Kesan Terapeutik Cistanoside A Pada Metabolisme Tulang Tikus Ovariectomized

1. Pengenalan

Osteoporosis, "pembunuh senyap" rangka sistemik, telah menjadi bahaya kesihatan utama yang melanda lebih 2000 juta orang di seluruh dunia sejak beberapa tahun kebelakangan ini. Ia dicirikan oleh ketumpatan jisim tulang yang rendah (BMD) dan kemerosotan seni bina mikro, yang berpunca daripada lebihan penyerapan tulang ke atas pembentukan tulang dan, akhirnya, mengakibatkan patah tulang osteoporotik. Pada masa kini, pengenalpastian agen untuk menyekat pembezaan dan penyerapan osteoklastik adalah strategi biasa dan berjaya untuk pembangunan ubat terapeutik untuk osteoporosis, dan sememangnya terdapat banyak agen sintetik, termasuk estradiol valerat dan natrium alendronate, yang bolehmencegah dan merawat osteoporosis. Walau bagaimanapun, ubat-ubatan untuk penyakit itu jauh dari ideal; sesetengah ubat ini boleh meningkatkan risiko kanser endometrium dan payudara dan juga mempunyai tahap kesan sampingan, seperti hiperkalsemia, hiperkalsiuria, dsb., yang mengehadkan aplikasi klinikalnya. Oleh itu, selama lebih satu milenium, ubat-ubatan tradisional Cina (TCM), terutamanya TCM yang boleh dimakan dengan sebatian dan pecahan bioaktif terpencil, telah digunakan secara meluas dengan selamat dan berkesan di negara Asia untuk mencegah dan merawat pelbagai penyakit, termasuk osteoporosis.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MERAWAT DAN MENCEGAH PENYAKIT OSTEOPOROSIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Osteoporosis dicirikan sebagai penyerapan tulang yang dipertingkatkan akibat peningkatan osteoklastogenesis, dan proses ini melibatkan komitmen monosit hematopoietik ke dalam prekursor osteoklas, yang bergabung untuk membentuk osteoklas multinukleus yang menyasarkan tapak tulang yang menjalani pembentukan semula [4]. Pengaktif reseptor untuk ligan faktor-κB nuklear (RANKL), faktor utama yang dirembeskan daripada osteoblas, merangsang pembezaan monosit kepada osteoklas [8,9]. Interaksi RANKL dengan reseptor RANK menghasilkan rangkaian peristiwa intraselular, termasuk NF-κB, PI3K/Akt, dan kinase yang bergantung kepada kalsium/calmodulin dengan merekrut protein isyarat penyesuai faktor berkaitan reseptor TNF (TRAF6). Akibatnya, beberapa gen penanda berkaitan osteoklas, termasuk TRAP, cathepsin K, dan DPD, dikawal selia, dan proses penyerapan tulang dipercepatkan.

Glikosida phenylethanoid dicirikan oleh asid sinamat dan gugusan hidroksil fenil etil yang dilekatkan pada -glucopyranose (apiose, galaktosa, rhamnose, xylose, dll.) melalui ikatan glikosidik, yang diedarkan secara meluas dalam tumbuhan ubatan [10]. Cistanoside A (Cis A) adalah aktiffeniletanoid glikosidadi Cistanche deserticola YC Ma. Menurut rekod farmakope Cina, C. deserticola secara tradisional digunakan untuk merawat kekurangan buah pinggang-yin, kelemahan otot, kelemahan lumbar, dan lain-lain, dan glikosida phenylethanoid adalah juzuk bioaktif utama dalam herba ini [11]. Berdasarkan teori 'buah pinggang' TCM, buah pinggang boleh mengawal sistem tulang, yang bermaksud perkembangan dan fungsi tulang bergantung kepada intipati buah pinggang, dan pati buah pinggang ini boleh berubah menjadi sumsum tulang untuk menyuburkan tulang, menggalakkan pertumbuhan dan pembaikan rangka dan menguatkan rangka [12]. Oleh kerana C. deserticola boleh menguatkan buah pinggang, kami menyangka bahawa Cis A boleh mencegah dan merawat osteoporosis. Oleh itu, kajian ini direka untuk mengesahkan potensiCis A dalam mencegah osteoporosisdengan menggunakan model tikus ovariectomized, dan pembentukan tulang dan penanda penyerapan, serta mekanisme potensi yang berkaitan ditentukan untuk menganggarkan bioaktiviti antiosteoporotik agen ini.

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1. Keputusan

2.1.1. Kesan Cis A pada Ujian Lenturan Tiga Titik Tulang

Untuk menganalisis sama ada rawatan dengan Cis A menjadikan tulang lebih kuat, kami tertakluk kepada ujian lenturan tiga mata tulang paha. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, beban maksimum yang digunakan apabila patah tulang ialah 21.5% dan 22.0% lebih tinggi pada haiwan yang dirawat dengan 20 mg/kg dan 80 mg/ kg Cis A, masing-masing, berbanding haiwan dalam kumpulan ovariectomized (OVX) (p < 0.05). Sementara itu, rawatan dengan Cis A juga meningkatkan kekejangan tulang; semua tikus yang dirawat Cis A menunjukkan peningkatan kekakuan yang ketara dengan data sebanyak 121.0 ± 12.1 (p < 0.05), 124.1 ± 16.2 (p < 0.05) dan 127.7 ± 9.6 (p < 0.01), masing-masing, jika dibandingkan dengan 102.2 ± 10.7 tikus OVX. Keputusan menunjukkan bahawa peningkatan kekuatan tulang dalam tikus OVX yang dirawat dengan Cis A adalah disebabkan oleh peningkatan jumlah tulang dan peningkatan kualiti tulang.

2.1.2. Kesan Cis A pada Mikroarkitektur Tulang

Arkitek mikro tulang trabekular tiga dimensi tikus yang diukur oleh mikro-CT (Rajah 2 dan Jadual 1) secara intuitif menunjukkan bahawa tikus dalam kumpulan OVX menunjukkan pengurangan ketara dalam kawasan trabekular dan nombor trabekular jika dibandingkan dengan kumpulan palsu, menunjukkan bahawa ovariektomi. boleh menyebabkan penurunan ketara dalam ketumpatan jisim tulang (BMD, -46%), kandungan mineral tulang (BMC, -66%), kandungan mineral tisu (TMC, -85%), pecahan isipadu tulang (BVF, −82%), nombor trabekular (Tb. N, -76%) dan peningkatan dalam pemisahan trabekular (Tb. Sp, +80%) tanpa sebarang pengubahsuaian dalam jumlah ketumpatan mineral tisu (TMD) dan ketebalan trabekular (Tb. Th) selepas operasi selama 12 minggu. Walau bagaimanapun, tikus OVX yang dirawat dengan Cis A mengakibatkan peningkatan BMD yang bergantung kepada dos (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), pengurangan Tb yang lebih besar. Sp (-79%~88%) dan Tb dipertingkatkan lagi. N (+73%~82%) berbanding kumpulan OVX. TMD nampaknya tidak dipengaruhi oleh ovariektomi tetapi meningkat dengan ketara oleh rawatan dengan estradiol valerate (EV).

2.1.3. Kesan Cis A pada Kedua-dua Pembentukan Tulang dan Penanda Penyerapan

Kesan Cis A pada penanda penyerapan tulang, termasuk TRAP, DPD, cathepsin K indeks pembentukan tulang ALP, dan bone Gla-protein (BGP), ditunjukkan dalam Rajah 3. Selepas 12 minggu operasi ovariektomi, aktiviti TRAP, DPD , dan cathepsin K dalam kumpulan OVX telah meningkat dengan ketara, terutamanya DPD, yang meningkat hampir 55.6%; TRAP dan cathepsin K masing-masing meningkat sebanyak 43.5% dan 38.1%, berbanding kumpulan palsu. Cis A, diberikan secara lisan selama 12 minggu, menunjukkan potensi ketara dalam menghalang semua penanda penyerapan tulang yang disebutkan di atas, terutamanya dos yang tinggi (80 mg/kg) yang menunjukkan kesan ketara ke atas menyekat aktiviti DPD. sebanyak 45.0%, TRAP sebanyak 49.0% dan cathepsin K sebanyak 44.0%, masing-masing (p < 0.01), berbanding dengan Kumpulan OVX (Rajah 3). Walaupun trend peningkatan aktiviti ALP dan BGP ditunjukkan dalam kumpulan OVX, tiada perubahan ketara secara statistik diperhatikan. Walau bagaimanapun, peningkatan ketara dalam aktiviti ALP diperhatikan dalam kumpulan rendah dan tinggi-Cis A-dirawat berbanding dengan kumpulan palsu (p <0.01).

CISTANCHE TUBULOSA SEMULAJADI UNTUK MENCEGAH PENYAKIT OSTEOPOROSISPHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. Kesan Cis A pada Tahap Ekspresi Protein TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG dan RANKL

Analisis Western blot mendedahkan bahawa berbanding dengan kumpulan palsu, paras protein TRAF6, NF-κB, dan RANKL dalam kumpulan OVX telah meningkat dengan ketara (p < 0.05), manakala OPG, PI3K, dan Akt telah menurun dengan ketara (Rajah 4). Cis A (20 mg/kg atau 80 mg/kg) mengecilkan ekspresi TRAF6 dengan ketara (p < 0.05), diikuti dengan ungkapan RANKL dikurangkan dan OPG meningkat, yang bermaksud nisbah OPG/RANKL telah dikawal selia. Akibatnya, lata isyarat NF-κB telah dikurangkan dan PI3K / Akt dikawal oleh rawatan Cis A (p <0.05).

2.2. Perbincangan

Memandangkan keterbatasan pilihan terapeutik semasa untuk penyakit osteoporosis, terdapat keperluan untuk alternatif daripada makanan atau tumbuhan ubatan semulajadi yang boleh dimakan. Sebagai sebahagian daripada usaha berterusan kami untuk menemui agen antiosteoporotik yang berkesan daripada TCM, kami menemui satu siri ekstrak, pecahan, dan sebatian yang mempunyai kesan sifat antiosteoporotik [13,14]. Cistanche deserticola ialah TCM klasik yang penting, yang didapati mempunyai profil keselamatan yang menggalakkan [15] dan fungsi perubatan yang luas untuk rawatan kekurangan buah pinggang, dsb. [16]. Mengikut teori TCM, TCM yang mempunyai kesan mencergaskan buah pinggang biasanyadigunakan untuk merawat osteoporosis; glikosida phenylethanoid adalah juzuk bioaktif utama dalam herba ini, dengan itu membayangkan bahawaglikosida fenilethanoidyang terkandung dalam C. deserticola mungkin mempunyai sifat antiosteoporotik. Telah terbukti bahawa ekstrak C. deserticola boleh menghalang pengurangan BMD dengan ketara dan menghalang kemerosotan mikroarkitektur trabekular yang disebabkan oleh OVX [17]. Dalam percubaan in vitro, ia juga meningkatkan ALP, protein morfogenetik tulang-2 dan mRNA osteopontin dengan ketara, serta mineralisasi tulang osteoblas berbudaya [18]. Echinacoside, komponen bioaktif utama dalam C. deserticola yang direkodkan secara rasmi dalam farmakope Cina [11], mempamerkan aktiviti antiosteoporotik dengan dos tinggi 30~270 mg/kg berat badan/hari [19], dan seterusnya keputusan in vitro menunjukkan bahawa ia boleh menggalakkan penjanaan semula tulang dengan meningkatkan catuan OPG/RANKL dalam sel MC3T3-E1 Subclone 14 [20]. Cis A ialah salah satu daripada phenylethanol glycosides yang diasingkan daripada C. deserticola, dan beberapa laporan mendedahkan bahawa sebatian ini mempunyai aktiviti antioksidatif [21] dan sifat anti-radang [22,23]. Kertas kerja yang diterbitkan baru-baru ini mendapati bahawa Cis A mempamerkan aktiviti perlindungan pada kedua-dua CCl4 dan hepatotoksisiti yang disebabkan oleh alkohol pada tikus, dan ia juga menunjukkan sifat perlindungan pada kerosakan yang disebabkan oleh etanol dalam hepatosit tikus kultur primer secara in vitro [24]. Dalam kajian kami sekarang, keputusan menunjukkan bahawa Cis A mempunyai aktiviti antiosteoporotik pada dos yang rendah (20 ~ 80 mg / kg berat badan / hari) dengan menggunakan model tikus yang diovariektomi, dan bioaktiviti ini dilakukan dengan merendahkan tahap TRAF6, menindas. ungkapan RANKL dan NF-κB dan merangsang OPG, PI3K dan Akt, yang bermaksud kesan terapeutik Cis A dalam tikus OVX adalah melalui mekanisme TRAF6-penyahaktifan NF-kappaB dan pengaktifan PI3K/Akt.

Telah diketahui umum bahawa ovariektomi boleh menyebabkan osteoporosis dengan penurunan ketara dalam BMD, kekuatan biomekanikal, kualiti tulang, dan microarchitecture tulang trabekular, dan perubahan di atas sebahagiannya disebabkan oleh kekurangan estrogen [25]. Kini, dalam eksperimen in vivo sekarang, kajian kami menunjukkan bahawa osteoporosis yang disebabkan oleh ovariektomi mengakibatkan pengurangan ketara dalam kekuatan biomekanik dan parameter struktur trabekular, termasuk BMD, BMC, TMC, dan Tb. N, dan meningkatkan Tb. Sp; dan rawatan Cis A dengan ketara meningkatkan sifat mekanikal tulang termasuk beban maksimum dan kekakuan, meningkatkan BMD, dan meningkatkan kebanyakan parameter struktur mikroarkitektur trabekular tulang berbanding dengan tikus dalam kumpulan OVX, menunjukkan bahawa Cis A berkesan dalam memperbaiki kualiti tulang. dan mikroarkitektur trabekular dalam tikus OVX.

Selain jumlah BMD, ujian lenturan tiga mata dan pengukuran mikroarkitektur tulang trabekular boleh mendiagnosis osteoporosis secara langsung, penanda pembentukan tulang, termasuk ALP dan BGP, dan indeks penyerapan tulang, termasuk TRAP, DPD, dan cathepsin K, juga digunakan untuk jelaskan mekanisme antiosteoporotik berkaitan Cis A. Dalam kajian kami, aktiviti ALP dalam tikus kumpulan OVX menunjukkan trend peningkatan yang tidak ketara, yang menunjukkan peningkatan kadar pusing ganti tulang [26,27] dalam osteoporosis selepas menopaus; dos tinggi (80 mg/kg berat badan/hari) dan rendah (20 mg/kg berat badan/hari) bagi rawatan Cis A menunjukkan peningkatan ketara pada aktiviti ALP berbanding kumpulan palsu, manakala aktiviti BGP nampaknya tidak dipengaruhi oleh ovariektomi dalam semua kumpulan yang dirawat; TRAP, DPD, dan cathepsin K meningkat dengan ketara dalam kumpulan OVX, dan pentadbiran Cis A dengan ketara mengurangkan ketiga-tiga penanda penyerapan tulang. Data di atas menunjukkan bahawa Cis A mempunyai aktiviti antiosteoporotik yang berpotensi, dan kesan ini dilakukan oleh peraturan metabolisme tulang, termasuk kedua-dua menyekat penyerapan tulang dan meningkatkan pembentukan tulang.

Penyelarasan antara osteoblas dan osteoklas merupakan faktor kritikal dalam mengekalkan integriti rangka. Osteoklas, mengekspresikan TRAP, melekat pada permukaan tulang melalui pembentukan zon pengedap terikat aktin, di mana enzim proteolitik, seperti cathepsin K, dilepaskan, yang membawa kepada pembentukan lubang resorpsi. Modulasi osteoklastogenesis oleh sel-sel belum matang dari keturunan osteoblastik dimediasi oleh RANKL dan OPG [28]. OPG ialah reseptor umpan yang menghalang pengaktifan RANKL osteoklastogenesis, dengan itu mengurangkan penyerapan tulang. RANKL, yang memberikan isyarat penting kepada progenitor osteoklas, adalah molekul terikat membran bagi keluarga ligan faktor nekrosis tumor yang menggalakkan pembentukan osteoklas. Nisbah ekspresi OPG/RANKL dipercayai sebagai parameter utama aktiviti osteoklastogenik, dan lata isyarat yang diaktifkan oleh RANKL termasuk laluan NF-κB dan PI3K [29]. Kepentingan laluan NF-κB kepada osteoklastogenesis ditunjukkan oleh fakta bahawa penghapusan NF-κB pada tikus mengakibatkan ketiadaan osteoklas matang [30]. TRAF6 telah terbukti sebagai sasaran yang menjanjikan untuk ubat anti-osteoporotik novel. TRAF{11}}tikus kekurangan yang menunjukkan osteoklastogenesis yang rosak dan osteopetrosis yang teruk sekali gus menunjukkan kepentingan TRAF6 dalam metabolisme tulang. Bukti yang muncul menunjukkan fungsi pengawalseliaan kritikal untuk TRAF6 dalam lata isyarat pengantara RANKL/RANK [4,31]. Data kajian semasa menunjukkan bahawa rawatan Cis A pada tikus OVX mengakibatkan pengurangan tahap ekspresi protein TRAF6, menurunkan RANKL, dan meningkatkan ekspresi OPG dengan itu menghalang pengaktifan RANKL NF-κB hiliran dan mengaktifkan laluan isyarat PI3K / Akt, mencadangkan bahawa Cis A menghalang pembezaan osteoklas melalui penyahaktifan NF-kappaB pengantara TRAF6-dan pengaktifan PI3K/Akt dan meningkatkan nisbah OPG/RANKL, seterusnya menghalang osteoklastogenesis dan menggalakkan pembentukan tulang.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUKAKTIVITI ANTIOSTEOPOROTIKPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Bahan dan Kaedah

3.1. Bahan Tumbuhan, Penyediaan dan Penentuan

Batang Cistanche deserticolaYC Ma, yang dikenal pasti oleh Prof. Xue-yan Fu dari Jabatan Farmasi, Universiti Perubatan Ningxia, telah dikumpulkan pada 2015 September di Daerah Yongning, Wilayah Ningxia, China. Satu spesimen baucar (#20150901) telah dipelihara dalam herbarium jabatan farmasi. Sebanyak 30.0 kg batang C. deserticola kering udara telah diekstrak refluks dengan 70% etanol (180 L, 3 × 2 h) 3 kali. Turasan telah digabungkan dan tertakluk kepada lajur resin makroporous (AB-8) dengan sistem pelarut kecerunan berperingkat bagi peningkatan etanol dalam air (0%, 20% dan 60%, setiap 60 L) untuk memberikan tiga pecahan, kemudian 60% daripada pecahan itu telah disucikan lagi oleh Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Sweden) dan kromatografi cecair berprestasi tinggi separa persediaan (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Jerman) untuk mendapatkan kuning pucat cistanoside A 4.5 g (Cis A; hasil ialah 0.015%). Struktur ini dijelaskan terutamanya oleh analisis data NMR (Bruker Avance, 400 MHz, Jerman) dan spektrum MS (Agilent 6540, Agilent Technologies), yang konsisten dengan data yang dilaporkan [19]. Ketulenannya ditentukan oleh kaedah normalisasi kawasan HPLC (Rajah 5). Dalam eksperimen haiwan, berdasarkan eksperimen awal kami, dos Cis A ialah 20-80 mg/kg/hari.

3.2. Bahan Kimia dan Pelarut

Berikut digunakan: kit pengekstrakan protein total dan kit pengkuantitian protein BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, China), antibodi utama TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -actin dan tubulin ( Teknologi Isyarat Sel, Beverly, MA, Amerika Syarikat), antibodi sekunder kambing peroksidase-konjugasi lobak pedas anti-arnab IgG (ZSGB-BIO, Beijing, China), estradiol valerate (1 mg, Delpharm Lille SAS, Paris, Perancis), tulang Gla -pautan silang protein dan deoxypyridinoline kit ELISA (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China) dan kit cathepsin K ELISA (Biovision, Mountain View, CA, USA). Semua bahan kimia dan agen biokimia lain yang digunakan ialah reagen gred analitik AR.

3.3. Eksperimen Haiwan

Enam puluh ekor tikus terikan Kunming betina, berumur 8 minggu dengan berat badan 26.0 ± 1.62 g, telah dibeli dari Universiti Perubatan Ningxia dan 10 tikus disimpan dalam satu sangkar dengan diet makmal standard dan air paip di bawah keadaan terkawal udara (24.0 ± 0.5 ◦C, 45%–50% kelembapan dan 12 j/12 jam kitaran pencahayaan gelap-gelap). Selepas disesuaikan selama 1 minggu, pembedahan dilakukan di bawah keadaan aseptik, dan semua tikus telah dibius dengan hidrat kloral (100 mg/kg, ip); tikus yang tertakluk kepada pendedahan pembedahan tanpa mengeluarkan ovari ialah kumpulan palsu (n=10); yang lain tertakluk kepada ovariektomi dua hala sebagai kumpulan OVX (n=50). Eksperimen haiwan di atas telah dijalankan mengikut panduan untuk penjagaan dan penggunaan haiwan makmal dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Bioetika Universiti Perubatan Ningxia.

Selepas {{0}}minggu tempoh pemulihan, 50 tikus OVX di atas telah dibahagikan secara rawak dan sama kepada 5 kumpulan: dirawat secara lisan dengan estradiol valerate (1 mg/kg/hari) sebagai kawalan positif (EV); dengan 20, 40, dan 80 mg/kg/hari Cis A sebagai kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi, masing-masing; dengan kenderaan (0.5% Carboxymethylcellulose()-Na) sebagai kumpulan model (OVX). Semua tikus diberikan secara lisan dengan jumlah yang sama 1 mL/100 g kenderaan berat badan, EV atau Cis A, yang bermula pada minggu kedua selepas pembedahan dan berlangsung selama 12 minggu. Berat badan diukur setiap dua minggu, dengan dos diselaraskan dengan sewajarnya. Selepas pemberian oral terakhir, sampel darah telah ditarik balik dari arteri femoral tikus yang telah dibius, dibiarkan membeku, dan disentrifugasi pada 3000× g selama 10 minit untuk mendapatkan serum; femora dan tibia kanan dibedah. Kesemua sampel disimpan pada suhu -80 ◦C untuk penilaian lanjut mengenai mikroarkitektur tulang dan parameter biokimia serum berkaitan osteoporotik.

3.4. Ujian Lenturan Tiga Titik

Sifat biomekanik tulang paha kanan tetikus ditentukan dengan menggunakan susunan lenturan tiga mata. Jig lentur mempunyai sokongan berbentuk V untuk mengamankan hujung distal dan proksimal femur semasa ujian. Femur diletakkan secara mendatar dengan bahagian anterior ke atas, dan beban dikenakan ke bawah di tengah pertengahan femur. Jarak antara penyokong ialah 8 mm. Tulang telah dimuatkan pada kadar anjakan malar 0.02 mm/s sehingga kegagalan menggunakan Mesin Pengujian BOSE (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, USA). Lengkung anjakan beban telah diperoleh dan digunakan untuk pengiraan sifat struktur dan bahan, termasuk beban maksimum, beban puncak, modulus anjal, kekuatan lentur, dsb.

3.5. Analisis Tomografi Berkomputer Mikro

Femur kanan semua tikus dibersihkan daripada tisu lembut yang melekat, dan mikroarkitektur tulang trabekular metafizik femoral distal kanan di atas ditentukan oleh pengimbas mikro-CT (eXplore Locus SP, GE Healthcare, London, ON, Kanada) dengan resolusi isotropik ditetapkan kepada 8 µm dalam ketiga-tiga dimensi spatial. Kawasan kepentingan (ROI) dipilih dengan menggunakan koordinat yang sama dalam plat pertumbuhan tulang paha. Parameter morfometrik tulang, termasuk BMD, kandungan mineral tulang (BMC), kandungan mineral tisu (TMC), ketumpatan mineral tisu (TMD), pecahan isipadu tulang (BVF), pemisahan trabekular (Tb. Sp), nombor trabekular (Tb. N ) dan ketebalan trabekular (Tb. Th), dinilai melalui analisis ROI dengan menggunakan perisian analisis tulang ABA.

3.6. Analisis Parameter Biokimia

Aktiviti serum alkaline phosphatase (ALP) diukur pada penganalisis automatik (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)); tahap serum DPD, BGP, dan cathepsin K ditentukan oleh kit reagen yang sepadan, dan fosfatase asid tahan tartrat (TRAP) dianalisis mengikut kesusasteraan yang berkaitan [32].

3.7. Analisis Western Blot

Tahap ekspresi protein TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG, dan RANKL dalam kumpulan berbeza telah dikesan oleh analisis blot Barat. Secara ringkas, protein telah diekstrak daripada tibia kanan tikus menggunakan penimbal lisis yang mengandungi 0.5 mM fenilmetilsulfonil fluorida, protease dan perencat fosfatase. Lysates telah disentrifugasi selama 10 minit pada 12,000× g untuk mendapatkan supernatan untuk analisis selanjutnya. Kepekatan protein lisat diukur menggunakan ujian kuantifikasi asid bicinchoninic. Protein (50-100 μg) diasingkan menggunakan 10% SDS-PAGE, dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida dan diinkubasi dengan antibodi primer monoklonal yang menyasarkan TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG dan -actin (1:500). Membran yang sama telah dilucutkan dan ditegur, dengan isyarat chemiluminescent dikesan oleh perisian Makmal Imej. -aktin atau tubulin berfungsi sebagai kawalan dalaman.

3.8. Analisis Statistik

Semua data yang diperoleh daripada eksperimen haiwan dianalisis dengan menggunakan analisis varians sehala dengan ujian Dennett oleh SPSS (Versi 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA ) perisian; nilai p < 0.05 dianggap signifikan secara statistik dan semua keputusan dibentangkan sebagai min ± SD.

4. Kesimpulan

Secara ringkasnya, Cis A,glikosida phenylethanoid aktifdiasingkan daripada C. deserticola, mempamerkan aktiviti antiosteoporotik yang ketara pada tikus OVX, dan mekanisme molekul mungkin berkaitan dengan 6-pengaktifan NF-kappaB pengantara TRAF dan pengaktifan PI3K/Akt, justeru berkemungkinan agen yang menjanjikan untuk rawatan osteoporosis penyakit.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUKAKTIVITI ANTIOSTEOPOROTIKPHGS75% ECH 30% ACT 12%