Abstrak:MenggunakanCistanche DesertacolaParasitizing dua tumbuhan tuan rumah (haloxylon ammodendron dan atriplex canescens) sebagai bahan ujian, kajian ini menentukan kandungan polysaccharide dalam C. desidenola dari tuan rumah yang berbeza menggunakan kaedah asid fenol-sulfurik. Penjujukan transkrip dan analisis haloxylon-cistanche danPersatuan Atriplex-Cistanchetelah dijalankan menggunakan platform penjujukan Illumina Novaseq 6000. Penyelidikan ini memberi tumpuan kepada penyiasatan perbezaan transkrip dalam C. desidenola dari tuan rumah yang berlainan, pemeriksaan gen enzimatik utama yang terlibat dalam metabolisme polysaccharide, dan mengesahkan gen terpilih melalui pengesahan QRT-PCR. Kajian ini bertujuan untuk menyediakan asas teoritis untuk meneroka tumbuhan tuan rumah baru dan peningkatan genetik C. deserticola. Hasilnya menunjukkan bahawa kandungan polysaccharide yang terdapat dalam atriplex quadriptera-c.deserticola lebih tinggi daripada yang ada dalam haloxylon ammodendron-c. Desertacola. Melalui analisis perbandingan transkrip, 14089 gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) telah ditayangkan dari batang berisi Atriplex Quadriptera-C. Desertacola dan Haloxylon Ammodendron-C. Desertacola. Hasil analisis pengayaan KEGG mendedahkan bahawa DEG ini paling diperkaya dalam laluan yang berkaitan dengan metabolisme karbohidrat, metabolisme galaktosa, metabolisme asid amino, dan metabolisme asid lemak. Tambahan pula, sejumlah 26 DEG diperolehi daripada empat laluan yang berkaitan dengan metabolisme polysaccharide, di antaranya tahap ekspresi gen fructosidase dan -galactosidase dalam haloxylon ammodendron -C. Desertacola jauh lebih tinggi daripada yang berada di Atriplex quadriptera-C. Desertacola. Tahap ekspresi gen dehidrogenase UDP-glukosa dan mannose -1- gen transferase guanylate fosfat dalam Atriplex quadriptera-C. Desertacola jauh lebih tinggi daripada yang di Haloxylon Ammodendron-C. Desertacola, yang mungkin merupakan gen enzim utama untuk mengawal selia perbezaan metabolisme polysaccharide di C. desidenola.

Kata kunci Cistanche Desertacola; penjujukan transkrip; tuan rumah; Perbezaan metabolisme polysaccharide

Cistanche Desertacola

 

Cistanche desertacola yc ma, terutamanya diedarkan diGansu, Xinjiang, Ningxia, dan Inner Mongolia, adalah herba ubat tradisional Cina baru -baru ini termasuk dalam"Homolog Perubatan dan Makanan"katalog. Ia mempunyai pelbagai manfaat kesihatan, sepertiMenonifikasi buah ginjal, intipati dan darah berkhasiat, dan mempromosikan pergerakan usus, menjadikannya digunakan secara meluasubat, penjagaan kesihatan, dan industri makanan[1]. Disebabkan olehnyasifat heterotropik, Cistanche Desertacolaparasitisasi tumbuhan tuan rumah yang berbeza, denganHaloxylon Ammodendrondan yang baru diperkenalkansemulajadi semulajadiAtriplex canescens(Pursh) Nutt.menjadi tuan rumah utamanya.

Polysaccharides adalah bahan aktif utama dalam menilaiCistanche Desertacolakualiti. Di bawah keadaan tuan rumah yang berbeza,pengumpulan dan komposisi metabolikdariCistanchePolysaccharides berbeza dengan ketara [2]. Penyelidikan perubatan telah menunjukkan bahawaCistanchePolysaccharides mempunyaiantioksidan, neuroprotektif, mengawal imun, dan peningkatan ingatankesan farmakologi, berkesan mengurangkanPenyakit Alzheimer, Penyakit Parkinson, dan kekurangan limpa yang disebabkan oleh kemurungan hati[3]. Dengan kemajuan dalam modenTeknik Pengekstrakan dan Teknologi Analisis Multi-Spektrum, Thekandungan, komposisi, dan ciri -ciri strukturdariCistanchePolysaccharides secara beransur -ansur dijelaskan, memperluaskan aplikasi mereka.

Dari segiPenyelidikan Biologi MolekulpadaCistancheSpesies, kajian penjujukan transkrip telah memberi tumpuan terutamanyaCistanche TubulosadanHaloxylon-Cistanchesistem kompleks.Contohnya,Hou et al.[4] dilakukanpenjujukan transkrip panjang dan ekspresi gen yang panjangdariCistanche TubulosamenggunakanPacbio dan Bgiseq -500 teknologi RNA-seq, mengenal pasti237,772 transkrip unikdan menyaring gen enzim utama yang terlibat dalamBiosintesis glikosida phenylethanoid. Begitu juga,Feng et al.[5] dijalankananalisis transkrip dan metabolomikdari haustoria dan tisu bersebelahanAkar haloxylon danCistanchebatang daging, mendedahkan peranan tuan rumah dalam pengumpulanCistanchemetabolit. Kajian mereka menekankan bahawaLoji tuan rumah bukan sahaja mempengaruhi hasilCistanchetetapi juga kualitinya. Walau bagaimanapun, penyelidikan mengenaiCistancheParasitisasi tumbuhan tuan rumah yang berbeza masih terhad.

Atriplex canescens, a tumbuhan yang berakar umbi dan sangat tahan, berbeza dari tradisionalHost Haloxylondan berasal dariDataran Tinggi Semi-Arid Amerika Syarikat. Dalam tahun -tahun kebelakangan ini, ia telah diperkenalkan dan dipromosikan sebagaiTuan rumah baru untukCistanche DesertacolapenanamandalamNorthwest China. Qing et al.[6] dianalisis dan membandingkanPengumpulan polysaccharideCistancheParasitizing Haloxylon dan Atriplex CanescensDi kawasan pengeluaran yang sama, mencariPerbezaan ketara dalam kandungan polysaccharideantara kedua -dua keadaan tuan rumah.

Oleh itu, kajian ini bertujuan untukurutan batang berisiCistanche DesertacolaParasitizing Haloxylon dan Atriplex Canescens, menganalisisEkspresi pembezaan gen enzim utama yang terlibat dalam biosintesis polysaccharide. Penemuan akan memberikan aasas teoritis untuk penyelidikan lanjut mengenaiCistanchemekanisme biosintesis polysaccharide, memperkayakan kajian transkripik pada atriplex-Cistanchesistem, dan mempromosikan inovasi dalam berkualiti tinggiCistanchesumber germplasm.

 

Bahan dan kaedah

1.1 Bahan eksperimen

Cistanche Desertacolasampel parasitHaloxylon AmmodendrondanAtriplex canescensdikumpulkan dariCistanchePangkalan penanaman dalamXiquan Town, Jingtai County, Wilayah Gansu(Lintang36 darjah 5 'n, bujur103 darjah 42 'e). Kedua -duanyaHaloxylondanAtriplex canescenstelah ditanam dalam persekitaran yang sama. Sampel dikategorikan sebagaiHaloxylon-Cistanche(Contoh a)danAtriplex-Cistanche(Contoh h),dengan tiga replika untuk setiap kategori (lima tumbuhan setiap replika). Pensampelan dijalankan diApril 2024, dan sampel dikenal pasti sebagaiCistanche Desertacolamentol berisi olehProfesor Guo YehongdariKolej Pertanian, Universiti Pertanian Gansu.

MengikutiGaris Panduan Sampling Shanghai OE Biotech Co., Ltd., TheCistancheBatang berisi dibilas dengan air ultrapure, dan kelembapan berlebihan telah dikeluarkan menggunakan kertas penapis. Irisan nipis diambil dariAtas, Tengah, dan Bawahdari setiap batang, bercampur dengan teliti, dan dimasukkan ke dalam botol kriogenik. Sampel itucepat beku dalam nitrogen cairuntuk2 jamsebelum dipindahkan ke a-80 Freezer darjahuntuk penyimpanan [7].

1.2 Kaedah Eksperimen

1.2.1 Penubuhan lengkung standard dan penentuan kandungan polysaccharide

A 10 mgsampelStandard D-glukosaditimbang dengan tepat dan dibubarkan dalam a100 ml kelalang volumetrikdengan air suling untuk menyediakan a100 ug · ml⁻¹ penyelesaian stok. Penyelesaian penentukuran{{0}}. 2, {4}}. 4, 0. 6, 0. 7, 0.penyelesaian stok dipindahkan ke10 ml tiub ujian stoppered, dicairkan dengan air ke1. 0 ml, dan kemudian bercampur dengan1. 0 ml daripada penyelesaian fenol 6%dan5 ml asid sulfurik pekat. Selepas vorteks, penyelesaiannya dipanaskan dalam mandi air mendidih untuk20 minit, kemudian disejukkan dalam mandi air ais untuk10 minit. A kawalan kosongtelah disediakan menggunakan1. 0 ml air sulingbukannya penyelesaian glukosa. Penyerapan diukur pada482 nmmenggunakan aSpektrofotometer UV-vis, dan alengkung standarddihasilkan dengankepekatan (x) sebagai paksi mendatardanpenyerapan (y) sebagai paksi menegak.

Berikutan pendekatan yang diubah suai dariLi Jie et al. [8], 0. 2 g keringCistancheserbukditimbang dengan tepat dan dimasukkan ke dalam20 ml tiub ujian stoppered. 10 ml etanol 80%telah ditambah, dan campuran itu tertaklukPengekstrakan ultrasonik pada 80 darjah (100 W, 40 kHz) selama 30 minit. Ekstrak itu ditapis semasa panas dan prosedur diulang sekali. Setelah mengeringkan sisa,10 ml air sulingtelah ditambah, dan pengekstrakan ultrasonik diulang dua kali. Filtrat digabungkan dan dicairkan20 mldengan air suling.1. 0 ml penyelesaian inilebih banyak dicairkan10 mldengan air suling.

A 1. 0 ml aliquotyang disediakanCistanchePenyelesaian sampel dianalisis menggunakan prosedur yang sama seperti standard glukosa. Penyerapan di482 nmdiukur, dan kandungan polysaccharideCistanchedari tumbuhan tuan rumah yang berbeza telah dikira.

1.2.2 Pengekstrakan RNA, pembinaan perpustakaan cDNA, dan penjujukan

Jumlah RNA diekstrak dariCistanche Desertacolasampel parasitHaloxylon AmmodendrondanAtriplex canescensmenggunakanTiangen DP441 RNA Kit (China), mengikutiProtokol Reagen TRIZOL. Kesucian RNA dinilai dengan aSpektrofotometer Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA), sementara kepekatan dan integriti RNA dinilai menggunakanAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Amerika Syarikat).

Perpustakaan transkrip telah dibina menggunakanVahts Universal V6 RNA-Seq Prep Kit. Selepas kawalan kualiti denganAgilent 2100 Bioanalyzer, perpustakaan telah disusun diPlatform Illumina Novaseq 6000, menjana150 bp berbunyi berpasangan.

1.3 Analisis Data

1.3.1 Perhimpunan Transkrip dan Anotasi Fungsi

RAW membaca dalamFormat FastQtelah diproses menggunakanTrimmomaticuntuk mengeluarkanPloy-n membaca dan bacaan berkualiti rendah, mengakibatkanBacaan bersih. Urutan penyesuai dan kawasan berkualiti rendah telah dikeluarkan, dan bacaan bersih dipasangcontigs(menyatakan tag urutan) menggunakanPerisian Trinity. Transkrip terpanjang dari setiap kluster dipilih sebagaiunigeneuntuk analisis lanjut.

Anotasi fungsional unigenes dilakukan dengan membandingkannyaPangkalan data protein NCBI Non-Redundant (NR), Swiss-Prot, dan Genealogi Evolusi Gen: Pangkalan Data Kumpulan Orthologous Non-Supervised (EGGNOG)menggunakanPerisian Diamond (E-Nilai <1E -5). Anotasi Kumpulan Orthologous Eukariotik (KOG)telah dilakukan untuk mengenal pasti gen homolog. Di samping itu, unigenes dipetakan keKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) jalurUntuk anotasi laluan metabolik.Klasifikasi ontologi (GO) dan anotasi fungsionaltelah dijalankan menggunakan pemetaan dari pangkalan data Swiss-Prot.

1.3.2 Analisis Ekspresi Gen dan Pengenalpastian Unigenes Berbeza (DEG)

Tahap ekspresi gen dikira menggunakanBowtie2Untuk menyelaraskan bersih bacaan kepada unigenes. Nilai ungkapan dikira sebagaiFragment per kilobase transkrip per juta bacaan dipetakan (fpkm)menggunakanPerisian Ekspres. Analisis ekspresi perbezaan dilakukan dengan menggunakanPerisian DESEQ2, denganUjian pengedaran binomial negatif (NB)digunakan untuk ujian penting. Gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) ditakrifkan sebagai merekaQ-nilai <0. 05danPerubahan lipat (fc)> 2.

1.3.3 Pengesahan QRT-PCR gen yang berbeza dinyatakan

Gen enzim utama yang terlibat dalamBiosintesis polysaccharidedenganungkapan pembezaan yang ketaratelah dipilih untukPengesahan PCR masa nyata kuantitatif (qRT-PCR). Sampel RNA adalah kualiti yang diperiksa, dan nilai OD diukur sebelum transkripsi terbalik. sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakanTransScript All-in-One First-Strand CDNA Sintesis SuperMix untuk Kit qPCR. CDNA yang disintesis dicairkan10- lipatan, dan qRT-PCR dijalankan menggunakan aSistem qPCR pendarfluordi bawah keadaan berbasikal yang berbeza.ACTB (beta-actin) digunakan sebagai gen rujukan dalaman, dan tahap ekspresi gen relatif dikira menggunakanKaedah 2⁻ΔΔCT.

 

Jadual 1 Urutan Primer

ID Gen	Nama gen	Forward Primer (5 '-3')	Primer Reverse (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	Gatagtggctacaacatccactt	Cctcctttcgtcgtaggattc
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	UGDH	AAAGATCTTCCAGTTCGTAAGC	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	SACA	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatgaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	CACTGGCATCGACGAGGAAG
-	ACTB	Caatggatgatatatcgccgcgt	CACTGGCATCGACGAGGAAG

 

 

1.4 Analisis Data

Analisis kluster hierarkigen yang dinyatakan secara berbeza (DEG)telah dilakukan menggunakanR (v3.2.0)Untuk memvisualisasikan corak ekspresi gen di seluruh kumpulan dan sampel. Pergi (Gene Ontology) Analisis Pengayaan danKEGG (Kyoto Ensiklopedia Gen dan Genom) Analisis Pengayaan Laluantelah dijalankan menggunakanR, berdasarkanPengagihan Hypergeometric. Istilah fungsi yang diperkaya dengan ketara dipaparkan menggunakancarta bar, plot gelembung, dan plot bulatan pengayaan.

2 Hasil dan Analisis

2.1 Hasil Penentuan Kandungan Polysaccharide

Persamaan regresi linear yang diperoleh dari pengukuran penyerapan adalah:

y {{0}}. 0 154x -0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. (R^2=0. 9963) y =0. 0154x -0.1636 (r 2=0. 9963)

dengan julat linear20-90 ug · ml⁻¹. Ketepatan, kebolehulangan, kestabilan, dan kadar pemulihan sampel adalah{{0}}. 38%, 0. 86%, 0.53%, dan 99.67%, masing -masing.

Yang diukurKandungan polysaccharidedalamCistanche DesertacolaSampel dari tumbuhan tuan rumah yang berbeza adalah:

Haloxylon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Penjejakan Transkrip dan Perhimpunan Data

Penjujukan transkripenam sampelmenjana jumlah keseluruhan41.77 g data bersih. Data yang sah bagi setiap sampel adalah dari6.89 g hingga 7.04 g, denganPeratusan asas Q30 antara 95.38% dan 95.91%, dan AnKandungan GC purata sebanyak 45.13%.

Sejumlah61,423 unigenesdipasang, dengan jumlah panjang65,962,858 bpdan seorangPanjang purata 1,073.91 bp.

2.3 Anotasi fungsi gen

Sejumlah61,423 unigenesdiperoleh dari penjujukanCistanche DesertacolaSampel parasit dua loji tuan rumah yang berbeza. Hasil anotasi adalah seperti berikut:

30,689 Unigenes (49.96%)telah dijelaskan diPangkalan Data Protein NR (Bukan Redundant).

18,698 Unigenes (30.44%)telah dijelaskan diPangkalan data Swiss-Prot.

3,998 Unigenes (6.51%)telah dijelaskan diPangkalan data KEGG.

17,188 Unigenes (27.98%)telah dijelaskan diPangkalan data KOG (kumpulan orthologous eukaryotic).

25,280 Unigenes (41.16%)telah dijelaskan diEggnog (Genealogi Evolusi Gen: Kumpulan Orthologous Non-Supervised).

16,210 Unigenes (26.39%)telah dijelaskan diPangkalan Data Pergi (Gene Ontologi).

16,153 Unigenes (26.30%)telah dijelaskan diPangkalan data PFAM (keluarga protein).

Antara ini,21,650 Unigeneslebih panjang daripada1 kb.

Analisis homologi berdasarkanPangkalan data NRmendedahkan bahawa tiga spesies yang paling berkait rapat adalah:

Paulownia Fortunei (30.23%)

Phtheirospermum japonicum (14.15%)

Chenopodium quinoa (7.1%)

 

 

Jadual 2 maklumat penjelasan dariCistanche DesertacolaFungsi gen

Pangkalan data	Nombor gen anotasi	Perkadaran (%)
Nr	30,689	49.96
Swiss-Prot	18,698	30.44
Kegg	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
eggnog	25,280	41.16
Pergi	16,210	26.39

 

 

2.4 GO dan KEGG Anotasi Fungsional dan Klasifikasi

ThePangkalan Data Pergi (Gene Ontologi)digunakan untuk terus mencatatkan unigenes yang dikenal pasti diPangkalan data NR, mengakibatkan jumlah16,210 Unigenes. Unigenes ini dikategorikanTiga kumpulan fungsi utama:

Proses Biologi (BP)

Fungsi molekul (mf)

Komponen Selular (CC)

DalamKategori Proses Biologi (BP), Kelompok Unigene yang paling banyak adalah:

"Proses Selular" (11,023 unigenes)

"Proses Metabolik" (9,117 Unigenes)

UntukKategori Komponen Selular (CC), 17 subkategoritelah dikenal pasti, dengan setiap subkategori yang mengandungi sekurang -kurangnya30 Unigenes. Kelompok terbesar adalah:

"Sel" (13,947 Unigenes)

"Bahagian Sel" (13,918 Unigenes)

DalamKategori Fungsi Molekul (MF), kumpulan fungsional yang paling diperkaya ialah:

"Mengikat" (10,039 unigenes)

"Aktiviti pemangkin" (8,490 Unigenes)

Rajah.2 GO Anotasi Fungsi dan Klasifikasi Unigenes

 

Anotasi dan klasifikasi fungsional KEGG

Semasapenjujukan transkrip, jumlah3,998 Unigenestelah dijelaskan diKEGG (Kyoto Ensiklopedia Gen dan Genomes) Pangkalan Data. Unigenes ini diklasifikasikan ke dalamEnam kategori utama, dengan jumlah dan perkadaran Unigene masing -masing seperti berikut:

Proses selular: 326 Unigenes (8.15%)

Pemprosesan Maklumat Alam Sekitar: 299 Unigenes (7.47%)

Pemprosesan maklumat genetik: 1,771 unigenes (44.30%)

Penyakit manusia: 14 Unigenes (0.35%)

Metabolisme: 1,465 unigenes (36.64%)

Sistem organisma: 123 unigenes (3.07%)

Enam kategori utama ini dibahagikan kepada20 tahap klasifikasi sekunder. Antara mereka,Pemprosesan maklumat genetikmempunyai bahagian tertinggi, diikuti olehMetabolisme. DalamMetabolismekategori, laluan yang paling banyak adalah:

Metabolisme karbohidrat

Metabolisme asid lemak

Metabolisme flavonoid

Rajah.3 Anotasi laluan metabolik KEGG Unigenes

 

2.5 Ekspresi Gen Berbeza dan Analisis PengayaanCistanche Desertacoladari tuan rumah yang berbeza

Data penjujukan transkrip ditapis menggunakanKriteria Pemilihan Ekspresi Pembezaan Lalai, mengakibatkan pengenalpastian14,089 gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG):

6,576 gen dikawal selia

7,513 gen dikurangkan

A Plot Volcanotelah dijana untuk memvisualisasikan pengagihan keseluruhan DEG.

Dalam30 teratas GO Pengayaan Klasifikasi Fungsiandaripada DEG, diperhatikan bahawa:

Berbanding denganProses Biologi (BP)danKomponen Selular (CC)kategori,Fungsi molekul (mf)mempamerkan pengayaan DEG yang lebih penting.

DEG yang paling terkenal dikaitkan denganmetabolisme asid nukleik, metabolisme protein, dan enzim utama dalam metabolisme galaktosa.

Di samping itu, DEGS diperkaya dengan ketaraPergi istilah yang berkaitan dengan metabolisme polysaccharide, termasuk:

Proses metabolik kanji

Proses biosintetik glikogen

Proses katabolik sukrosa

Aktiviti Glucosidase

Aktiviti synthase UDP-L-rhamnose

Aktiviti hidrolase polysaccharide

Rajah.4 Peta gunung berapi gen yang dinyatakan secara berbeza

 

Analisis pengayaan laluan kegg degs diCistanche Desertacoladari tuan rumah yang berbeza

Untuk menyiasat selanjutnyagen yang dinyatakan secara berbeza (DEG)dalamCistanche Desertacoladari tumbuhan tuan rumah yang berbeza,Analisis Pengayaan Laluan Keggtelah dilakukan. Analisis menunjukkan bahawa:

DEG dipetakan ke 117 laluan metabolik.

TheJalur 20 teratasmenunjukkanPengayaan Deg yang ketara, dengan laluan yang paling diperkaya termasuk:

Metabolisme asid lemak

-Peng metabolisme asid linolenik

Metabolisme galaktosa

Degradasi Lysine

Analisis pengayaan lebih lanjut mengenai20 kategori metabolik teratas dengan nilai Q terkecilmenunjukkan bahawa DEG telah diperkaya dengan ketara dalam:

Sistem organisma

Metabolisme

Pemprosesan maklumat genetik

Antara kategori ini,"Metabolisme"mempunyai bilangan tertinggi DEG diperkaya dan menunjukkan pengayaan yang paling penting. Di samping itu, dalam laluan metabolik yang diperkaya,perkadaran unigenes yang dikawal dan dikurangkan hampir sama.

Penemuan ini mencadangkan bahawaLaluan metabolik memainkan peranan pentingdalam ekspresi gen pembezaanCistanche Desertacoladari tumbuhan tuan rumah yang berbeza, terutamanya dalamlipid, karbohidrat, dan metabolisme asid amino.