Kesan Masa Dan Iskemia Pada Fibrosis Buah Pinggang Selepas Nefrektomi Kontralateral

pengenalan

Kejadiankecederaan buah pinggang akut(AKI) telah meningkat secara mendadak di seluruh dunia dalam beberapa tahun kebelakangan ini [1]. AKI boleh disebabkan oleh pemindahan organ, selepas operasi di bawah perfusi, pendarahan, dehidrasi, kejutan dan sepsis dalam amalan klinikal [2]. Kajian epidemiologi dan eksperimen baru-baru ini telah menunjukkan bahawa keterukan, kekerapan dan tempoh AKI berkait rapat dengan kejadian berikutnya.penyakit buah pinggang kronik(CKD). Fibrosis buah pinggang selepas AKI boleh menyebabkan CKD atau bahkanpenyakit buah pinggang peringkat akhir(ESKD) [3-5], membayangkan bahawa AKI dan CKD adalah sindrom yang dikaitkan [6]. Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari peralihan daripada AKI ke CKD masih tidak diketahui walaupun terdapat banyak kajian eksperimen dan klinikal. Model haiwan adalah alat penting untuk menyiasat mekanisme yang mana AKI membawa kepada CKD. Kecederaan reperfusi iskemia buah pinggang (IRI) adalah salah satu punca utama AKI, dan beberapa model haiwan AKI yang disebabkan oleh IRI telah dibangunkan [7], termasuk model IRI dua hala (bIRI), model IRI unilateral dengan buah pinggang kontralateral yang utuh. , model uIRI dengan nefrectomy kontralateral serentak, dan model uIRI dengan nefrectomy kontralateral tertunda.

Model bIRI kurang konsisten kerana apabila kecederaan iskemia kedua-dua buah pinggang terlalu ringan, tiada perubahan fibrotik yang ketara dalam jangka masa panjang. Apabila AKI terlalu teruk, tikus mungkin mati dalam fasa kecederaan akut. Tambahan pula, perbezaan kecil dalam kecederaan kedua-dua buah pinggang boleh membawa kepada perbezaan yang ketara dalam patologi buah pinggang kronik mereka selepas beberapa minggu [8,9]. Model uIRI dengan nefrotomi kontralateral serentak adalah serupa dengan model bIRI kerana hanya buah pinggang yang cedera yang kekal disebabkan oleh nefrektomi sisi yang lain [10]. Dalam model IRI dengan buah pinggang kontralateral yang utuh, fibrosis buah pinggang iskemia adalah teruk [11,12]. Model ini sangat konsisten dan boleh dipercayai untuk pemerhatian jangka panjang oleh penyelidik. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh kehadiran buah pinggang yang tidak rosak kontralateral, ia tidak boleh digunakan untuk penilaian anggaran kadar penapisan glomerular (eGFR), kreatinin serum (SCr), dan nitrogen urea darah (BUN) [11-14]. Berbanding dengan dua model uIRI yang dinyatakan di atas, model uIRI dengan nefrektomi kontralateral tertunda mengatasi masalah ini dan boleh digunakan untuk kedua-dua pemerhatian jangka panjang selepas AKI dan pemantauan fungsi buah pinggang. Oleh itu, model ini sesuai untuk mengkaji peralihan AKI-CKD [15].

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE UNTUKKECEDERAAN BUAH PINGGANG AKUT

Walau bagaimanapun, keadaan iskemia yang berbeza dan selang antara nefrektomi kontralateral dan uIRI mungkin mempunyai kesan yang ketara terhadap perkembangan dan keterukan CKD selepas AKI. Kajian terdahulu telah memberi tumpuan kepada kesan tempoh iskemia pada fibrosis buah pinggang selepas AKI dan tidak banyak memberi perhatian kepada suhu badan teras semasa iskemia. Sebagai contoh, Skrypnyk et al. [12] mengawal suhu iskemia pada 38 C dengan sistem mandi air, dengan tempoh iskemia selama 30 minit, dan buah pinggang utuh kontralateral dikeluarkan 8 hari selepas uIRI. Keputusan menunjukkan bahawa buah pinggang iskemia mempunyai perubahan fibrotik yang ketara 28 hari selepas uIRI. Dengan tempoh iskemia yang sama, Xiao et al. [8] menunjukkan bahawa perubahan fibrotik yang ketara berlaku 11 hari selepas uIRI apabila suhu iskemia dikawal pada 37 C 38 C dan selang masa antara uIRI dan nefrektomi kontralateral ialah 10 hari. Sesetengah penyelidik, seperti Colombaro et al. [14] dan Li et al. [16] tidak menyebut suhu iskemia dalam kajian mereka.

Sementara itu, beberapa orang menyelidik kesan selang masa antara nefrektomi kontralateral dan uIRI dalam model ini, menghasilkan keputusan yang berbeza-beza secara meluas di antara makmal yang berbeza, yang juga mempengaruhi eksperimen seterusnya secara dramatik. Dalam kajian ini, kami menyiasat kesan faktor utama yang mempengaruhi fibrosis buah pinggang selepas AKI, termasuk selang masa antara nefrektomi kontralateral dan uIRI, suhu badan teras semasa iskemia, dan tempoh iskemia. Kami berhasrat untuk memberikan rujukan untuk membuat model haiwan yang sesuai untuk mengkaji peralihan AKI CKD

Bahan dan kaedah Model haiwan

Tikus C57BL/6J jantan (berumur 8–10 minggu, berat kira-kira 22 g; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, China) diberikan akses percuma kepada makanan dan air di Pusat Eksperimen Haiwan Universiti Perubatan Shanxi. Keadaan pembiakan adalah seperti berikut: kelembapan 40–70%, suhu 23 C, kebersihan udara kelas 7, 12-h kitaran cahaya/gelap terkawal di bawah keadaan bebas patogen, penyinaran Co60 suapan dan air tulen. Semua prosedur untuk kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Hospital Kedua Universiti Perubatan Shanxi (nombor etika: DW2022028).

Protokol

Memandangkan tempoh iskemia, suhu badan teras semasa iskemia, dan masa reseksi bagi buah pinggang tidak cedera kontralateral semuanya mungkin mempunyai kesan ke atas keterukan AKI dan fibrosis buah pinggang yang berikutnya, kami menyiasat kesan tiga faktor di atas secara individu, dengan dua yang lain tetap. Tiga eksperimen telah dijalankan seperti berikut.

Protokol 1: Untuk melihat kesan selang antara nefrektomi kontralateral dan uIRI pada fungsi buah pinggang dan fibrosis pasca-AKI, masa iskemia buah pinggang kiri ditetapkan pada 24 minit dan suhu badan teras ditetapkan pada 37 C semasa buah pinggang iskemia pula. Reseksi buah pinggang kanan dijalankan pada hari ke-7, hari ke-10, dan hari ke-14, masing-masing (n ¼ 8 setiap kumpulan) selepas IRI buah pinggang kiri. Kami menentukan tempoh iskemia dan reseksi buah pinggang berdasarkan keputusan kajian terdahulu [8,10,12,15] dan keputusan pra-eksperimen kami. Lihat Rajah 1(A–C) untuk protokol kajian.

Protokol 2: Untuk melihat kesan suhu badan teras semasa iskemia pada peralihan AKI-CKD, masa iskemia buah pinggang kiri ditetapkan pada 24 minit, dan buah pinggang kanan dikeluarkan 14 hari selepas IRI buah pinggang kiri. Suhu badan teras dikawal pada 36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, dan 38 C, masing-masing (n ¼ 8 setiap kumpulan). Lihat Rajah 1(D) untuk protokol kajian.

Protokol 3: Untuk melihat kesan tempoh iskemia buah pinggang pada peralihan dari AKI ke CKD, suhu badan teras ditetapkan pada 37 C semasa iskemia, dan buah pinggang kanan dikeluarkan 14 hari selepas IRI buah pinggang kiri. Kami memilih titik masa ini adalah kerana fibrosis buah pinggang, yang merupakan perubahan biasa selepas AKI kepada CKD, sangat jelas menurut laporan [8,10,12,15] dan keputusan pra-eksperimen kami. Masa iskemia buah pinggang kiri dikawal pada 21 min, 24 min, 27 min dan 30 min, masing-masing (n ¼ 8 setiap kumpulan). Lihat Rajah 1(E) untuk protokol kajian.

Semua tikus telah dimatikan pada 8 minggu selepas IRI buah pinggang kiri. Sebahagian daripada tisu buah pinggang kiri disimpan pada suhu 70 C untuk analisis RT-PCR dan western blot seterusnya, dan sebahagian lagi telah ditetapkan dalam formalin neutral untuk analisis histopatologi. Sampel darah dikumpulkan melalui sinus retro-orbital untuk ujian biokimia.

Rajah 1. Protokol kecederaan iskemia-reperfusi unilateral (uIRI) dengan nefrektomi kontralateral tertunda. (A–C): Buah pinggang kiri tertakluk kepada IRI pada hari 0, dan reseksi buah pinggang kanan dijalankan pada titik masa yang berbeza (hari ke-7, hari 10 dan hari14) dengan tempoh iskemia ditetapkan pada 24 minit dengan suhu badan teras tetap pada 37 C semasa iskemia buah pinggang. (D): Buah pinggang kiri telah dikenakan IRI pada hari 0, dan reseksi buah pinggang kanan dijalankan di bawah suhu teras badan yang berbeza (36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C dan 38 C) dengan iskemia masa buah pinggang kiri ditetapkan pada 24 minit, dan buah pinggang kanan dikeluarkan 14 hari selepas IRI buah pinggang kiri. (E): Buah pinggang kiri tertakluk kepada IRI pada hari 0, dan reseksi buah pinggang kanan dijalankan pada tempoh iskemia yang berbeza (21 min, 24 min, 27 min, dan 30 min) dengan suhu badan teras tetap pada 37 C semasa buah pinggang iskemia, dan buah pinggang kanan dikeluarkan 14 hari selepas IRI buah pinggang kiri. Berat buah pinggang, fungsi buah pinggang, kecederaan histologi buah pinggang, dan fibrosis buah pinggang dinilai sehingga hari ke-56.

Prosedur pembedahan

Sebelum pembedahan, semua tikus berpuasa selama 12 jam dengan akses percuma kepada air dan disuntik dengan 3% natrium pentobarbital 50 mg/kg secara intraperitoneal. Semasa anestesia, suhu rektum dikekalkan pada 36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, atau 38 C, masing-masing, dalam kumpulan eksperimen yang berbeza. Untuk mencapai matlamat ini, tetikus diletakkan membelakanginya pada pad pemanas (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, China) dalam kedudukan dengan kepala dan lehernya dipanjangkan untuk memastikan saluran pernafasannya kekal. tidak terhalang, dan mata ditutup dengan kasa salin hangat untuk mengelakkan pengeringan semasa prosedur. Selepas bius, rambut di belakang kiri tetikus dicukur dengan gunting rambut. Kulit di kawasan pembedahan kemudiannya disapu bersih dengan swab alkohol 75%. Secara amnya, suhu badan tetikus turun selepas mencukur rambut. Prosedur pembedahan dijalankan apabila suhu badan teras menjadi malar, yang boleh mengambil masa kira-kira 15 minit. Buah pinggang kiri boleh dilihat dengan memotong kulit dorsal kiri 0.5 cm di sebelah garis tengah dan 0.5 cm di tepi bawah sangkar rusuk tikus. Kemudian kami memicit perut kiri dengan satu tangan untuk membuat buah pinggang kiri keluar dari rongga badan, mengangkat buah pinggang dengan forsep melengkung yang tumpul (berjaga-jaga untuk mengelakkan kerosakan buah pinggang), menanggalkan pedikel buah pinggang dan mengapitnya dengan cepat, dan meletakkan pengapit. buah pinggang di bawah kulit untuk memastikan ia hangat dan lembap. Iskemia yang berjaya dicirikan oleh perubahan warna secara beransur-ansur buah pinggang dari merah kepada ungu gelap, yang berlangsung masing-masing 21 min, 24 min, 27 min dan 30 min, dalam kumpulan eksperimen yang berbeza. Warna buah pinggang bertukar kembali kepada merah dalam masa 2-5 minit selepas melepaskan pengapit. Kemudian kami menutup rongga perut dengan jahitan berlapis. Kulit dan otot dorsal kanan dihiris pada hari ke-7, hari ke-10, dan hari ke-14 selepas uIRI, masing-masing, dalam kumpulan eksperimen yang berbeza, dan buah pinggang kanan telah direseksi. Kemudian tutup luka dengan jahitan standard. Selepas setiap pembedahan, 500 lL saline disuntik secara intraperitoneal untuk mengimbangi kehilangan cecair semasa pembedahan. Pada masa yang sama, tetikus disimpan di atas pad pemanas selama kira-kira 2-3 jam sehingga ia sedar sepenuhnya sebelum dipindahkan ke sangkar perumahan. Kumpulan palsu tidak mengapit pedikel buah pinggang, dan operasi pembedahan yang lain adalah sama seperti kumpulan uIRI. Semua operasi pembedahan dilakukan oleh orang yang sama dengan pengalaman lebih daripada 2 tahun dalam pengendalian model ini.

Ujian fungsi buah pinggang

Tahap SCr diukur oleh Kit Kreatinin (Kaedah Jaffe, 100020170, Bioteknologi dan Sains Biosino). Tahap BUN diukur dengan Kit Urea (Kaedah Urease-Glutamate Dehydrogenase, Bioteknologi dan Sains Biosino).

Ujian berat buah pinggang

Selepas membuang air kecil, berat badan tikus diukur dengan skala elektronik ketepatan. Buah pinggang segar dibilas tiga kali dalam salin yang telah disejukkan, kemudian air yang berlebihan pada buah pinggang disapu dengan kertas turas. Kapsul buah pinggang dikupas di atas ais dan buah pinggang segera ditimbang. Nisbah berat buah pinggang kepada berat badan dikira untuk menilai berat buah pinggang yang diperbetulkan dalam mg/g.

Pewarnaan Hematoxylin-eosin (HE) dan skor kecederaan buah pinggang

Tisu buah pinggang tetap formalin neutral secara rutin mengalami dehidrasi, tertanam dalam parafin, dipotong (3 lm), dan diwarnakan dengan HE untuk melihat kerosakan tisu buah pinggang. Sepuluh medan korteks buah pinggang yang dipilih secara rawak bagi setiap bahagian telah ditangkap dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 400. Dua ahli patologi menjaringkan kecederaan pada glomerulus dan tubul buah pinggang secara berasingan. Kecederaan tiub telah dijaringkan pada skala {{20}}-4 menggunakan kriteria berikut [17]: 0, tiada kecederaan; 1, menjejaskan 1-25% kawasan buah pinggang; 2, menjejaskan 26–50% kawasan buah pinggang; 3, menjejaskan 51-75% kawasan buah pinggang; dan 4, menjejaskan 75–100% kawasan buah pinggang. Tahap kecederaan tubular dinilai secara separuh kuantitatif dengan mengira kawasan kecederaan tubular buah pinggang. Kecederaan glomerular dinilai dan dijaringkan pada skala 0–4 mengikut peratusan kawasan pengembangan mesangial atau sklerosis menggunakan kriteria berikut [17]: 0, glomeruli normal; 1, 1–25% daripada kawasan yang cedera; 2, 26-50% kawasan cedera; 3, 51–75% kawasan cedera; dan 4, 76–100% kawasan cedera. Skor kerosakan glomerulus akhir ¼ 0 (% gred 0 glomeruli) þ 1 (% gred 1 glomeruli) þ 2 (% gred 2 glomeruli) þ 3 (% gred 3 glomeruli) þ 4 (% gred 4 glomeruli). Lebih daripada 50 glomeruli dijaringkan setiap tetikus.

Pewarnaan trichrome Masson

Tisu buah pinggang tetap formalin neutral secara rutin mengalami dehidrasi, tertanam dalam parafin, dipotong (3 lm), dan diwarnai dengan trichrome Masson untuk melihat fibrosis buah pinggang. Dalam kepingan Masson yang diwarnai trichrome, dua puluh medan korteks buah pinggang yang tidak bertindih telah ditangkap di bawah pembesaran 200. Perisian Analisis Imej Image-Pro Plus telah digunakan untuk pengukuran dan analisis automatik. Peratusan kawasan fibrotik digunakan untuk mengetahui tahap fibrosis interstisial buah pinggang [8].

RT-PCR

Jumlah mRNA telah diekstrak daripada tisu buah pinggang setiap kumpulan oleh Trizol dan kepekatannya diukur, kemudian ia ditukar kepada cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Kaedah pendarfluor Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) digunakan untuk mengukur ekspresi RNA fibronektin (FN) dan kolagen I (COL-I) dalam tisu buah pinggang. Primer khusus telah digunakan untuk FN (ke hadapan: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 dan sebaliknya: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ), dan COL-I (ke hadapan: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} dan terbalik: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (disediakan oleh Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Keadaan penguatan adalah seperti berikut: 95 C selama 30 saat, 95 C selama 5 saat, 60 C selama 30 saat, 40 kitaran; 95 C untuk 10 s, 65 C untuk 5 s dan 95 C/5 C. Selepas menganalisis lengkung amplifikasi dan lengkung keterlarutan produk, tahap mRNA relatif ditentukan oleh kaedah CT perbandingan (2-DDCt) dengan 18SrRNA (ke hadapan: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 dan terbalik: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) sebagai rujukan dalaman.

Western blot

Penampan lisis radio-immuno-precitation-assay (RIPA) digunakan untuk melisiskan tisu buah pinggang dan kepekatan protein ditentukan oleh kaedah BCA. Elektroforesis gel kecerunan telah digunakan untuk memisahkan protein daripada 50 lg sampel. Kemudian protein dipindahkan ke membran nitroselulosa. Selepas menyekat dengan susu tanpa lemak 5% selama 2 jam, membran telah dipadamkan semalaman pada suhu 4 C dengan antibodi monoklonal anti-tikus arnab terhadap aktin otot licin (a-SMA) (1:1000, No.19245, Teknologi Isyarat Sel ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam), atau COL-I (1:1000, No.72026, Teknologi Isyarat Sel). Pada keesokan harinya, membran dipanaskan semula pada suhu bilik selama 0.5 jam. Selepas dibasuh dengan TBST, membran diinkubasi dengan HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-arnab IgG(H þ L)(1:1000, No.BA1054, BOSTER Biological Technology) selama 2 jam. Selepas dibasuh dengan TBST sekali lagi, mereka diwarnai dengan reagen chemiluminescence ECL sensitiviti ultra-tinggi untuk menggambarkan imunoblot. b-aktin diukur pada membran yang sama dengan rujukan dalaman. Ekspresi protein ditentukan dengan mengukur ekspresi relatif protein sasaran berbanding b-aktin.

Analisis data dan statistik

Semua data yang diperiksa dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Perbandingan antara kedua-dua kumpulan telah diakses oleh ujian-t bebas. Perbandingan antara berbilang kumpulan telah diakses oleh ANOVA sehala apabila taburan data adalah normal, dan varians adalah homogen, Welch ANOVA digunakan untuk menilai kepentingan statistik apabila varians adalah heterogen, diikuti oleh ujian post hoc Tukey untuk pelbagai perbandingan. Semua analisis statistik telah dijalankan oleh perisian GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.