Keberkesanan Pemutihan Ginsenoside F1 Melalui Perencatan Pemindahan Melanin dalam Melanocytesekeratinocytes Manusia Berkultur Dan Setara Kulit Manusia Tiga Dimensi

Ginsenosides adalah bahan aktif utama ginseng. Dalam fisiologi kulit, ginsenosides menjejaskan peraturan pigmen dan mempamerkan aktiviti antipenuaan. Menurut laporan baru-baru ini, ginsenoside Rg1 meningkatkan aktiviti melanogenesis dan tyrosinase dalam melanosit manusia [1]. Sebaliknya, ginsenoside F1 (GF1) (sRajah 1), metabolit yang dihasilkan oleh hidrolisis Rg1, dilaporkan menghalang pigmentasi yang boleh dilihat. Kajian klinikal oleh Han et al menunjukkan kesan pemutihan kulit GF1 pada kulit manusia yang disamak buatan yang disebabkan oleh pengeluaran interleukin 13 daripada sel T gd epidermis manusia [2]. Kim et al menunjukkan bahawa GF1 mengurangkan rembesan melanin melalui penarikan balik dendrit tanpa kesan ke atas kandungan melanin intraselular dan ekspresi tyrosinase dalam sel melanoma murine B16F10 yang dirangsang melanocyte-stimulating hormone (MSH) [3]. Walau bagaimanapun, sehingga kini, tiada penemuan langsung telah diperolehi mengenai kesan pemutihan GF1 dalam persekitaran epidermis manusia yang terdiri daripada melanosit dan keratinosit dalam sistem eksperimen in vitro.

Interpolasi, pada masa yang sama kami mendapati bahawa terdapat juga tyrosinase dalam Cistanche deserticola, dan kaedah pengoksidaan kadar tyrosinase-dopa telah menjalankan penyelidikan peraturan aktiviti tyrosinase pada ekstrak glikosida phenylethanoid dalam Cistanche deserticola, keputusan menunjukkan bahawa: jumlah phenylethanoid glikosida Cistanche deserticola Ekstrak boleh menurunkan secara ketara aktiviti tyrosinase. Glikosida phenylethanoid dalam Cistanche deserticola juga boleh menyerap sinaran ultraviolet dalam cahaya matahari dengan berkesan. Struktur molekul glikosida phenylethanoid mempunyai pelbagai sistem konjugasi. Selepas imbasan ultraungu, didapati ia mempunyai penyerapan yang kuat antara 280nm dan 380nm, dan panjang gelombang penyerapan maksimum ialah 281nm dan 333nm. , menunjukkan bahawa glikosida phenylethanoid daripada Cistanche deserticola mempunyai kesan penyerapan yang baik pada sinaran ultraungu, dan boleh mencegah dan mengurangkan kerosakan sinaran ultraungu pada kulit dengan lebih baik.

Klik produk serbuk ekstrak cistanche herba jing

Rajah 1. Kesan GF1 pada kandungan melanin dan ekspresi tyrosinase dalam melanosit manusia. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) telah dirawat dengan sel MNT-1 selama 24 jam, 48 jam dan 72 jam. (A) Kandungan melanin kemudiannya dianalisis. (B) Tahap ekspresi tyrosinase telah dianalisis. Selain itu, GF1 (10, 50, 100 uM) dirawat dengan sel MNT{17}} yang dirangsang a-MSH (500 nM) selama 48 jam dan 72 jam. (C) Kandungan melanin kemudiannya dianalisis. (D) Tahap ekspresi tyrosinase telah dianalisis. Kami merawat melanosit epidermis manusia biasa primer (NHEM) dengan GF1 (50 mM dan 100 mM) dengan kehadiran atau ketiadaan rangsangan a-MSH selama 48 jam. (E) Kandungan melanin kemudiannya dianalisis. (F) Tahap ekspresi tyrosinase telah dianalisis. Sel MNT-1 dirawat dengan GF1 (50 mM dan 100 mM) selama 48 jam dalam medium kultur yang mengandungi 100 mM atau 500 mM L-tirosin. (G) Kemudian, kandungan melanin dianalisis. GADPH, gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenase; GF1, ginsenoside F1.

Di sini, kami menyiasat kesan anti-melanogenik GF1 pada sel kultur MNT-1/HaCaT dan setara kulit manusia tiga dimensi (3-}D). Di samping itu, kami memberi tumpuan kepada pembentukan dendrit dalam melanosit dan pemindahan melanosom ke dalam keratinosit selepas rawatan GF1. Secara kolektif, penemuan kami menunjukkan buat kali pertama bahawa GF1 menunjukkan kesan pemutihan dalam epidermis manusia yang wujud bersama dengan melanosit dan keratinosit.

Untuk kajian ini, sel MNT-1 telah dikultur dalam media penting minimum (MEM) yang mengandungi 20 peratus Fetal Bovine Serum (FBS), 1 peratus gentamicin dan 20 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES). Sel HaCaT telah dibiakkan dalam medium helang diubah suai (DMEM) dulbecco yang mengandungi 10 peratus FBS, 1 peratus gentamicin, dan 20 mM HEPES. Melanosit epidermis manusia biasa (NHEM) dibeli daripada (Lonza, Basel, Switzerland) dan dibiakkan dalam media pertumbuhan melanosit-4 (MGM-4). Sel telah diinkubasi pada 37 C di bawah atmosfera CO2 5 peratus.

Untuk mengukur kandungan melanin, sel (2 105 ) telah dikultur dalam 6-plat perigi selama 24 jam. Sel telah dirawat dengan kepekatan GF1 yang ditunjukkan. Selepas itu, sel dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS) dan kemudian dipisahkan dengan trypsin/EDTA. Sel-sel telah dilisiskan dengan mengeram dalam 200 mL 1 N NaOH pada 80 C selama 2 jam. Lisat sel telah dipindahkan ke plat telaga 96-, dan penyerapan diukur pada 405 nm.

Untuk melakukan Western blotting, sel telah dibasuh dua kali dengan PBS sejuk dan kemudian dilisiskan dalam penimbal radioimmunoprecipitation assay (RIPA) diubah suai ais (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 peratus Nonidet P-40 , 0.5 peratus natrium deoksikolat, 150 mM NaCl) mengandungi perencat protease dan set koktel perencat fosfatase (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Protein dipisahkan oleh elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan dipindahkan ke membran nitrocellulose. Membran diinkubasi dengan antibodi primer pada suhu 4 C selama 24 jam, kemudian dibasuh dengan garam penampan tris termasuk 0.1 peratus Tween-20, terdedah kepada antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase selama 1 jam pada suhu bilik, dibasuh dan kemudian divisualisasikan menggunakan sistem pengimejan Odyssey.

Untuk menganalisis pemindahan melanosom, sel MNT{{0}}/HaCaT dibiakkan dalam 12-plat perigi pada nisbah 1 hingga 10 selama 24 jam, dan kemudian, GF1 telah dirawat dengan kepekatan yang ditunjukkan. Sel telah dibasuh dua kali dengan PBS sejuk dan diperbaiki dengan 3.5 peratus paraformaldehid selama 10 minit. Sel telah dibasuh dan dirawat dengan 0.1 peratus Triton X-100 selama 10 minit dan kemudian 0.5 peratus albumin serum lembu (BSA) selama 1 jam. Antibodi terhadap protein berkaitan tyrosinase 1 (1:200, Merah) dan sitokeratin-18 (1:200, Hijau) telah digunakan untuk pengesanan melanosit dan keratinosit.

Model Tisu Kulit MelanoDerm (TM) ialah {{{0}}D yang setara kulit manusia yang mengandungi melanosit dan keratinosit normal (MatTek Corp., Ashland, MA). Kami menggunakan MelanoDerm TM (MEL-300-A) yang diperoleh daripada penderma Asia. Ia dikekalkan dalam medium penyelenggaraan baharu-113 seperti yang disyorkan oleh pengilang. GF1 telah digunakan pada MelanoDerm TM pada hari 0, 4, 6, 8, 11, 13, dan 15. Sebelum rawatan GF1, tisu telah dibasuh dengan 1 mL PBS untuk mengeluarkan sebarang sebatian sisa. Tisu telah ditetapkan pada hari ke-18 untuk analisis histologi. Penilaian histologi dilakukan di bawah mikroskop cahaya (Bx-41; Olympus, Tokyo, Jepun) dan fotomikrograf diambil menggunakan kamera digital (DP72; Olympus). Melanoderm telah ditetapkan dalam larutan formaldehid terbuffer 4 peratus untuk pewarnaan. Sampel telah dibenamkan dalam lilin parafin, dipotong kepada ketebalan 3 mm, dan diwarnakan menggunakan larutan pewarnaan Hematoxylin dan Eosin dan Fontana dan Mason. Semua data dinyatakan sebagai nilai min SD (sisihan piawai), dan ujian-t Pelajar digunakan untuk perbandingan statistik. Nilai-p <0.05 dianggap signifikan secara statistik (nilai-p individu diberikan dalam legenda angka).

Untuk mewujudkan kesan GF1 pada melanosit manusia, kami merawat sel melanoma manusia berpigmen tinggi (MNT-1) dengan GF1 selama 24, 48 dan 72 jam, diikuti dengan analisis kandungan melanin intraselular dan ekspresi protein tyrosinase . Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A, GF1 tidak mempunyai kesan perencatan ke atas kandungan melanin dalam julat kepekatan 10e100 mM. Selain itu, ungkapan tyrosinase tidak dikurangkan sebanyak GF1 dalam sel MNT-1 (Rajah 1B, sRajah 2A). Rawatan sel MNT{16}} yang dirangsang a-MSH dengan GF1 selama 48 jam dan 72 jam tidak menyebabkan penindasan kandungan melanin (Rajah 1C) atau ekspresi tyrosinase (Rajah 1D, sFig. 2B). Untuk mengesahkan lagi kesan GF1 pada melanosit manusia, kami merawat NHEM primer dengan GF1 dengan kehadiran atau ketiadaan rangsangan a-MSH selama 48 jam. Sama seperti data yang diperoleh dengan sel MNT-1, GF1 tidak menjejaskan kandungan melanin (Rajah 1E) atau ekspresi tyrosinase (Rajah 1F, sFig. 2C) dalam NHEM. Akhirnya, kami menilai sama ada tahap L-tirosin dalam medium kultur mempengaruhi aktiviti GF1 kerana L-tirosin adalah substrat tyrosinase untuk sintesis melanin. Sehubungan itu, sel MNT{35}} dirawat dengan GF1 selama 48 jam dalam medium kultur yang mengandungi 100 mM atau 500 mM L-tirosin. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1G, GF1 tidak menghalang kandungan melanin dalam sel MNT{43}}, tanpa mengira kepekatan L-tirosin.

Rajah 2. Kesan GF1 pada pembentukan dendrit dan pemindahan melanosom dalam sel MNT-1/HaCaTcocultured dan 3-D bersamaan dengan kulit manusia. MNT-1/HaCaTcells yang dikultur telah dirawat dengan 100 mM GF1 dengan kehadiran atau ketiadaan rangsangan a-MSH (50}0 nM) selama 48 jam. (A) Selepas penetapan, kami melihat pembentukan dendrit dalam melanosit menggunakan mikroskop optik (Bar skala; 50 mm). (B) Untuk pewarnaan imun, kami mengotorkan melanosom dengan antibodi TRP{11}} (warna merah) dan keratinosit dengan sitokeratin{12}} (warna hijau). Anak panah putih menunjukkan pemindahan melanosom ke HaCaT daripada sel MNT{13}} (Bar skala; 20 mm). Setara kulit manusia (MelanoDerm; n ¼ 3) telah dirawat dengan 1 peratus asid Kojic sebagai sebatian pemutihan rujukan dan GF1 (10 dan 50 ug/ml) selama 18 hari. (C) Selepas rawatan, setara kulit telah difoto. (D) Nilai 6 L (darjah ringan berbanding kawalan yang dirawat kenderaan) untuk setiap sampel ujian telah dikira. (E) Pewarnaan Hematoxylin dan Eosin (H&E) pada bahagian tisu. (F) Pewarnaan Fontana-Mason (F&M) pada bahagian tisu. Slaid telah ditetapkan dalam larutan formaldehid dan tertanam dalam lilin parafin untuk pewarnaan (Bar skala; 50 mm). Anak panah hitam menunjukkan melanosom yang dipindahkan dari melanosit di lapisan basal ke keratinosit di lapisan atas. Anak panah biru menunjukkan melanosit membentuk dendrit lanjutan. (*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001). CON, kawalan; GF1, ginsenoside F1; KA, asid Kojic.

Berikutan penemuan bahawa GF1 tidak memberikan kesan anti-melanogenik dalam melanosit manusia mono-kultur, kami selanjutnya menganalisis sama ada GF1 mempengaruhi sintesis melanin dalam melanosit dalam sistem eksperimen yang mengandungi kedua-dua keratinosit dan melanosit dengan kemungkinan komunikasi sel-sel. Sel MNT-1 dan HaCaT (garisan sel keratinosit normal manusia yang diabadikan) telah dikultur bersama dengan 100 mM GF1 dalam keadaan ada atau tiada penyinaran UV-B. Selepas 48 jam (sRajah 3A) atau 72 jam (sRajah 3B), kami menilai kandungan melanin daripada MNT-1 terpencil dan sel kultur. Data kami menunjukkan bahawa GF1 tidak menghalang sintesis melanin dalam kedua-dua MNT{15}} terpencil dan kumpulan sel yang dikultur.

Sebagai tambahan kepada sintesis melanin, kami memberi tumpuan kepada keberkesanan perencatan GF1 pada pemindahan melanosom daripada melanosit kepada keratinosit. Khususnya, sel MNT-1/HaCaT yang dikultur telah dirawat dengan 100 mM GF1 dengan kehadiran atau ketiadaan rangsangan a-MSH (Rajah 2A), diikuti dengan pemeriksaan pembentukan dendrit dalam melanosit, yang diperlukan untuk pemindahan melanosom . Menariknya, dendrit regangan yang disebabkan oleh aMSH telah ditarik balik selepas rawatan GF1. Kemudian, kami mengotorkan TRP-1-melanosom positif (Merah) untuk sel MNT1 dan sitokeratin-18 (Hijau) untuk sel HaCaT dalam kokultur. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2B, TRP-1-melanosom positif dalam sel MNT-1 telah dipindahkan ke dalam sel HaCaT selepas rangsangan a-MSH, yang telah dihalang dengan ketara oleh GF1. Keputusan ini menunjukkan bahawa GF1 menyekat pemindahan melanosom, menyebabkan penarikan balik dendrit melanosit.

Untuk melanjutkan penyiasatan ini kepada sistem yang lebih fisiologi, kami mengkaji keupayaan pemutihan GF1 dalam 3-D bersamaan kulit manusia, iaitu lapisan epidermis yang terdiri daripada melanosit dan keratinosit. Dalam Rajah 2C, tisu yang dirawat GF1-kelihatan lebih ringan daripada tisu kawalan dan nilai L (indeks kecerahan/kegelapan) telah diubah semasa rawatan GF1 (Rajah 2D). Di samping itu, pewarnaan hematoxylin dan eosin pada bahagian tisu menunjukkan tiada tisu runtuh atau ketoksikan (Rajah 2E). Eksperimen pewarnaan Fontana dan Mason menunjukkan bahawa GF1 menghalang pembentukan dendrit melanosit dalam lapisan basal dan pada masa yang sama menekan pemindahan melanosom daripada melanosit lapisan basal kepada keratinosit lapisan atas yang dibezakan (Rajah 2F). Penemuan ini secara kolektif menyokong keberkesanan perencatan GF1 dalam pemindahan melanosom, yang membawa kepada promosi pemutihan dalam model tisu kulit manusia.

Dalam kajian ini, GF1 tidak menghalang sintesis melanin dan ekspresi tyrosinase; sebaliknya, GF1 sedikit meningkatkan kandungan melanin intraselular dan ekspresi tyrosinase dalam sel MNT-1 dan sel kultur (Rajah 1A dan 1B dan sFig. 3A). Walau bagaimanapun, pada masa yang sama, kami mendapati bahawa GF1 menghalang pemindahan melanosom melalui penurunan pembentukan dendrit melanosit. Kami mengesyaki bahawa peningkatan kandungan melanin intraselular oleh GF1 boleh disebabkan oleh pengumpulan melanosom kerana sekatan pemindahan melanosom dan induksi ekspresi tyrosinase. Pigmentasi kulit yang boleh dilihat ditentukan oleh jumlah penyebaran melanosom dari pelbagai kawasan dendrit lanjutan melanosit ke keratinosit di sekelilingnya [4]. Beberapa sebatian, seperti centaureidin dan methylophiopogonanone B, menunjukkan keberkesanan pemutihan, membawa kepada penarikan balik dendrit melanosit tanpa mempengaruhi ekspresi enzim melanogenik atau sintesis melanin [5]. Oleh itu, sekatan pemindahan melanosom ke dalam keratinosit daripada melanosit dianggap sebagai pendekatan yang berkesan untuk mendorong kesan pemutihan, walaupun biosintesis melanin tidak dihalang. Oleh itu, kami menganggap bahawa peningkatan kandungan melanin oleh GF1 mempunyai sedikit kesan ke atas keberkesanan pemutihan GF1. Di samping itu, melanosom terkumpul akan direndahkan oleh autophagy untuk homeostasis kulit, walaupun nasib melanosom tidak jelas [6].

Kami menunjukkan buat kali pertama bahawa GF1 menindas pembentukan dendrit a-MSHinduced, mengakibatkan perencatan pemindahan melanosom ke dalam keratinosit dalam kultur sel manusia. Di samping itu, GF1 mengganggu pemindahan melanin daripada melanosit dalam lapisan basal kepada keratinosit di lapisan atas, memberikan kesan pemutihan pada kulit manusia yang setara. Eksperimen coculture baru-baru ini menunjukkan bahawa melanosit menghantar pigmen kepada keratinosit melalui perubahan morfologi dendritik, seperti tidak teratur mikrofilamen b-tubulin dalam sitoskeleton intraselular [7,8]. Adenosin monofosfat kitaran, inducer melanogenesis, mengantara pembentukan dendrit melalui upregulation Rac dan downregulation aktiviti Rho [9,10]. Oleh itu, kajian masa depan oleh kumpulan kami akan memberi tumpuan kepada penilaian komprehensif terhadap protein sasaran GF1, seperti molekul yang terlibat dalam laluan isyarat adenosin monofosfat kitaran.

Secara kolektif, keputusan kami memberikan bukti awal bahawa GF1 mempunyai potensi untuk dibangunkan sebagai reagen pemutih yang berkesan untuk rawatan gangguan pigmentari dan pencerahan warna kulit yang gelap sebagai bahan kosmetik.

Konflik kepentingan

Semua pengarang yang menyumbang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Ucapan terima kasih

Penyelidikan ini disokong dan dibiayai oleh Pusat R&D Amorepacific.

Rujukan

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenosides Rb1 dan Rg1 merangsang melanogenesis dalam melanosit epidermis manusia melalui isyarat PKA/CREB/MITF. Evid. berdasarkan. Pelengkap. Alternat Med 2014;2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Peranan interleukin 13 terbitan sel T epidermis dalam kesan pemutihan kulit Ginsenoside F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenoside F1 melemahkan hiperpigmentasi dalam sel melanoma B16F10 dengan mendorong penarikan balik dendrit dan mengaktifkan isyarat Rho. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Melanosom dipindahkan daripada melanosit ke keratinosit melalui proses pembungkusan, pelepasan, pengambilan dan penyebaran. Melabur Dermatol 2012;132:1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Mekanisme mengawal pigmentasi kulit: peningkatan dan penurunan warna kulit. Int J Mol Sci 2009;10:4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Gangguan pengangkutan melanosom dalam melanosit yang dirawat dengan teofilin menyebabkan degradasinya oleh autophagy. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Kesan laluan isyarat yang bergantung kepada reseptor NMDA pada morfologi sel dan pemindahan melanosom dalam melanosit. J Dermatol Sci 2016;84:296e304.

[8] Scott G. Rac dan rho: kisah di sebalik pembentukan dendrit melanosit. Sel Pigmen Res 2002;15:322e30

[9] Scott G, Leopardi S. Laluan isyarat cAMP mempunyai kesan yang bertentangan pada Rac dan Rho dalam sel B16F10: implikasi untuk pembentukan dendrit dalam sel melanocytic. Sel Pigmen Res 2003;16:139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. a-Melanocyte stimulating hormone (MSH) dan prostaglandin E2 (PGE2) memacu pemindahan melanosom dengan menggalakkan penghantaran filopodia dan menumpahkan butiran spheroid: bukti daripada pemerhatian mikroskopi daya atom. J Dermatol Sci 2014;76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2,*

1 Pusat R&D CO Amorepacific, Yongin-si, Republik Korea

2Jabatan Kimia Kejuruteraan, Universiti Kebangsaan Chungbuk, Cheongju-si, Chungbuk, Republik Korea

3Jabatan Sains Kecantikan dan Kosmetik, Kolej Sains Kesihatan, Universiti Eulji, Seongnam-si, Republik Korea

For more information:1950477648nn@gmail.com