuba meniru, dalam haiwan, campur tangan dengan menyampaikan diet sihat yang mengandungi jumlah sederhana potensi aktif tertentu. ramuan (quercetin atau rutin) sebagai strategi yang berkesan untuk mencegah ekspresi penanda AD.

2. Keputusan

2.1. Genotaip Tikus

Koloni tetikus TgAPP telah dibangunkan di makmal kami daripada jantan heterozigot Tg2576 dan betina jenis liar. Genotaip tikus dilakukan untuk mengesan individu transgenik. Daripada semua tikus yang diuji, kira-kira 40 peratus didapati transgenik (TgAPP).

Produk PCR yang diperolehi diasingkan dengan elektroforesis dalam 1.5 peratus gel agarose dalam 0.5X penimbal TBE (Tris-Borate-EDTA) pada 70 V (voltan malar) dan kemudian diimej dengan pewarnaan dengan GelRed (Millipore). Profil penguatan untuk kedua-dua tikus transgenik dan WT ditunjukkan dalam Rajah 1.

2.2. Glutathione

Untuk menilai homeostasis redoks intraselular dalam neuron dalam tikus TgAPP, tahap GSH dan GSSG dikira, dan nisbah GSH / GSSG ditentukan sebagai penanda kuasa pengurangan selular dalam kedua-dua lelaki dan perempuan (Rajah 2).

Dalam penilaian kesan transgen pada sistem glutation, penurunan dalam kuasa pengurangan selular (GSH / GSSG) diperhatikan dalam tikus TgAPP mengenai haiwan WT, dalam kedua-dua lelaki dan perempuan dan kedua-dua kawasan otak (Rajah 2C3, H3), terutamanya dalam hippocampus. Dalam kedua-dua tikus WT dan TgAPP, nisbah GSH/GSSG adalah jauh lebih rendah pada lelaki berbanding perempuan (Rajah 2C3, H3; p < 0.05). Manakala pada wanita TgAPP penurunan ini adalah hasil daripada tahap GSH yang lebih rendah (Rajah 2C1, H1), dalam lelaki TgAPP ia kebanyakannya dikaitkan dengan peningkatan tahap GSSG (Rajah 2C2, H2).

Perubahan dalam tahap GSH dan GSSG tikus TgAPP, masing-masing, selepas rawatan quercetin atau rutin, lebih ketara pada lelaki berbanding perempuan. Nampaknya quercetin cenderung untuk menambah paras GSH (Rajah 2C1, H1; p < 0.05) dan rutin untuk menurunkan paras GSSG (Rajah 2C2, H2; p < 0.05).

Rawatan Quercetin dan rutin, dalam kedua-dua lelaki dan perempuan, dapat membalikkan kejatuhan dalam nisbah GSH/GSSG dalam hippocampus (Rajah 2H3) di mana pemulihan kuasa redoks adalah ketara berbanding tikus TgAPP yang tidak dirawat. Pada lelaki, indeks ini mencapai nilai yang sama dengan tikus WT dalam hippocampus (H3). Pada wanita, walaupun nisbah ini tidak dinaikkan kepada tikus WT, rawatan dengan quercetin dan rutin meningkatkannya dengan ketara berbanding tikus TgAPP dalam hippocampi mereka (H3: quercetin, p < 0.{{ 6}}01; rutin, p < 0.05).

2.3. Bahan Reaktif Asid Thiobarbituric (TBARs)

Tahap TBAR ditentukan sebagai penanda peroksidasi lipid. Menggunakan lengkung penentukuran, hasilnya dinyatakan sebagai kepekatan malondialdehid (MDA) (Rajah 3).

Berikutan ekspresi berlebihan APP, peningkatan ketara dalam tahap MDA jika dibandingkan dengan tikus WT diperhatikan dalam kedua-dua korteks (Rajah 3C) dan hippocampus (Rajah 3H), dan dalam kedua-dua lelaki dan perempuan (p < 0.001) .

Dalam wanita TgAPP, kedua-dua rawatan quercetin dan rutin hampir memulihkan tahap MDA kepada sama seperti tikus WT (Rajah 3C, H). Dalam lelaki TgAPP, begitu juga, kedua-dua rawatan quercetin dan rutin mengembalikan tahap MDA kepada sama seperti tikus WT dalam korteks (Rajah 3C) dan menurun lebih jauh dalam hippocampus (Rajah 3H). Dalam kedua-dua tikus WT dan TgAPP, yang tidak dirawat dan dirawat dengan diet flavonoid, tahap MDA adalah bergantung kepada jantina (Rajah 3C, H; p < 0.05), kecuali tikus TgAPP yang dirawat kuersetin dalam hippocampus.

2.4. Aktiviti Enzim dan Ekspresi Enzim Antioksidan

Untuk menangani sama ada pengawalseliaan aktiviti enzimatik atau ekspresi gen enzim antioksidan utama, atau kedua-duanya, berlaku pada diet kuersetin atau rutin, penentuan aktiviti enzimatik dan tahap mRNA telah dilakukan.

Rajah 4 menunjukkan aktiviti enzim SOD, CAT, GR, dan GPx, ditentukan dalam tikus betina dan lelaki, dalam korteks serebrum (Rajah 4a) dan hippocampus (Rajah 4b).

Akibat daripada ekspresi berlebihan APP, hanya penurunan ketara dalam aktiviti CAT yang diperhatikan dalam tikus TgAPP berbanding tikus WT dalam kedua-dua korteks (Rajah 4a(C2); p < 0.05) dan hippocampus (Rajah 4b(H2); p <0.05).

Rawatan Quercetin tidak menghasilkan sebarang variasi ketara dalam aktiviti enzim berbanding tikus TgAPP, pada lelaki atau perempuan, di kawasan otak yang dikaji. Sebaliknya, haiwan yang dirawat dengan rutin mengalami peningkatan dalam aktiviti CAT dalam korteks (Rajah 4a(C2)) dan dalam aktiviti GR dalam hippocampus (Rajah 4b(H3)) dalam kedua-dua lelaki dan perempuan (p < 0 .05). Selain itu, rutin meningkatkan aktiviti CAT hippocampal dalam lelaki TgAPP (Rajah 4b (H2)) dan aktiviti GPx pada wanita (Rajah 4b (H4)).

Rajah 5 menunjukkan ekspresi gen enzim antioksidan utama, SOD, CAT, GR, dan GPx, ditentukan dalam tikus betina dan lelaki, dalam korteks serebrum (Rajah 5a) dan hippocampus (Rajah 5b).

Tiada perbezaan dalam ekspresi gen antara tikus TgAPP dan WT diperhatikan untuk enzim antioksidan utama (Rajah 5a, b). Lelaki TgAPP yang dirawat dengan rutin menunjukkan peningkatan ketara dalam ekspresi CAT dalam hippocampus (Rajah 5b(H2)). Bagi GPx hippocampal, corak yang serupa dengan CAT diperhatikan, walaupun peningkatannya tidak ketara (Rajah 5b(H4)).

2.5. Pemprosesan APP: BACE1 dan ADAM10

Keputusan aktiviti enzim BACE1 dalam kedua-dua korteks serebrum dan hippocampus pada lelaki dan perempuan ditunjukkan dalam Rajah 6, dinyatakan sebagai peratusan aktiviti mengenai tikus TgAPP yang tidak dirawat.

Dalam Rajah 6, aktiviti enzim BACE1 dalam tikus TgAPP didapati meningkat sekitar 10 peratus jika dibandingkan dengan tikus WT, dalam kedua-dua kawasan otak yang disiasat dan dalam kedua-dua jantina, dan didapati signifikan secara statistik (p < 0.05).

Peningkatan aktiviti yang diperhatikan dalam tikus transgenik telah diturunkan oleh kedua-dua rawatan quercetin dan rutin, kedua-dua dalam korteks dan dalam hippocampus. Walau bagaimanapun, ia masih boleh diperhatikan bahawa kesan rutin adalah lebih besar sedikit daripada quercetin pada lelaki.

Setelah aktiviti BACE1 diketahui, kami memutuskan untuk menjalankan kajian ekspresi gen APP, ciri utama model haiwan transgenik, dan enzim pemprosesan utamanya: BACE1 dan ADAM10. Rajah 7 menunjukkan keputusan yang diperolehi pada tikus betina dan lelaki, kedua-dua dalam korteks dan hippocampus.

Dalam kedua-dua jantina, peningkatan ketara dalam ekspresi APP lebih daripada 85 peratus telah diperhatikan mengenai tikus WT, menunjukkan ekspresi berlebihan gen kedua-dua dalam korteks serebrum (Rajah 7C1; p < 0.05) dan dalam hippocampus (Rajah 7H1; p < 0.05). Rawatan dengan kuersetin dan rutin dapat mengurangkan ungkapan ini lebih daripada 45 peratus (p <0.05) untuk kedua-dua tikus jantan dan betina di kedua-dua kawasan otak yang sedang disiasat (Rajah 7C1, H1), dengan kesannya lebih ketara dalam hippocampus ( Rajah 7H1).

Bagi ekspresi protein BACE1, walaupun aktiviti BACE1 telah diubah, tidak terdapat perbezaan yang ketara antara tikus transgenik dan bukan transgenik tanpa mengira jantina dan rawatan flavonoid yang diperiksa.

Oleh itu, kami menilai ekspresi ADAM10 yang terlibat dalam pemprosesan bukan amyloidogenik APP. Walaupun perubahan dalam ekspresi ADAM10 dalam tikus TgAPP berbanding tikus WT tidak signifikan secara statistik, sedikit penurunan diperhatikan. Mengenai rawatan flavonoid, rutin menunjukkan trend yang semakin meningkat dalam ekspresi ADAM10, baik pada lelaki dan perempuan dan di kedua-dua kawasan otak (Rajah 7C3, H3).

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】