Penjujukan Genom Keseluruhan Untuk Diagnosis Gangguan Pengembangan Ulangan Neurologi di UK: Ketepatan Diagnostik Retrospektif Dan Kajian Pengesahan Klinikal Prospektif

Untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Ringkasan

Latar belakang

Gangguan pengembangan berulang menjejaskan kira-kira 1 dalam 3000 individu dan merupakan penyakit heterogen secara klinikal yang disebabkan oleh pengembangan ulangan DNA serentak pendek. Ujian genetik selalunya khusus lokus, menyebabkan diagnosis kurang bagi orang yang mempunyai gambaran klinikal atipikal, terutamanya pada pesakit pediatrik tanpa sejarah keluarga positif sebelumnya. Penjujukan genom keseluruhan semakin digunakan sebagai ujian barisan pertama untuk gangguan genetik lain yang jarang berlaku, dan kami bertujuan untuk menilai prestasinya dalam diagnosis pesakit dengansarafmengulangi gangguan pengembangan.

Kaedah

Kami secara retrospektif menilai ketepatan diagnostik penjujukan seluruh genom untuk mengesan lokus pengembangan ulangan yang paling biasa yang dikaitkan dengansarafhasil (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT, dan TBP) menggunakan sampel yang diperoleh dalam Perkhidmatan Kesihatan Negara di England daripada pesakit yang disyaki mempunyaisarafgangguan; keputusan ujian PCR sebelum ini digunakan sebagai piawai rujukan. Ketepatan klinikal penjujukan keseluruhan genom untuk mengesan pengembangan berulang telah diperiksa secara prospektif dalam pesakit yang diuji secara genetik dan tidak didiagnosis sebelum ini yang direkrut pada 2013–17 ke 100 000 Projek Genom di UK, yang disyaki mempunyai genetiksarafgangguan (bentuk ataxia keluarga atau awal, neuropati, paraplegia spastik, demensia, penyakit neuron motor,parkinsonpergerakangangguan, ketidakupayaan intelek, atau gangguan neuromuskular). Jika panggilan pengembangan ulangan dibuat menggunakan penjujukan genom keseluruhan, PCR digunakan untuk mengesahkan hasilnya.

Penemuan

Ketepatan diagnostik penjujukan genom keseluruhan untuk mengesan pengembangan berulang dinilai terhadap 793 ujian PCR yang sebelum ini dilakukan dalam NHS daripada 4{15}}4 pesakit. Penjujukan genom keseluruhan dengan betul mengklasifikasikan 215 daripada 221 alel berkembang dan 1316 daripada 1321 alel tidak berkembang, menunjukkan kepekaan 97·3 peratus (95 peratus CI 94·2–99·0) dan 99·6 peratus kekhususan (99·1–99). ·9) merentasi 13 lokus berkaitan penyakit jika dibandingkan dengan keputusan ujian PCR. Dalam sampel daripada 11 631 pesakit dalam Projek Genom 100 000, penjujukan genom keseluruhan mengenal pasti 81 pengembangan ulangan, yang juga telah diuji oleh PCR: 68 telah disahkan sebagai pengembangan berulang dalam julat patogenik penuh, 11 bukan -pengembangan atau pilih atur perantaraan patogenik, dan dua adalah ulangan tidak dikembangkan (16 peratus kadar penemuan palsu).

Tafsiran

Dalam kajian kami, penjujukan genom keseluruhan untuk pengesanan pengembangan ulangan menunjukkan sensitiviti dan kekhususan yang tinggi, dan ia membawa kepada pengenalpastiansarafmengulangi gangguan pengembangan pada pesakit yang tidak didiagnosis sebelum ini. Penemuan ini menyokong pelaksanaan penjujukan genom keseluruhan dalam makmal klinikal untuk diagnosis pesakit yang mempunyaisarafpersembahan konsisten dengan gangguan pengembangan berulang.

Pembiayaan

Majlis Penyelidikan Perubatan, Jabatan Kesihatan dan Penjagaan Sosial, Perkhidmatan Kesihatan Kebangsaan England, Institut Penyelidikan Kesihatan Kebangsaan, dan Illumina.

pengenalan

Walaupun kemajuan terkini dalam pemahaman kita tentang asas genetik jarang berlakusarafgangguan, sehingga 70 peratus pesakit yang mengalami gangguan sedemikian kekal tidak didiagnosis secara genetik.1–3 Sebahagiannya, ini disebabkan oleh cabaran teknikal ujian untuk varian genetik yang kompleks dan berulang, termasuk pengembangan berulang; pengembangan sedemikian dianggarkan menjejaskan kira-kira 1 dalam 3000 orang (lampiran p 1) dan merupakan punca utama lebih daripada 40 gangguan neurogenetik,4 termasuk penyakit Huntington dan sindrom X rapuh. Gangguan pengembangan berulang adalah heterogen dari segi klinikal dan genetik, dan pengembangan berulang boleh dikaitkan dengan pelbagai penyakit. Sebagai contoh, pengembangan dalam C9orf72 boleh hadir sebagai sklerosis lateral amyotrophic atau demensia frontotemporal.5 Pengembangan berulang dalam lokus yang berbeza juga boleh menghasilkan ciri fenotip yang serupa, menjadikannya sukar untuk dibezakan secara klinikal: pengembangan ulangan dalam sekurang-kurangnya sepuluh gen ataxia spinocerebellar yang kerap hadir sebagai dewasa. -onset ataxia,6 dan mereka dalam C9orf72 dan AR boleh menyebabkan penyakit neuron motor.7,8

Gangguan pengembangan berulang disebabkan oleh peningkatan dalam bilangan jujukan DNA tandem pendek berulang, dan ambang patogenik untuk setiap gangguan adalah khusus lokus. Saiz pengembangan berbeza daripada kurang daripada 30 ulangan (cth, dalam CACNA1A) kepada beberapa ribu unit ulangan (cth, dalam FMR1, DMPK, C9orf72 dan FXN, yang boleh memanjangkan sehingga 5 kb dalam saiz). Pengembangan berulang mempamerkan ketidakstabilan molekul, yang boleh membawa kepada perubahan dalam saiz ulangan (biasanya bertambah panjang) merentas generasi dan tisu.4 Dalam keadaan ini, peningkatan bilangan ulangan selalunya membawa kepada permulaan yang lebih awal dan penyakit yang lebih teruk berturut-turut. generasi.4 Permulaan pediatrik gangguan pengembangan berulang boleh hadir sebagai sindrom multisistem tanpa tandatangan fenotip tertentu,9 dan kanak-kanak dengan gangguan ini oleh itu lebih berkemungkinan kurang didiagnosis apabila sejarah keluarga gangguan pengembangan berulang tidak hadir berbanding apabila ia hadir.10– 12

Penilaian makmal bagi pengembangan ulangan biasanya terhad kepada penilaian molekul yang disasarkan bagi lokus individu yang dipandu oleh diagnosis klinikal yang disyaki menggunakan kaedah berasaskan PCR atau Southern blot,13 yang boleh memakan kos dan memakan masa. Selain itu, disebabkan ciri fenotip yang berbeza dan bertindih bagi gangguan ini, lokus pengembangan berulang yang berkaitan dengan penyakit boleh kekal tidak diuji.14

Penjujukan genom keseluruhan muncul sebagai alat diagnostik barisan pertama pada pesakit dengan penyakit yang jarang berlaku15 tetapi, sehingga baru-baru ini, dianggap mempunyai keupayaan terhad untuk menilai lokus yang mengandungi pengembangan berulang.16 Walau bagaimanapun, kemajuan dalam bioinformatik telah membolehkan pengesanan penyakit dapat dilaksanakan. -menyebabkan pengembangan berulang daripada data penjujukan generasi akan datang.17–22 Di sini, kami melaporkan penilaian diagnostik bagi pendekatan penjujukan keseluruhan genom untuk mengesan pengembangan berulang menggunakan data PCR retrospektif, dan pengesahan klinikalnya pada pesakit dalam Projek 100000 Genom yang mempunyai gangguan neurologi yang disyaki, tidak didiagnosis dengan ujian genetik sebelumnya.

Kaedah

Reka bentuk kajian dan peserta

Penilaian penjujukan keseluruhan genom untuk pengesanan pengembangan ulangan ini termasuk kedua-dua ketepatan diagnostik dan penilaian ketepatan klinikal. Ketepatan diagnostik dinilai menggunakan data daripada pesakit yang sebelum ini telah diuji oleh PCR untuk pengembangan berulang yang diketahui menyebabkan penyakit neurologi.4 Pesakit dikenal pasti daripada dua sumber: Projek Genom 100 000 dan Makmal Genomik yang berpangkalan di Hospital Universiti Cambridge ( Cambridge, UK). Bagi kedua-dua set pesakit, ujian PCR telah dilakukan ke atas sampel pesakit oleh makmal di Perkhidmatan Kesihatan Nasional (NHS) sebagai sebahagian daripada penilaian klinikal rutin: untuk sampel dalam Projek 100000 Genom, ujian PCR dilakukan sebelum pengambilan ke projek oleh Makmal Neurogenetik Hospital Kolej Universiti London (London, UK); sampel dengan pengembangan ulangan yang disahkan PCR diperoleh daripada pesakit yang diuji oleh Makmal Genomik yang berpangkalan di Cambridge. Pesakit dengan keputusan ujian PCR-positif dan PCR-negatif untuk gangguan pengembangan berulang telah dikenal pasti untuk dimasukkan dalam kajian kami melalui sistem rekod makmal; semua pesakit telah memberikan kebenaran termaklum bertulis untuk menggunakan sampel mereka untuk jaminan kualiti dan tujuan penyelidikan dan latihan, sebagai sebahagian daripada pengoptimuman dan pengesahan perkhidmatan klinikal.

Penjujukan genom keseluruhan bagi setiap sampel telah dilakukan di salah satu daripada dua makmal: Genomics England (Hinxton, UK) untuk sampel 100000 Projek Genom (n=254) dan Makmal Perkhidmatan Klinikal Illumina (ICSL; San Diego, CA, USA) untuk sampel yang diperoleh oleh Makmal Genomik yang berpangkalan di Cambridge (n=150). Secara keseluruhannya, set data ini digunakan untuk bahagian ketepatan diagnostik kajian, dan terdiri daripada data penjujukan PCR dan keseluruhan genom daripada 404 pesakit, meliputi 13 lokus yang mewakili gangguan pengembangan ulangan neurologi yang paling biasa: 11 lokus yang dikaitkan dengan ataxia dan lewat- gangguan neurodegeneratif permulaan (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72, dan FXN), satu lokus yang dikaitkan dengan ketidakupayaan intelektual (FMR1), dan satu lokus yang dikaitkan dengan distrofi miotonik (DMPK). Bagi setiap lokus, data ujian PCR tersedia untuk sekurang-kurangnya satu alel berkembang (lampiran p 24).

Ketepatan klinikal dinilai dengan memeriksa kesesuaian pengembangan ulangan, seperti yang dikesan dengan penjujukan genom keseluruhan, dengan diagnosis klinikal yang disyaki selepas pengesahan PCR pada pesakit yang disyaki gangguan neurologi genetik (bentuk ataxia keluarga atau permulaan awal, neuropati, paraplegia spastik, demensia. , penyakit neuron motor,parkinsongangguan pergerakan, ketidakupayaan intelektual, atau gangguan neuromuskular) direkrut ke Projek 100000 Genom pada 2013–17. Projek 100000 Genom ialah program UK untuk menilai nilai penjujukan keseluruhan genom pada pesakit yang mempunyai keperluan diagnostik yang tidak terpenuhi dalam penyakit jarang dan kanser. Berikutan kelulusan etika untuk Projek 100000 Genom oleh Jawatankuasa Etika Penyelidikan Cambridge Selatan East of England (rujukan 14/EE/1112), termasuk untuk analisis data dan pengembalian penemuan diagnostik kepada pesakit, pesakit ini telah direkrut oleh profesional penjagaan kesihatan dan penyelidik dari 13 Pusat Perubatan Genomik di England dan telah didaftarkan dalam projek jika mereka atau penjaga mereka memberikan kebenaran bertulis untuk sampel dan data mereka untuk digunakan dalam penyelidikan, termasuk kajian ini. Proband dan, jika boleh, ahli keluarga yang lain, telah didaftarkan mengikut kriteria kelayakan yang ditetapkan untuk keadaan penyakit jarang tertentu (lampiran ms 5–11). Pesakit telah direkrut ke Projek 100000 Genom selepas ujian genetik standard penjagaan di NHS, seperti yang ditunjukkan dalam kriteria kelayakan. Data klinikal garis dasar piawai telah direkodkan menggunakan Human Phenotyping Ontology (HPO)23 terhadap model data khusus penyakit.24 Status penyakit ahli keluarga, berbanding petunjuk klinikal proband untuk ujian, juga dikumpul.

Untuk mengenal pasti pengembangan berulang kausatif pada pesakit dengan penyakit yang tidak didiagnosis secara genetik, kami menguji pesakit yang disyaki gangguan genetik yang konsisten dengan penyakit pengembangan berulang. Pesakit dipilih berdasarkan kesesuaian penyakit mereka dan istilah HPO dengan gangguan berkaitan pengembangan berulang. Data penjujukan keseluruhan genom pesakit telah disoal siasat untuk mencari pengembangan dalam set ulangan tertentu menggunakan empat panel pengembangan ulangan yang berbeza mengikut ciri klinikal mereka (lampiran p 5). Pengembangan berulang yang dipilih untuk dimasukkan pada panel ini adalah lokus pengembangan berulang yang menyebabkan penyakit neurologi yang paling biasa. Pesakit dengan ciri klinikal yang berpotensi serasi dengan lebih daripada satu gangguan pengembangan berulang telah diuji pada berbilang panel. Jika panggilan pengembangan berulang dibuat menggunakan penjujukan genom keseluruhan, ujian pengesahan oleh PCR dilakukan.

Bagi setiap pesakit dengan pengembangan ulangan yang disahkan, doktor tempatan dimaklumkan tentang hasil diagnostik yang berpotensi, dan sumbangan pengembangan ulangan kepada ciri klinikal pesakit telah dinilai. Untuk pengembangan berulang yang menerangkan sepenuhnya atau sebahagian ciri klinikal pesakit, laporan diagnostik telah dikeluarkan mengikut prosedur standard tempatan.

Prosedur

Untuk sampel sejarah NHS yang digunakan dalam bahagian ketepatan diagnostik kajian kami, pengembangan ulangan sebelum ini telah diuji menggunakan amplifikasi PCR dan analisis serpihan. Southern blotting telah dilakukan untuk pengembangan C9orf72 yang besar. Dalam bahagian ketepatan klinikal kajian kami, pengembangan ulangan yang dikesan oleh penjujukan genom keseluruhan pada pesakit daripada 100 000 Projek Genom telah diuji oleh PCR dalam sampel yang disimpan di makmal genetik NHS. Butiran tambahan, termasuk urutan primer, disediakan dalam lampiran (ms 2–3, 25–26).

DNA telah disediakan untuk penjujukan genom keseluruhan menggunakan penyediaan perpustakaan TruSeq DNA PCR-Free, dan penjujukan akhir berpasangan 150 bp atau 125 bp dilakukan pada sama ada platform HiSeq 2000 atau HiSeq X di kemudahan genom throughput tinggi untuk Genomics England, dan di ICSL. . Genom telah disusun dengan kedalaman purata 35 × (31 × hingga 37 ×; lampiran p 27). Genotaip ulangan pendek-tandem telah dilakukan menggunakan pakej perisian ExpansionHunter versi 3.1.2.25,26 Secara ringkasnya, ExpansionHunter menjajarkan semula bacaan penjujukan merentas set ulangan tandem pendek yang telah ditetapkan untuk menganggarkan saiz kedua-dua alel daripada individu (lampiran ms 3).

Output ExpansionHunter termasuk anggaran bilangan elemen ulangan, saiz keseluruhan dan had keyakinan untuk setiap lokus yang dinilai. Garis panduan daripada Persatuan Patologi Perubatan dan Kolej Pakar Patologi Amerika mengesyorkan pemeriksaan visual bagi panggilan varian semasa penilaian rutin bagi varian penjujukan throughput tinggi.27

Walau bagaimanapun, varian ulangan tandem pendek tidak boleh digambarkan secukupnya oleh alat visualisasi biasa seperti Integrative Genomics Viewer.28 Untuk memeriksa keseluruhan data penjujukan genom yang mendasari setiap panggilan genotip, alat visualisasi graf telah digunakan, yang membolehkan visualisasi langsung haplotip dan timbunan bacaan yang sepadan. genotip ExpansionHunter (lampiran ms 3, 15). Pemeriksaan visual graf timbunan telah dilakukan pada semua panggilan ulangan sebaris pendek penjujukan genom keseluruhan untuk mengesahkan bahawa ramalan ExpansionHunter untuk alel terkandung sepenuhnya dalam setiap bacaan (iaitu, urutan ulangan adalah lebih kecil daripada panjang bacaan penjujukan); untuk mengesahkan kehadiran pengembangan monoallelic atau dwialelik; untuk mengesan panggilan positif palsu yang diduga; dan untuk mengesan alel negatif palsu dalam pengembangan ulangan dwilelik, seperti FXN (lampiran ms 4, 16).

ExpansionHunter menganggarkan saiz ulangan daripada data penjujukan genom keseluruhan dengan menganalisis bacaan penjujukan yang sepenuhnya atau sebahagiannya mengandungi ulangan serentak pendek. Jika alel ulangan tandem pendek lebih pendek daripada panjang bacaan, ExpansionHunter meramalkan saiz yang tepat; jika alel ulangan tandem pendek lebih panjang daripada panjang bacaan, ExpansionHunter menganggarkan saiz ulangan dalam CI, bergantung pada komposisi jujukan lokus, kedalaman jujukan dan kualiti jujukan.

Analisis statistik

Kami mengklasifikasikan ulangan sebagai diperluaskan oleh penjujukan genom keseluruhan jika saiz yang diramalkan oleh ExpansionHunter berada di atas potongan pramutasi, atau tidak berkembang jika saiz yang diramalkan berada di bawah potongan (lampiran p 28).

Kepekaan dan CI untuk pengesanan pengembangan ulangan penjujukan keseluruhan genom dikira sebagai perkadaran alel dengan ulangan diperluas antara alel yang disahkan PCR sebelum ini dengan ulangan diperluas. Kekhususan dianggarkan sebagai perkadaran alel tidak berkembang antara ulangan tidak berkembang yang diuji sebelumnya oleh PCR. Penerangan penuh tentang formula statistik disediakan dalam lampiran (ms 1).

Untuk membandingkan saiz ulangan oleh PCR dengan anggaran saiz ulangan oleh penjujukan genom keseluruhan, alel terkuantiti PCR dibandingkan dengan saiz ulangan yang diramalkan oleh ExpansionHunter untuk alel yang lebih pendek daripada panjang bacaan merentas semua 13 lokus ulangan tandem pendek. Konkordans dikira mengikut peratusan saiz ulangan yang diramalkan oleh ExpansionHunter yang selaras dengan saiz terkuantiti PCR, dengan mengambil kira ralat PCR tambah atau tolak satu ulangan. Analisis statistik dilakukan menggunakan perisian statistik R versi 3.6.3.

Peranan sumber pembiayaan

Reka bentuk kajian, pendaftaran pesakit, pengumpulan data, dan penjujukan diketuai oleh pekerja Genomics England dan penyelidik akademik. Pekerja Illumina melakukan penjujukan 150 sampel pesakit sebagai komponen terancang bagi keseluruhan kajian ketepatan diagnostik penjujukan genom dan membangunkan ExpansionHunter. Pekerja Genomics England, penyelidik akademik dan pengarang bersama RTH, ED dan MAE melakukan analisis dan tafsiran pengembangan berulang dalam pesakit yang direkrut ke 100 000 Projek Genom. Sumber pembiayaan tidak mempunyai peranan dalam tafsiran data atau penulisan laporan.

Keputusan

Ketepatan diagnostik penjujukan keseluruhan genom untuk mengesan pengembangan ulangan dinilai terhadap 793 ujian PCR yang sebelum ini dilakukan dalam NHS daripada 404 pesakit (64 pesakit telah diuji untuk lebih daripada satu ulangan; angka 1). Daripada ujian ini, 183 diklasifikasikan sebagai mempunyai ulangan yang diperluas dan 610 sebagai tidak mempunyai pengembangan ulangan oleh PCR, menghasilkan sejumlah 221 alel individu yang berkembang dan 1321 tidak berkembang merentas 13 lokus penyakit (lampiran pp 24, 28). Penjujukan genom keseluruhan dengan betul mengklasifikasikan 215 daripada 221 alel berkembang dan 1316 daripada 1321 alel tidak berkembang berbanding dengan keputusan ujian PCR (lampiran ms 27, 29), menunjukkan sensitiviti awal 97·3 peratus (95 peratus CI 94·2–99 ·0) dan kekhususan 99·6 peratus (99·1–99·9; jadual 1). Berikutan pembetulan visual semua panggilan berdasarkan kualiti bacaan, sensitiviti meningkat kepada 99·1 peratus (96·8–99·9) dan kekhususan kepada 100 peratus (99·7–100; rajah 2A, jadual 1). Visualisasi alel yang diperluaskan membolehkan pengesanan keputusan positif palsu dan pengelasan semula semua alel negatif palsu dalam FXN, yang mana hanya satu alel dikelaskan dengan betul sebagai diperluas dalam sampel dengan pengembangan dwialel (lampiran ms 17, 18).

Panjang ulangan dikira oleh PCR dalam 509 ujian PCR yang menyoal siasat 945 alel merentasi 13 lokus pengembangan ulangan. Korelasi antara ExpansionHunter dan PCR untuk saiz ulangan yang lebih pendek dan lebih besar daripada panjang bacaan jujukan (iaitu, 150 bp) ditunjukkan dalam lampiran (lampiran ms 19). Konkordans tinggi diperhatikan untuk ulangan yang lebih pendek daripada panjang bacaan, dengan 92·7 peratus (836 daripada 902) persetujuan antara PCR dan ExpansionHunter. Kebolehubahan lokus diperhatikan, dengan kesesuaian tinggi antara ExpansionHunter dan PCR untuk ATXN2, ATXN7, CACNA1A, dan HTT, dan konkordans rendah untuk DMPK atau TBP (lampiran p 30). Panjang alel yang lebih besar daripada panjang bacaan telah dipandang remeh oleh ExpansionHunter, yang menjejaskan ketepatan panggilan dalam DMPK, FMR1, dan FXN (rajah 2B, lampiran ms 19, 31).

Walaupun ExpansionHunter dapat mengenal pasti dengan betul alel berkembang besar dalam FMR1, DMPK, C9orf72, dan FXN (lampiran p 29), anggaran saiz yang diramalkan cenderung lebih rendah daripada yang diperolehi oleh PCR apabila saiz ulangan meningkat dalam julat patogenik, yang menjejaskan keupayaan untuk membezakan antara pengembangan besar dan kecil dalam DMPK, C9orf72 dan FXN, atau antara pengembangan penuh dan pilih atur dalam FMR1 (lampiran ms 31). Contohnya, lokus dengan panjang ulangan dinilai PCR lebih besar daripada 200 ulangan dalam FMR1 dan diklasifikasikan sebagai mutasi penuh mempunyai saiz ulangan min yang dianggarkan oleh ExpansionHunter sebanyak 92·6 (SD 17·8; lampiran p 31).

Untuk menguji keupayaan pengesanan pengembangan berulang dengan penjujukan genom keseluruhan untuk menyelesaikan diagnosis pesakit yang diuji sebelum ini dan pesakit yang tidak didiagnosis secara genetik, kami menguji 11 631 pesakit yang disyaki mengalami gangguan neurologi genetik yang direkrut ke Projek 100000 Genom (rajah 1). Data penjujukan genom keseluruhan dinilai menggunakan empat panel pengembangan ulangan yang berbeza mengikut ciri klinikal pesakit. Bilangan pesakit yang diuji dengan setiap empat panel ditunjukkan dalam jadual 2.

Secara keseluruhannya, kami mengesan dan mengesahkan pengembangan berulang secara visual dalam sampel daripada 105 pesakit (jadual 2, lampiran ms 20, 33). Daripada jumlah ini, 81 sampel tersedia untuk ujian pengesahan oleh PCR dan 68 telah disahkan mempunyai pengembangan berulang (0·6 peratus hasil): 45 (1·2 peratus ) daripada 3692 dalam panel A, lapan ({ {18}}·3 peratus ) daripada 2743 dalam panel B, lima (0·6 peratus ) daripada 860 dalam panel C dan sepuluh (0·1 peratus ) daripada 6731 dalam panel D. Tiga belas daripada 81 panggilan pengembangan tidak disahkan sebagai pengembangan ulangan patogen (16 peratus kadar penemuan palsu). Daripada jumlah ini, dua adalah alel tidak berkembang dalam ATXN1 dan ATXN2, empat adalah panggilan saiz pertengahan FMR1 (lampiran p 21), dan tujuh adalah pilih atur FMR1.

Butiran klinikal 68 pesakit dengan pengembangan berulang yang disahkan oleh PCR, termasuk persembahan klinikal mereka, pengembangan berulang yang dikenal pasti, dan sumbangan pengembangan berulang kepada ciri klinikal pesakit disediakan dalam jadual 3; syarat HPO, saiz ulangan yang dianggarkan oleh ExpansionHunter, dan sama ada laporan diagnostik telah dikeluarkan disenaraikan dalam lampiran (ms 33).

Pengembangan diperhatikan pada pesakit yang menunjukkan pelbagai jenis pembentangan klinikal bertindih yang diuji dengan panel A (jadual 3, lampiran p 22), termasuk pengembangan ulangan ATXN2 pada pesakit dengan penyakit Parkinson awal responsif levodopa dan sejarah ataksia cerebellar progresif. , dan pengembangan AR dalam empat pesakit yang didiagnosis secara klinikal dengan penyakit Charcot-Marie-Tooth, termasuk satu dengan neuropati demielinasi yang disahkan secara genetik (iaitu, penyakit Charcot-Marie-Tooth jenis 1, pesakit 42; lampiran p 33). Pelbagai diagnosis klinikal terdahulu diperhatikan pada pesakit dengan pengembangan ulangan patogenik.

Sebagai contoh, dalam tujuh pesakit dengan sklerosis lateral amyotrophic atau penyakit neuron motor lain, pengembangan dikenal pasti dalam AR (n=4) dan C9orf72 (n=3). Pada pesakit yang disyaki ataxia keturunan, kami mengenal pasti pengembangan dalam lokus yang belum dinilai sebagai sebahagian daripada pemeriksaan diagnostik rutin dalam NHS pada masa pengambilan, termasuk ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP, dan HTT ( jadual 3). Kami juga mengesan pengembangan berulang pada pesakit dengan ciri klinikal yang konsisten dengan gangguan pengembangan ulangan alternatif, termasuk pengembangan C9orf72 dalam penyakit Parkinson awal dan keluarga (pesakit 24, Jadual 3) dan pengembangan ulangan dalam julat penetrasi yang dikurangkan dalam HTT (38 ulangan) dalam dua saudara perempuan yang mengalami gangguan pergerakan, demensia, kemurungan, dan masalah pertuturan (pesakit 44 dan 45), menggariskan cabaran diagnostik yang dikemukakan oleh gangguan pengembangan berulang ini.

Lapan kanak-kanak yang diuji dengan panel B didapati mempunyai pengembangan ulangan CAG yang besar (rajah 3), tujuh daripadanya menerangkan sepenuhnya ciri klinikal pesakit. Enam pesakit tidak mempunyai sejarah keluarga yang bermaklumat dan tidak ditawarkan ujian pengembangan berulang sebagai sebahagian daripada penilaian klinikal mereka pada masa pengambilan (pesakit 48-53; jadual 3, lampiran p 33). Dua daripada kanak-kanak ini membawa pengembangan HTT yang besar (90–100 ulangan CAG). Daripada catatan, seorang kanak-kanak telah mewarisi pengulangan daripada ibu bapa yang tidak terjejas tanpa sejarah keluarga penyakit Huntington. Ujian keluarga sedang dijalankan, tetapi alel penetrasi berkurangan telah dikenal pasti dalam keluarga lanjutan, menunjukkan bahawa ulangan telah berkembang lebih 60 unit ulangan dalam satu generasi (pesakit 52). Pada masa penulisan, tiada seorang pun dalam keluarga menunjukkan tanda-tanda penyakit Huntington, dan kaunseling dan ujian genetik sedang dijalankan untuk ibu bapa. Dua kanak-kanak yang lebih muda daripada 5 tahun membawa pengembangan berulang yang besar dalam ATXN7 dan dibentangkan dengan penyakit pelbagai sistem yang kompleks. Bagi salah seorang daripada kanak-kanak ini (pesakit 50), ibu bapa mereka menunjukkan masalah berjalan 2 tahun selepas pendaftaran dalam Projek 100000 Genom. Begitu juga, seorang kanak-kanak perempuan berumur 10 tahun kurang upaya intelek didapati mengalami 99-pengembangan berulang dalam ATXN2, walaupun pada hakikatnya kedua-dua ibu bapa telah ditetapkan sebagai tidak terjejas, dan seorang gadis berumur 18 tahun dengan demensia didapati membawa { {19}}ulang pengembangan dalam ATN1 (lampiran ms 33).

Lima pengembangan dalam DMPK (panel C) telah dikesan, termasuk pada seorang kanak-kanak dan seorang ibu dengan diagnosis klinikal distrofi otot, dalam dua adik-beradik dengan disyaki miopati distal, dan pada seorang remaja dengan miopati kongenital (pesakit 54-58). Pengembangan FMR1 (panel D) dikesan dalam sembilan lelaki dan seorang perempuan, dan diagnosis sindrom Fragile X sepenuhnya atau sebahagiannya menjelaskan ciri-ciri klinikal yang ditunjukkan (pesakit 59-68).

Perbincangan

Diagnosis gangguan pengembangan berulang adalah mencabar dalam penjagaan kesihatan disebabkan oleh ciri klinikal yang heterogen dan bertindih serta penemuan klinikal yang tidak spesifik, yang boleh meningkat dalam keterukan dengan usia dan dalam setiap generasi berikutnya. Gangguan pengembangan berulang adalah antara punca paling biasa penyakit saraf yang diwarisi.4 Namun begitu, pesakit mungkin kurang didiagnosis, sama ada kerana ujian genetik yang tidak mencukupi telah dijalankan atau kerana varian genetik penyebab masih belum ditemui. Pendekatan ujian pada masa ini berpecah-belah, dan pesakit mungkin menguji lokus pengembangan ulangan yang salah29 atau menerima ujian molekul untuk kelas varian yang berbeza disebabkan pertindihan ciri klinikal dengan gangguan genetik neurologi yang lain.30

Penjujukan genom keseluruhan telah digunakan dalam berbilang tetapan sebagai ujian diagnostik barisan pertama untuk gangguan neurologi yang jarang berlaku tetapi sebelum ini dianggap mempunyai keupayaan rendah untuk mengesan pengembangan berulang.16 Beberapa alat telah dibangunkan untuk mengenal pasti pengembangan berulang daripada genom keseluruhan. penjujukan dalam tetapan penyelidikan, 31 tetapi tiada pendekatan ini telah digunakan untuk data penjujukan genom keseluruhan yang dikumpul daripada sebilangan besar pesakit dalam perkhidmatan penjagaan kesihatan tunggal. Kami membentangkan bukti bahawa algoritma yang direka untuk mengesan pengembangan berulang daripada penjujukan genom keseluruhan boleh menilai dengan pasti pengembangan berulang yang menyebabkan penyakit yang paling biasa dan menyelesaikan kes yang tidak didiagnosis secara genetik sebelum ini dalam kohort besar pesakit dengan gangguan neurologi. Keputusan kami menunjukkan bahawa penjujukan genom keseluruhan boleh membezakan antara alel tidak berkembang dan alel berkembang dengan kepekaan dan kekhususan yang tinggi merentasi 13 lokus pengembangan ulangan (yang boleh dipertingkatkan lagi dengan pemeriksaan visual), boleh mengira dengan tepat saiz alel yang lebih kecil daripada panjang bacaan. , dan mungkin memandang rendah saiz pengembangan besar dalam FMR1, DMPK, FXN dan C9orf72.

Apabila pengesanan pengembangan berulang oleh penjujukan genom keseluruhan dinilai terhadap keputusan positif dan negatif yang diperoleh sebelum ini di makmal genom diagnostik klinikal menggunakan kaedah standard emas, kami mendapati sekurang-kurangnya 97·3 peratus sensitiviti dan 99·6 peratus kekhususan. Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa kedua-dua kekhususan dan kepekaan boleh dipertingkatkan dengan penyusunan manual timbunan bacaan, membolehkan pengesanan keputusan positif palsu dan pengelasan semula alel negatif palsu dalam sampel dengan pengembangan dwiallelik. Daripada 6731 pesakit yang diuji untuk FMR1 (panel D), 124 panggilan diramalkan akan diperluaskan. Kami dapat mengecualikan 97 melalui pemeriksaan visual sebagai kemungkinan positif palsu. Ini menunjukkan bahawa 1 dalam 54 ujian penjujukan genom keseluruhan akan mempunyai panggilan FMR1 yang perlu diperiksa secara visual untuk membuang kemungkinan panggilan positif palsu. Kerja sedang dijalankan untuk menambah baik kaedah genotaip ExpansionHunter untuk mengurangkan bilangan panggilan positif palsu untuk FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 ulangan) menyebabkan penyakit yang lebih teruk, dan spinocerebellar ataxia jenis 36 (NOP56), yang mana pengembangan lebih besar daripada 650 ulangan dianggap patogenik dan saiz ulangan 15-650 dianggap pertengahan dan varian yang tidak pasti kepentingannya.

Lebih daripada 40 lokus pengembangan berulang telah dikenal pasti; kebanyakan lokus ini hanya dikenal pasti baru-baru ini dan kini dikaitkan dengan keadaan yang tidak dapat dijelaskan sebelum ini, termasuk ataxia cerebellar dengan neuropati dan sindrom areflexia vestibular (RFC1) 32 dan epilepsi mioklonik (SAMD12).33 Lokus pengembangan berulang yang menyebabkan penyakit neurologi yang paling biasa adalah. dipilih untuk kajian kami berdasarkan ketersediaan sampel kawalan positif dan negatif.

Penemuan yang dibentangkan di sini mencadangkan bahawa ExpansionHunter sepatutnya dapat mengklasifikasikan alel tidak berkembang dan berkembang dengan tepat di mana-mana lokus pengembangan ulangan jika alel tidak berkembang lebih kecil daripada panjang bacaan (iaitu, 150 bp). Walaupun kebanyakan lokus pengembangan ulangan mempunyai alel yang lebih kecil daripada 150 bp apabila tidak dikembangkan, sesetengah lokus yang saiz alel tidak dikembangkan adalah hampir kepada 150 bp (cth, NOTCH2NLC)34 mungkin lebih sukar untuk genotip menggunakan pendekatan ini. Untuk lokus di mana ulangan yang diperluaskan jauh lebih besar daripada panjang bacaan, penjujukan genom keseluruhan boleh mengesan pengembangan patogen (cth, NOP56,35 RFC120,32). Teknologi penjujukan bacaan lama yang muncul mungkin menawarkan pendekatan pelengkap apabila genotaip pengembangan besar.36

Penilaian pengembangan berulang menggunakan penjujukan genom keseluruhan dalam 11 631 pesakit yang tidak didiagnosis yang direkrut ke 100 000 Projek Genom menghasilkan 68 pesakit dengan penemuan penjelasan. Pesakit telah direkrut ke 100 000 Projek Genom selepas ujian genetik standard penjagaan; oleh itu, perkadaran pengembangan berulang yang dikenal pasti dalam kohort ini mewakili peningkatan hasil diagnostik daripada ujian NHS standard, yang merangkumi ujian khusus lokus untuk gangguan pengembangan berulang seperti FXN atau DMPK. Daripada nota, beberapa diagnosis tidak disyaki berdasarkan ciri klinikal pesakit, termasuk enam pesakit pediatrik yang tidak mempunyai sejarah keluarga yang diketahui mengalami gangguan pengembangan berulang. Saiz pengembangan ulangan min yang diramalkan oleh penjujukan genom keseluruhan dalam pesakit pediatrik yang diterangkan dalam kajian ini adalah jauh lebih besar daripada purata pada orang dewasa, selaras dengan jangkaan bahawa pengembangan yang lebih besar dikaitkan dengan permulaan yang lebih awal dan lebih teruk, walaupun pada kanak-kanak. Kerja lanjut diperlukan, tetapi penemuan ini menunjukkan bahawa penilaian patogenikiti yang bergantung kepada umur dan bergantung kepada saiz mungkin menyokong diagnosis pediatrik dengan mengurangkan potensi bahaya untuk mengenal pasti alel risiko permulaan dewasa, yang membawa kepada ujian ramalan yang tidak diminta pada kanak-kanak.

Penemuan kami membolehkan penubuhan aliran kerja diagnostik klinikal untuk penjujukan genom keseluruhan (lampiran p 23). Kami mencadangkan agar pemeriksaan visual dilakukan untuk semua panggilan yang diklasifikasikan sebagai dikembangkan untuk mengesan positif palsu, dan untuk pengembangan dwilelik yang hanya satu alel dikembangkan telah dikesan (cth, FXN). Kami mengesyorkan agar makmal menggunakan ExpansionHunter untuk menilai kehadiran pengembangan tanpa mematuhi anggaran saiz dan melaksanakan ujian PCR pengesahan sebagai komponen standard aliran kerja ujian.

Penyakit yang jarang diwarisi termasuk pelbagai ciri klinikal, menjadikan ujian genomik khusus lokus tidak cekap, sukar dan mahal. Kami membentangkan bukti bahawa penjujukan genom keseluruhan gred klinikal dengan potensi untuk mendiagnosis pelbagai penyakit neurologi yang jarang berlaku yang biasanya ditunjukkan dengan varian nombor asas, indel, atau salinan tunggal kini boleh dilanjutkan untuk mengulangi pengembangan. Oleh kerana penjujukan genom keseluruhan menyediakan satu ujian yang boleh mengenal pasti pengembangan ulangan yang paling biasa, serta membolehkan ujian mutasi titik dan varian nombor salinan dalam gen yang dikaitkan dengan keadaan ini secara serentak, ia menawarkan peluang untuk mengenal pasti kebanyakan pesakit dengan gangguan heterogen ini. yang belum didiagnosis menggunakan ujian khusus lokus. Dalam era terapi baru muncul untuk gangguan ini, pengesanan awal mungkin menjadi penting.37 Keputusan ini menyokong pelaksanaan penjujukan genom keseluruhan untuk pengesanan pengembangan berulang dalam makmal diagnostik klinikal, pendekatan yang telah pun dimasukkan ke dalam NHS England National Genomic. Direktori Ujian,38 untuk penyiasatan penyakit saraf jarang yang tidak didiagnosis.

Rujukan

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Siling diagnostik untuk penjujukan exome dalam ataxia cerebellar dan gangguan neurologi yang berkaitan. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Paraplegia spastik keturunan di Greece: pencirian populasi yang belum diterokai sebelum ini menggunakan penjujukan generasi seterusnya. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Hasil diagnostik panel gen penjujukan generasi seterusnya yang disasarkan untuk gangguan pergerakan permulaan kanak-kanak: kajian kohort 3-tahun. Genet Depan 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Penyakit pengembangan berulang. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 demensia frontotemporal dan/atau amyotrophic lateral sclerosis. Seattle, WA: Universiti Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. ataxia spinocerebellar. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Neurogenetik klinikal: ataxia spinocerebellar dominan autosomal. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Atrofi otot tulang belakang dan bulbar. Dalam: Ahli Parlimen Adam, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: Universiti Washington, 1999.

9 Gousse G, H Asli, Touraine R, et al. Bentuk maut ataxia spinocerebellar jenis 7 dengan onset awal pada zaman kanak-kanak. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Pengagregatan ataxin-7 dan ubiquitination dalam SCA7 kanak-kanak dengan ulangan 180 CAG. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellar ataxia jenis 2 menunjukkan regresi kognitif pada zaman kanak-kanak. J Kanak-kanak Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Ataxia 3 spinocerebellar permulaan kanak-kanak: dystonia lidah sebagai manifestasi awal. Gegaran Lain Hyperkinetic Mov 2019; diterbitkan dalam talian pada 13 Sept.

13 Burung TD. Jenis distrofi miotonik 1. Dalam: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: Universiti Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Kekerapan pengembangan ulangan SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS dan C9orf72 dalam pesakit SCA negatif untuk subjenis SCA yang paling biasa. BMC Neurol 2018; 18: 3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Penjujukan genom keseluruhan pesakit dengan penyakit jarang dalam sistem kesihatan negara. Alam Semula Jadi 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Ke arah perubatan ketepatan. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Utiliti diagnostik dan klinikal penjujukan keseluruhan genom dalam kohort keluarga Cina yang tidak didiagnosis dengan penyakit jarang berlaku. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Memprofilkan landskap seluruh genom bagi pengembangan ulangan seiring. Asid Nukleik Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Mengesan pengembangan ulangan tandem dalam kohort yang dijujukan dengan data penjujukan bacaan pendek. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Pengenalpastian berasaskan bioinformatik bagi ulangan yang diperluaskan: pengembangan pentamer intronik bukan rujukan dalam RFC1 menyebabkan CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Pagi Kasar, Ajay SS, Rajan V, et al. Varian nombor salinan dalam penjujukan genom klinikal: penggunaan dan tafsiran untuk penyakit jarang dan tidak didiagnosis. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Pengesanan seluruh genom bagi ulangan DNA tandem yang diperluaskan dalam autisme. Alam Semula Jadi 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ontologi Fenotip Manusia: alat untuk menganotasi dan menganalisis penyakit keturunan manusia. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomik England. Model data klinikal keadaan penyakit jarang berlaku. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (diakses pada 4 Ogos 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Pengesanan pengembangan ulangan yang lama daripada data jujukan keseluruhan genom tanpa PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: alat berasaskan graf jujukan untuk menganalisis variasi dalam kawasan ulangan serentak pendek. Bioinformatik 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Piawaian dan garis panduan untuk mengesahkan saluran paip bioinformatik penjujukan generasi akan datang: cadangan bersama Persatuan Patologi Molekul dan Kolej Patologi Amerika. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Pemapar genomik bersepadu. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Kehomogenan fenotip pembentangan seperti penyakit Huntington dalam keluarga SCA17. Neurologi 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Penyakit Bird T. Huntington, penyakit Huntington yang serupa, dan korea keturunan jinak: apa yang baharu? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Kemajuan terkini dalam pengesanan pengembangan ulangan dengan penjujukan generasi seterusnya yang dibaca pendek. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Pengembangan biallelik ulangan intronik dalam RFC1 adalah punca biasa ataksia lewat lewat. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Pengembangan TTTCA dan TTTTA intronik berulang dalam epilepsi mioklonik keluarga dewasa jinak. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Pengembangan ulangan CGG bukan pengekodan dalam penyakit kemasukan intranuklear neuron, myopathy oculopharyngodistal, dan penyakit bertindih. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Diagnosis pantas spinocerebellar ataxia 36 dalam keluarga tiga generasi menggunakan data penjujukan genom keseluruhan bacaan pendek. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Penjujukan yang dibaca panjang muncul dalam genetik perubatan. Genet Depan 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Gangguan pengembangan berulang: mekanisme dan terapeutik. Neurotherapeutics 2019; 16: 924–27.

38 Sistem Kesihatan Negara. Direktori Ujian Genomik Kebangsaan: kriteria ujian untuk penyakit jarang dan diwarisi. Oktober, 2021.