Kajian Ketoksikan Subkronik 13-minggu 2-(l-mentoksi)etanol dalam Tikus F344

pengenalan

2-(1-mentoksi)etanol (No. CAS 38618-23-4) ialah cecair jernih dan tidak berwarna dengan bau yang khas dan digunakan secara meluas sebagai agen perasa. Jawatankuasa Pakar Bersama FAO/WHO mengenai Bahan Tambahan Makanan (JECFA) telah menilai 2-(l-metoksi)etanol sebagai agen perisa, dikategorikan sebagai bahan yang berkaitan struktur dengan mentol1. Berdasarkan kelas struktur agen perisa, 2-(l-metoksi)etanol telah diberikan kepada Kelas I. Di Amerika Syarikat dan Eropah, tahap pengambilan 2-(l-metoksi)etanol oleh manusia dianggarkan masing-masing 12 ug/orang/hari dan 0.01 ug/orang/hari, kedua-duanya di bawah ambang Kelas I 1,800 ug/orang/hari. Berdasarkan anggaran ini, adalah dianggap bahawa 2-(1-mentoksi)etanol mungkin tidak menimbulkan kebimbangan keselamatan semasa penggunaan rutin sebagai agen perasa.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg berat badan [BW])1. Walaupun menggunakan 2-(1-menthoxy)etanol sebagai agen perasa, data terhad tersedia mengenai ketoksikan dos berulang sebatian ini. Makmal kami telah menyiasat ketoksikan beberapa bahan tambahan makanan, termasuk agen perasa yang mewakili setiap kategori, dalam model tikus2–7. Untuk menjelaskan profil toksikologi dan mewujudkan tahap kesan buruk tidak diperhatikan (NOAEL), kami menjalankan 13-kajian ketoksikan subkronik minggu 2-(1-menthoxy)etanol, yang diberikan secara lisan kepada tikus F344 secara gavage.

Bahan dan Kaedah

Uji kimia

2-(1-menthoxy)etanol (Lot No. 5I0002, ketulenan 99.9%) dihasilkan oleh Takasago Int. Corp. (Tokyo, Jepun) telah disediakan oleh Bahagian Standard dan Penilaian, Jabatan Keselamatan Makanan, Kementerian Kesihatan, Buruh dan Kebajikan, Jepun, dengan sokongan Persatuan Bahan Perisa & Wangian Jepun (Tokyo, Jepun). Walaupun bahan ujian disediakan sebagai campuran isomer optik (No. CAS 38618-23-4), ia telah disahkan sebagai l-enantiomer (No. CAS 75443-64-0) ​​oleh pengeluar. Gavage oral dengan minyak jagung (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jepun) kerana kenderaan itu dipilih sebagai laluan pentadbiran kerana ketaklarutan dalam air dan kemeruapan 2-(1-menthoxy)etanol. Penyelesaian 2-(1-menthoxy)etanol disediakan setiap hari, sejurus sebelum pentadbiran. Selepas penyimpanan selama 2 jam pada suhu bilik, nisbah baki 2-(1-menthoxy) etanol dalam larutan 4, 40 dan 400 mg/mL disahkan sebagai 96.8%, 99.8% dan 96.5% , masing-masing, dengan kromatografi gas (Persatuan Pemeriksaan Jepun bagi Persekitaran Industri Makanan dan Makanan, Tokyo, Jepun).

Haiwan eksperimen

Secara keseluruhannya, 40 tikus bebas patogen spesifik jantan dan 40 betina (F344/DuCrlCrlj, 5 minggu) telah dibeli dari Charles River Laboratories Jepun (Yokohama, Jepun) dan digunakan selepas penyesuaian selama satu minggu. Semasa kajian, haiwan ditempatkan di dalam sangkar polikarbonat dengan peralatan tempat tidur yang lembut, diselenggara di dalam bilik dengan sistem penghalang untuk mengawal kitaran terang/gelap (12 jam), pengudaraan (kadar pertukaran udara 18 kali/j), suhu ( 24 ± 1 darjah ), dan kelembapan relatif (55 ± 5%). Sangkar dan peralatan tempat tidur kerepek diganti dua kali seminggu. Setiap haiwan mempunyai akses percuma kepada air paip dan diet asas (CRF-1; Oriental Yis, Tokyo, Jepun). Pada permulaan eksperimen, haiwan tersebut diperuntukkan secara rawak kepada empat kumpulan 10 tikus jantan dan betina setiap satu, berdasarkan berat badan yang diukur serta-merta sebelum memulakan rawatan dengan bahan kimia ujian.

Reka bentuk kajian

Dalam kajian awal {{0}}hari menilai 2-(1-menthoxy) etanol yang diberikan pada dos 0, 200, 400, dan 800 mg/ kg BW/ hari, berat hati mutlak dan relatif meningkat dengan ketara dalam semua kumpulan yang dirawat kedua-dua jantina (data tidak ditunjukkan). Berdasarkan keputusan ini, kami memilih dos etanol 2-(1-menthoxy) 0, 15, 60, dan 250 mg/kg BW/hari untuk pentadbiran kepada tikus jantan dan betina pada masa sekarang {{ 13}}kajian ketoksikan minggu.

Keadaan umum dan kematian dinilai setiap hari. Berat badan, serta jumlah makanan yang dibekalkan dan baki, diukur sekali setiap minggu semasa tempoh percubaan. Semua tikus berpuasa semalaman selepas menyelesaikan rawatan, dan sampel darah untuk hematologi dan biokimia serum dikumpulkan dari aorta perut di bawah anestesia penyedutan dalam menggunakan isoflurane. Reka bentuk kajian adalah oleh Garis Panduan Penetapan untuk Bahan Tambahan Makanan dan Semakan Piawaian Penggunaan Bahan Tambahan Makanan Jepun (1996) dan diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institut Sains Kesihatan Kebangsaan, Jepun.

Hematologi dan biokimia serum

Parameter hematologi berikut dianalisis menggunakan penganalisis hematologi automatik ProCyte Dx (Makmal IDEXX, Westbrook, ME, Amerika Syarikat): kiraan sel darah putih (WBC), kiraan sel darah merah (RBC), kepekatan hemoglobin (HGB), hematokrit (HCT), min isipadu korpuskular (MCV), min hemoglobin korpuskular (MCH), min kepekatan hemoglobin korpuskular (MCHC), kiraan platelet (PLT), dan sel leukosit pembezaan, termasuk neutrofil (Neut), limfosit (Limfa), monosit (Mono), eosinofil (Eosino), dan basofil (Baso). Analisis biokimia serum dilakukan oleh Oriental Yeast untuk parameter berikut: jumlah protein (TP), albumin (Alb), nisbah albumin/globulin (A/G), jumlah bilirubin (Bil), glukosa, jumlah kolesterol (T-Chol), trigliserida (TG), nitrogen urea (BUN), kreatinin (Cre), kalsium (Ca), fosforus tak organik (IP), natrium (Na), kalium (K), klorin (Cl), aspartat aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkali fosfatase (ALP), dan -glutamyl transpeptidase (-GTP).

Berat organ dan penilaian histopatologi

Nekropsi lengkap dilakukan untuk semua haiwan, dan otak, timus, paru-paru, jantung, limpa, hati, kelenjar adrenal, buah pinggang, testis, dan ovari ditimbang. Organ-organ ini, serta tisu dari saraf tunjang, saraf trigeminal, kelenjar pituitari, rongga hidung, kelenjar air liur, lidah, esofagus, trakea, aorta, kelenjar tiroid, kelenjar paratiroid, pankreas, perut, usus kecil dan besar, submandibular dan mesenterik nodus limfa, faraj, rahim, pundi kencing, kelenjar prostat, vesikel mani, epididimis, femur dan sternum dengan sumsum tulang, vertebra, otot rangka, saraf sciatic, kulit, dan kelenjar susu, telah ditetapkan dalam 10% formalin penampan neutral; kemudian, bahagian yang dibenamkan parafin disediakan dan diwarnakan dengan hematoxylin dan eosin untuk pemeriksaan histopatologi. Testis dan mata dengan kelenjar Harderian telah ditetapkan dalam fixative Bouin dan larutan Davidson, masing-masing. Tisu tulang, termasuk rongga hidung, vertebra, sternum, dan femur, dinyahkalsifikasi menggunakan campuran 10% asid formik dan 10% penimbal formalin sehingga 2 minggu. Penilaian histopatologi telah dilakukan untuk semua tisu yang diperoleh daripada haiwan dalam kumpulan kawalan dan kumpulan itu memberikan dos tertinggi melainkan sebarang lesi berkaitan rawatan diperhatikan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN IMUNITI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Imunohistokimia untuk 2u-globulin

Dalam tikus jantan, pengumpulan 2u-globulin dalam buah pinggang telah diperiksa oleh analisis imunohistokimia bahagian tertanam parafin. Untuk mendapatkan semula antigen, bahagian yang diperoleh daripada 5 tikus dalam setiap kumpulan diinkubasi dengan proteinase K (DAKO, Glostrup, Denmark) selama 1 minit pada suhu bilik. Semua bahagian telah direndam dalam 3% larutan H2O2/ metanol selama 10 minit pada suhu bilik untuk menyahaktifkan aktiviti peroksidase endogen. Selepas menyekat tindak balas tidak spesifik dengan 10% serum arnab biasa, bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi utama untuk 2uglobulin (dicairkan 1:400; antibodi 2u-globulin anti-tikus; Sistem R&D, Minneapolis, MN, Amerika Syarikat) semalaman pada suhu 4 darjah 8. Visualisasi pengikatan antibodi dilakukan menggunakan VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) dan 3,3'-diaminobenzidine. Semua bahagian telah diwarnakan dengan hematoxylin.

Analisis statistik

Varians dalam nilai data untuk berat badan semasa tempoh percubaan, serta untuk hematologi, biokimia serum, dan berat organ, telah dinilai untuk kehomogenan menggunakan ujian Bartlett. Analisis varians sehala dan ujian Kruskal-Wallis, masing-masing, digunakan untuk data homogen dan heterogen. Dalam menentukan perbezaan yang signifikan secara statistik, ujian perbandingan berganda Dunnett digunakan untuk membandingkan kumpulan kawalan dan rawatan. Perbandingan insiden dan gred histopatologi dianalisis dengan menggunakan ujian kebarangkalian tepat Fisher dan ujian Mann-Whitney U, masing-masing. nilai P bagi<0.05 were considered statistically significant.

Keputusan

Parameter dalam kehidupan, hematologi, dan biokimia serum

Tiada tanda klinikal yang ketara dicatatkan sepanjang tempoh percubaan, dan semua haiwan terselamat sehingga nekropsi yang dijadualkan. Tambahan pula, tiada perbezaan ketara dalam berat badan dan pengambilan makanan harian diperhatikan pada tikus jantan dan betina (Rajah 1A dan B).

Data hematologi dan biokimia serum ditunjukkan dalam Jadual 1 dan 2, masing-masing. Analisis hematologi mendedahkan penurunan HGB, HCT, MCV dan MCH dengan ketara dan peningkatan PLT dalam tikus jantan yang diberi 250 mg/kg BW/hari 2-(1-menthoxy)etanol (Jadual 1). Dalam biokimia serum, peningkatan ketara dalam TP, T-Chol, dan Ca dan penurunan dalam Bil dan ALP dicatatkan pada lelaki daripada kumpulan 250 mg/kg (Jadual 2). Peningkatan ketara dalam Cre dan penurunan dalam A/G telah dicatatkan pada lelaki daripada kumpulan 60 dan 250 mg/kg. Pada wanita, peningkatan ketara dalam Ca dan penurunan ALP direkodkan dalam kumpulan 60 dan 250 mg/kg, manakala peningkatan T-Chol dan pengurangan A/G, Bil, TG, AST, dan ALT dikesan dalam 250 mg. kumpulan /kg. Walaupun peningkatan ketara dalam TG dan penurunan dalam Cl diperhatikan pada lelaki yang diberikan 60 mg/kg, kekurangan sebarang hubungan dos mencadangkan bahawa perbezaan ini tidak dikaitkan dengan pendedahan kepada bahan ujian.

Berat organ

Data untuk berat organ diringkaskan dalam Jadual 3. Berat hati mutlak dan relatif meningkat dengan ketara dalam kedua-dua jantina kumpulan 250 mg/kg (Jadual 3). Peningkatan ketara dalam berat hati relatif diperhatikan pada lelaki dalam kumpulan 60 mg/kg. Pada lelaki, berat ginjal mutlak dan relatif meningkat dengan ketara dalam kumpulan 60 dan 250 mg/kg. Dalam kumpulan lelaki 250 mg/kg, peningkatan ketara dalam berat mutlak dan relatif kelenjar adrenal dan berat relatif limpa dan testis telah dicatatkan.

Histopatologi dan imunohistokimia

Data untuk penemuan histopatologi dan imunohistokimia diringkaskan dalam Jadual 4 dan 5, masing-masing. Penemuan histopatologi mendedahkan bahawa kekerapan pengumpulan butiran eosinofilik (Rajah 2A-D), tubul basofilik, dan tuangan hialin, serta keradangan interstisial fokal dalam buah pinggang, meningkat dengan ketara dalam kumpulan rawatan semua lelaki jika dibandingkan dengan kawalan. kumpulan (Jadual 4). Berdasarkan analisis imunohistokimia, tikus jantan yang dirawat dengan bahan ujian menunjukkan peningkatan dalam imunoreaktiviti 2u-globulin dalam sel epitelium tubul proksimal, menunjukkan kebergantungan dos yang jelas (Rajah 2E-H) (Jadual 5).

Semasa nekropsi, seekor tikus jantan dalam kumpulan 250 mg/kg menunjukkan pembesaran teruk pada buah pinggang kanan disebabkan oleh nefroblastoma yang berciri histologi. Walaupun nefroblastoma jarang berlaku dalam kebanyakan strain tikus9, kes ini dianggap sampingan, kerana tiada haiwan lain menunjukkan lesi yang serupa. Di samping itu, dalam kajian kekarsinogenan oral, kejadian nefroblastoma spontan pada tikus F344/DuCrlCrlj jantan dilaporkan berjulat antara 0–2.0%10. Walaupun beberapa lesi dikesan secara sporadis dalam organ lain, tiada perubahan ketara bergantung kepada rawatan dalam kejadian lesi ini jelas kelihatan.

Perbincangan

Sehingga kini, 24 ejen perisa, termasuk 2-(1-menthoxy) etanol, telah dinilai oleh JECFA sebagai bahan yang berkaitan secara struktur dengan mentol, dan semuanya disenaraikan sebagai "tiada kebimbangan keselamatan" pada tahap anggaran semasa daripada pengambilan1, 11. 2-(1-Menthoxy)etanol dikelaskan dalam subkumpulan alkohol alisiklik atau eter dan dianggap sebagai terkonjugasi terutamanya dengan asid glukuronik, diikuti dengan perkumuhan air kencing1. Walaupun nilai LD50 oral bahan-bahan ini dalam tikus agak tinggi, data daripada kajian ketoksikan dos berulang kekal terhad. Satu 13-kajian ketoksikan dos berulang minggu telah mendedahkan bahawa menthyl pyrrolidone carboxylate (CAS No. 68127-22-0), sebatian yang berstruktur berkaitan dengan mentol, boleh dikaitkan dengan peningkatan berat hati dan buah pinggang relatif pada lelaki dan perempuan Tikus Wistar. Pengumpulan 2u-globulin dalam tubulus proksimal tikus jantan juga diperhatikan pada dos 1,111 mg/kg BW/hari, dan NOAEL ditentukan sebagai 109 mg/kg BW/hari1.

Dalam 13-minggu kajian ketoksikan subkronik 2-(1-menthoxy)etanol, tiada perubahan toksikologi dalam keadaan umum, berat badan dan pengambilan makanan diperhatikan. Berikutan penilaian hematologi, kami melihat penurunan dalam HGB (96.6% kepada nilai min kawalan), HCT (96.3%), MCV (98.4%), dan MCH (98.2%) dan peningkatan dalam PLT (111%) pada lelaki 250 mg/kg kumpulan, yang dianggap sebagai pengaruh toksikologi rawatan etanol 2-(1-menthoxy). Kedua-dua berat hati mutlak (115% dalam kedua-dua jantina) dan relatif (119% pada lelaki dan 111% pada wanita) meningkat dengan ketara dalam kedua-dua jantina dalam kumpulan 250 mg/kg. Walaupun tiada perubahan histopatologi dalam hati, peningkatan tahap T-Chol serum (110% pada lelaki dan 121% pada wanita) dan TP (105% pada lelaki) dan pengurangan TG (60.1% pada wanita) dalam 250 kumpulan mg/kg menunjukkan perubahan toksik yang berkaitan dengan metabolisme lipid dan sintesis protein dalam hati. Pengurangan HGB dan MCH serta peningkatan PLT, T-Chol dan TP pada lelaki serta penurunan TG serta peningkatan berat hati mutlak dan relatif dalam kedua-dua jantina turut dikesan, dengan kepentingan statistik dalam 28-kajian awal hari (data tidak ditunjukkan ), menyokong bahawa parameter hematologi dan biokimia serum yang diubah ini, serta berat hati, bukan sampingan tetapi menguji kesan berkaitan bahan. Sebaliknya, peningkatan ketara dalam berat hati relatif yang dikesan dalam kumpulan lelaki 60 mg/kg dalam kajian ini tidak disertai dengan peningkatan berat mutlak atau perubahan dalam parameter biokimia yang berkaitan, menunjukkan bahawa peningkatan ini adalah perubahan penyesuaian.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Peningkatan ketara mutlak (120%) dan relatif (118%) berat kelenjar adrenal dalam kumpulan lelaki 250 mg/kg dianggap dikaitkan dengan bahan kimia ujian. Tambahan pula, peningkatan berat mutlak dan relatif kelenjar adrenal dalam kedua-dua jantina menunjukkan pergantungan dos yang jelas dalam 28-kajian awal hari (data tidak ditunjukkan), menunjukkan perkaitan dengan rawatan kimia ujian. Walaupun hipertrofi adrenal boleh berpunca daripada tekanan, tiada penemuan yang menunjukkan tekanan, seperti pengurangan berat badan atau atrofi timus dan organ limfoid lain, dalam kedua-dua kajian semasa dan awal. Oleh kerana mungkin tiada perubahan histopatologi dalam kelenjar adrenal walaupun dengan pengeluaran glukokortikoid terjejas dalam kes perencatan enzim yang berkaitan dengan steroidogenesis12, kemungkinan peningkatan berat kelenjar adrenal adalah penemuan toksik tidak boleh dikecualikan. Sebaliknya, peningkatan berat relatif limpa dan testis dalam kumpulan lelaki 250 mg/kg, tidak diperhatikan dalam kajian awal, dianggap toksikologi tidak penting kerana ketiadaan lesi histopatologi atau peningkatan berat mutlak yang ketara. Begitu juga, biokimia serum mendedahkan penurunan dalam A/G dan peningkatan Ca dalam kedua-dua jantina, yang dianggap tidak mempunyai kepentingan toksikologi, memandangkan tiada keabnormalan dikesan dalam parameter yang berkaitan. Tambahan pula, penurunan tahap Bil dan ALP dalam kedua-dua jantina dan penurunan AST dan ALT pada wanita adalah berbeza dengan kesan toksik yang dijangkakan dan dianggap tidak bermakna.

Nefropati kronik yang dicirikan oleh tubul basofilik, tuangan hialin, dan keradangan interstisial fokal diperhatikan dengan kepentingan statistik pada lelaki dari semua kumpulan yang dirawat. Di samping itu, peningkatan serum Cre dan berat buah pinggang mutlak dan relatif dikesan dalam kumpulan lelaki 60 dan 250 mg/kg; perubahan ini tidak diperhatikan dalam kumpulan rawatan wanita. Dalam kes ini, tahap pengumpulan granul eosinofilik dalam sel epitelium tiub proksimal telah meningkat dalam cara yang bergantung kepada dos yang jelas. Butiran ini disahkan sebagai 2u-globulin oleh imunohistokimia, menunjukkan berlakunya nefropati 2u-globulin. 2u-Globulin yang terikat kepada bahan kimia tertentu, seperti d-limonene, terkumpul dalam lisosom dan diperhatikan dalam tubul proksimal sebagai granul eosinofilik atau hialin9. Pengumpulan ini boleh merosakkan sel epitelium, yang membawa kepada nefropati progresif kronik dan seterusnya pembentukan tumor9. Oleh itu, walaupun NOAEL untuk 2-(1-menthoxy)etanol yang dikaitkan dengan nefropati 2u-globulin dalam buah pinggang tikus jantan tidak dikenal pasti, jenis nefropati ini dilaporkan khusus untuk tikus jantan dan oleh itu tidak berkaitan dengan manusia. penilaian risiko13. Peningkatan risiko kegagalan buah pinggang yang dimediasi melalui mekanisme yang berkaitan dengan pengumpulan 2u-globulin adalah sangat tidak mungkin, kerana protein ini tiada pada manusia14. Oleh itu, adalah dianggap munasabah untuk mengecualikan perubahan yang berkaitan dengan nefropati kronik yang diperhatikan pada lelaki daripada penentuan NOAEL.

Kesimpulannya, 13-kajian ketoksikan subkronik minggu ini telah menunjukkan bahawa 250 mg/kg BW/hari 2-({3}}menthoxy) rawatan etanol menyebabkan perubahan toksik dalam hematologi, biokimia serum dan berat organ. pada tikus F344 jantan dan betina. Berdasarkan keputusan yang diperhatikan, NOAEL daripada 2-(1-menthoxy)etanoltelah dinilai sebagai 60 mg/kg BW/hari untuk kedua-dua jantina.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%