Kesan Pemutihan Kulit Ectoine Melalui Penindasan Melanogenesis yang Dirangsang -MSH Dan Pengaktifan Laluan Nrf2 Antioksidan dalam Keratinosit Terradiasi UVA

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1,Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 dan Hsin-Ling Yang 8,*

Abstrak:Pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) yang disebabkan oleh sinaran ultraungu A (UVA) mengantara secara berlebihanmelanogenesisdalam sel kulit yang membawa kepada pigmentasi. Kami menunjukkan kesan depigmentasi dan anti-melanogenik Ectoine, osmolit bakteria semula jadi, dalam keratinosit manusia yang disinari UVA (HaCaT), dan mekanisme molekul asas telah dijelaskan. HaCaTcells telah pra-rawatan dengan kepekatan rendah Ectoine (0.5–1.5 µM) dan diuji untuk pelbagai parameter depigmentasi dan anti-melanogenik. Pra-rawatan ini merendahkan penjanaanROS, pengeluaran hormon perangsang-melanosit (-MSH) dengan ketara dan ekspresi proopiomelanocortin(POMC) dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Juga,antioksidanheme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H dehidrogenase [kuinon 1] (NQO-1), dan ungkapan protein subunit pemangkin ligase-glutamat-cysteine(-GCLC) adalah dimediasi melalui translokasi nuklear faktor nuklear erythroid2-faktor 2 (Nrf2) yang knockdownnya sememangnya menjejaskan kesan ini yang menandakan kepentingan laluan Nrf2. Ectoine sedang mengantarkan pengaktifan Nrf2 melalui p38, protein kinase B (juga dikenali sebagai AKT), protein kinase C (PKC), dan jalur protein kinase kinase II (CKII). Medium terkondisi yang diperolehi daripada sel HaCaT yang diprarawat Ectoine dan disinari UVA menurunkan kawalantyrosinase, protein berkaitan tyrosinase-1 dan -2 (TRP-1/-2), kinase protein AMP (c-AMP) kitaran, protein pengikat unsur c-AMPresponse (CREB ), dan ekspresi faktor transkripsi berkaitan mikroftalmia (MITF) yang membawa kepada sel melanoma B16F10 yang telah menghalang sintesis melanin. Menariknya, kesan anti-melanogenik ini dalam sel B16F10 yang dirangsang MSH hanya boleh dilihat pada 50–400 µMkepekatan Ectoine, menandakan peranan utama yang dimainkan oleh kulit keratinocytesin yang dirawat Ectoine (0.5–1 µM)pemutihankesan. Kami membuat kesimpulan bahawa Ectoine boleh digunakan sebagai agen kosmetik semulajadi topikal yang berkesan dengan keberkesanan penyahpigmenan dan anti-melanogenik.

Kata kunci:Ectoine; keratinosit;melanogenesis; tyrosinase; -MSH; Nrf2

Cistanche mempunyai kesan anti-pengoksidaan.

1. Pengenalan

Mendedahkan kulit manusia kepada sinaran UVA mencetuskan penjanaan ROS dan juga melaninin yang berlebihan dalam sel kulit. Pengeluaran ROS yang tidak terkawal boleh menyebabkan keadaan melanoma juga. Kebanyakan agen pemutih kulit menyasarkan dan cuba meminimumkanmelanogenesisproses melalui perencatan -MSH dantyrosinasepengeluaran [1]. Kebanyakan krim pencerah rona kulit terdiri daripada hidrokuinon [2] atau hidrokortison [3], yang diketahui dapat mengurangkan pembentukan melanin butare yang juga dikaitkan dengan kesan sampingan yang teruk. Contohnya, jerawat, kulit mengelupas dan gatal, perubahan warna biru dan hitam pada kulit, okronosis, kerengsaan kulit yang terbakar dan menyengat, dan juga keradangan. Walau bagaimanapun, kulitpemutihanagen daripada sumber semula jadi, contohnya, asid Kojic (turunan kulat yang diperoleh daripada spesies Penicillium dan Aspergillus) juga dilaporkan menyebabkan 'dermatitis kontak' pada individu yang mempunyai kulit sensitif. Dalam individu ini, lebih daripada 1 peratus asid kojic boleh menyebabkan kesan sampingan hipersensitif yang teruk [4,5]. Oleh itu, hanya beberapa kulit yang diperoleh secara semula jadipemutihanproduk (oleosin, ekstrak likuoris, asid askorbik, protein soya, N-asetil glukosamin, dll.) sedang digunakan dalam industri kosmetik [6]. Walau bagaimanapun, produk penjagaan kulit yang secara asasnya menyasarkan sifat penyahpigmenan kadangkala gagal untuk memberi tumpuan untuk menangkis kesan buruk yang ditimbulkan oleh lebihan pengantaraan pengeluaran ROS yang disebabkan oleh penyinaran UVA.melanogenesisdalam sel kulit.

Ectoine ialah 'extremolyte semula jadi' yang dihasilkan daripada beberapa spesies mikroorganisma dalam keadaan kurang tekanan [7,8]. Kompaun ini pertama kali diasingkan daripada spesies bakteria Ectothiorhodospira yang hidup di padang pasir Mesir. Lata gen operon ect (ectA, ectB, ectC, atau ectD) terlibat dalam penghasilan sebatian ini. Ektoin secara kimia ditetapkan sebagai1,4,5,6-tetrahydro-2-metil-4-asid pirimidinakarboksilik [9]. Sebagai pengikat lembapan, Ectoine membantu, penstrukturan semula membran sel kulit [10], perlindungan daripada kerosakan UV dan pencemaran [11,12], melembapkan kulit [13], melambatkan penuaan kulit pramatang [14], dsb. kepada peranan pelindung kulit, Ectoine telah terbukti berguna dalam rawatan dermatitis atopik [15], Alzheimer [16], serta perencatan replikasi HIV [17], radio dan kemoterapi [18], dan sirosis hati [1]. 19].Ectoine dispekulasi mempamerkan sifat depigmentasi dan pemutihan kulit tanpa menyebabkan kesan sampingan yang tidak diingini [20]. Sebaliknya, mekanisme molekul yang ditimbulkan oleh Ectoine tidak diketahui. Oleh itu, objektif kajian ini adalah untuk menggambarkan mekanisme depigmentasi dan anti-melanogenik pengantara Ectoine yang ditimbulkan dalam keratinosit manusia yang disinari UVA (HaCaT) sebagai sistem model selular. Kesan rembesan yang disebabkan oleh Ectoine bagi agen pelindung kulit daripada sel HaCaT ke medium kultur (medium berhawa dingin) juga telah diuji menggunakan garis sel melanoma (B16F10) tipikal juga.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Reagen dan Antibodi

Ectoine (No produk: 81619, ketulenan Lebih besar daripada atau sama dengan 95 peratus ) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (Taufkichen, Jerman). Serum lembu janin (FBS), penicillin/streptomycin, Dulbecco's modified Eagle'smedium (DMEM) dan l-glutamin dibeli daripada Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA). l-DOPA, melanin, 3-4,5-dimetil-2-yl-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), dan -MSH diperoleh daripada Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). N-acetylcysteine ​​(NAC) dan20,70-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH2-DA) diperoleh daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Semua perencat farmakologi yang diperlukan untuk JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X), dan CKII diperolehi daripada Calbiochem (La Jolla, CA, USA) PI3K/AKT inhibitor(LY294002) diperolehi dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Semua antibodi untuk POMC, CREB, -actin,tyrosinase, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, protein berkaitan ECH seperti Kelch-1 (Keap-1), dan TRP-1, TRP-2 diperoleh daripada Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Jerman). Antibodi menentang -GCLC dan HO{10}} diperoleh daripada Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, Amerika Syarikat). Kami memperoleh antibodi terhadap kinase protein c-AMP dan CKII dari Abcam (Cambridge, MA, Amerika Syarikat). Histones, MITF, p-p38, p38, p-AKT, dan AKT diperoleh daripada Teknologi Isyarat Sel (Beverly, MA, Amerika Syarikat). Reagen pengesanan chemiluminescence (ECL) yang dipertingkatkan diperolehi daripada Millipore, (Billerica, MA, USA). Semua reagen lain (pada gred HPLC) sama ada dibeli daripada Sigma-Aldrich atau Merck & Co., Inc. (Darmstadt, Jerman).

2.2. Kultur sel

Kami memperoleh sel HaCaT keratinosit kulit manusia yang diabadikan dan melanoma murine B16F10 daripada kedua-dua Perkhidmatan Talian Sel (CLS, Eppelheim, Jerman) dan Koleksi Budaya Jenis Amerika (ATCC, VA, Amerika Syarikat). Sel-sel telah dikultur dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS diaktifkan haba, 1 peratus streptomycin/penisilin, dan 2 mM L-glutamin dalam inkubator lembap ditambah dengan 5 peratus CO2at 37 ◦C.

2.3. Rawatan Sel dan Penyinaran UVA

Sebelum penyinaran UVA, sel telah dirawat terlebih dahulu dengan Ectoine (0.5–1.5 µM selama 24 jam) atau kenderaan(PBS). Selepas pengeraman, sel yang dibasuh PBS telah terdedah kepada sinaran UVA 3 J/cm2 (selama 27 min, λmaks, 365 nm, tiada pelepasan yang boleh dikesan di bawah 320 nm) menggunakan UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec,Cambridge, UK) [21].

2.4. Ujian ROS intraselular

Sel HaCaT telah disemai pada ketumpatan 1.5 × 105dalam 8-ruang Lab Teck telaga yang mengandungi DMEMdilengkapi dengan 10 peratus FBS dan telah ditanam kepada 80 peratus pertemuan. Sel-sel ini mula-mula dirawat dengan 1.5 µM Ectoine, diikuti dengan pendedahan kepada penyinaran UVA 3 J/cm2 untuk tempoh masa yang ditetapkan. Sel telah dibasuh dengan PBS dan kaedah DCFH2-DA digunakan untuk menentukan pengeluaran ROS intraselular menggunakan perisian penyelesaian Olympus Software untuk setiap keadaan [21].

2.5. Kuantifikasi Melanin

Dalam 6-plat perigi, sel murine melanoma B16F10 disemai pada ketumpatan 2.5 × 105sel/telaga. Mereka telah dirawat terlebih dahulu dengan 100, 200 dan 400 µM Ectoine selama 2 jam tanpa kehadiran atau kehadiran -MSH (1 µM). Protokol yang digunakan untuk kuantifikasi melanin mengikuti kaedah yang diterangkan sebelum ini [21]. Kami mengukur kandungan melanin dengan pembaca plat mikro ELISA dengan panjang gelombang penyerapan 470 nm.

cistanche menghalang melanin.

2.7. Penghapusan Barat

Sel HaCaT (1 × 106sel/10 cm hidangan) atau B16F10 (1 × 106sel/10 cm hidangan) telah dirawat terlebih dahulu dengan kepekatan Ectoine yang berbeza-beza (0.5, 1, dan 1.5 µM) atau -MSH (1 µM) diikuti dengan penyinaran semasa ketiadaan atau kehadiran UVA untuk tempoh masa yang ditetapkan. Sel yang dibasuh PBS dituai, kandungan protein (nuklear dan sitosolik) diasingkan selepas rawatan. Kemudian, sel-sel telah tertakluk kepada kaedah Western blot yang digunakan sebelum ini untuk penentuan ekspresi pelbagai protein nuklear dan sitosolik [21].

2.8. Pengekstrakan RNA dan RT-PCR

Ektoin pra-rawatan (1.5 µM, 24 h) sel HaCaT tertakluk kepada reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad) untuk pengasingan jumlah RNA daripada sel-sel ini. 1 µg jumlah RNA dan reagen yang dibekalkan oleh kit platinum Taq SuperScript-III One-Step RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad) telah digunakan dalam eksperimen PCR dengan instrumen PCR Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Primer hadapan dan belakang untuk Nrf2 yang digunakan ialah: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Primer hadapan dan belakang untuk GAPDH yang digunakan ialah:F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Pada akhir eksperimen, produk PCR dianalisis menggunakan 1 peratus gel agarose. Kemudian, ia divisualisasikan dengan pewarnaan etidiumbromida. Sebagai kawalan dalaman, kami menggunakan GAPDH [22].

2.9. Ujian Imunofluoresensi

Sel HaCaT dibiakkan pada ketumpatan 1 × 104sel/telaga dalam suplemen DMEM dengan 10 peratus FBS dalam 8-ruang telaga Lab Tek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kami prarawat sel dengan 1.5 µM Ectoine untuk masa yang dinyatakan diikuti dengan penyinaran tanpa kehadiran atau kehadiran UVA. Sel-sel telah tertakluk kepada ujian imunofluoresensi, yang menggunakan kaedah yang telah diterangkan sebelum ini [21].

2.10. Analisis statistik

Kami menggunakan min ± sisihan piawai (min ± SD) untuk semua keputusan yang digunakan dalam kajian ini. Semua data dianalisis dengan analisis varians (ANOVA), diikuti dengan ujian Dunnett untuk perbandingan berpasangan-bijak dan dibentangkan sebagai min ± SD tiga atau lebih banyak eksperimen bebas. Kepentingan statistik telah ditetapkan pada * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" jika="" dibandingkan="" dengan="" sel="" kawalan="" yang="" tidak="" dirawat,="" dan="" #="" p="">< 0.05;="" ##="" p="">< 0.01;="" ###="" p="">< 0.001="" jika="" dibandingkan="" dengan="" sel="" hacat="" yang="" terdedah="" kepada="" uva="" atau="" sel="" b16f10="">

3. Keputusan

3.1. Ectoine Menghalang Penjanaan ROS Terinduksi UVA dalam Sel HaCaT

Mula-mula, kami menguji kesan sitotoksik Ectoine (Rajah 1A) pada sel HaCaT yang disinari UVA. Data MTT kami menunjukkan bahawa jika dibandingkan dengan sel kawalan yang tidak dirawat, Ectoine pra-rawatan(0.5–1.5 µM) dan 3 J/cm2 UVA sel HaCaT yang terdedah tidak dapat menunjukkan penurunan ketara dalam daya hidup sel (Rajah 1B). Selanjutnya, prarawatan Ectoine melemahkan kematian sel yang disebabkan oleh UVA (3 J/cm2) dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 1B). Sebagai tambahan kepada data pendarfluor kami, yang menunjukkan bahawa, jika dibandingkan dengan sel kawalan, penyinaran UVA 3 J/cm2 dan rawatan Ectoine sahaja (1.5 µM) secara ketara mengimbangi tahap ROS sebanyak 5- dan 2-kali ganda, masing-masing. Walau bagaimanapun, dalam kes Ectoinepretreatment tahap ROS telah dikurangkan dengan ketara dan kita boleh membuat kesimpulan bahawa Ectoine mempunyaiantioksidankesan terhadap penyinaran UVA. Ini juga mendorong tahap basal ROS dalam sel HaCaT (Rajah 1C, D).

3.2. Ekspresi POMC dan -MSH Ditindas Ectoine dalam Sel HaCaT yang Disinari UVA

Keratinosit terdedah UVA telah dirangsang untuk POMC pengantara ROS-p53 dan juga hormon peptida kecil -MSH yang diperoleh daripada POMC [23]. Oleh itu, kami menentukan corak inexpression perubahan -MSH, POMC, dan protein lain yang berkaitan dalam sel HaCaT pra-rawatan Ectoine dan kemudian mendedahkannya kepada UVA (3 J/cm2). Data Western blot menunjukkan bahawa upregulasi UVA yang disebabkan oleh ekspresi -MSH dan POMC telah dikurangkan oleh prarawatan Ectoine; manakala, Ectoinetreatment tanpa penyinaran UVA telah menghalang sepenuhnya ekspresi -MSH dan POMC sel HaCaT yang tidak disinari (Rajah 2A). Kemudian, kami menguji kesan 'berkondisi-sederhana' (plat 10 mL/100 mm), yang diperolehi daripada sel HaCaT yang diprarawat Ectoine dan disinari UVA, padamelanogenesisdaripada sel melanoma B16F10. Rajah 2B menunjukkan medium terkondisi ini menurunkan kawal seliatyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP protein kinase, p-CREB, CREB dan tahap MITF dalam sel B16F10.

3.3. Ekspresi Melanin dan Tirosinase Terkurang Ektoin dalam Sel B16F10 yang Dirangsang MSH

Sel melanoma B16F10 mula-mula tertakluk kepada kepekatan Ectoine yang lebih tinggi dan kesan sitotoksisiti ditentukan menggunakan ujian MTT. Rajah 3A menunjukkan bahawa Ectoine tidak mempunyai kesan yang ketara ke atas daya maju sel B16F10 pada kepekatan yang lebih tinggi (100-400 μM selama 72 jam). Walau bagaimanapun, daya maju sel tidak terjejas pada 24 dan 48 jam rawatan Ectoine (data tidak ditunjukkan). Oleh itu, kepekatan ini digunakan untuk menentukan kesan Ectoine pada -MSH-stimulatedmelanogenesisdalam sel B16F10. Data kuantifikasi melanin menunjukkan bahawa, berbanding dengan sel kawalan, rawatan dengan -MSH (1 μM) sahaja secara signifikan meningkatkan tahap melanin sebanyak lebih daripada 25 peratus. Walau bagaimanapun, berbanding dengan rawatan -MSH sahaja, sel-sel yang terdedah kepada peningkatan kepekatan Ectoine (100-400 μM pada 72 jam) bergantung kepada dos dan menurunkan dengan ketara peratusan kandungan melanin dengan pengurangan maksimum hanya 85 peratus (atau -15 peratus daripada yang tidak dirawat. kawalan) diperhatikan pada 400 μM prarawatan Ectoine (Rajah 3B). Selain itu, data Western blot kami juga menunjukkan bahawa -MSH dirangsangtyrosinaseEkspresi (24 jam) dan p-CREB (2 jam) telah dikurangkan dengan ketara dengan peningkatan kepekatan prarawatan Ectoine dalam sel melanoma ini (Rajah 3C).

3.4. Ectoine Mengatur Ungkapan HO-1, NQO-1 dan -GCLC Protein dalam Sel HaCaT

Untuk menentukan kesan masa pada translokasi nuklear pengantara Ectoine bagi Nrf2 dan ekspresi hiliran seterusnya bagi protein HO-1, NQO-1, dan -GCLC, sel HaCaT telah didedahkan kepada 1.5 µM Ectoine dan protein selular telah dituai 0.5, 1, 2, 4, 8 atau 12 jam selepas Ectoinetreatment. Data Western blot menunjukkan bahawa kecuali untuk protein -GCLC, 1.5 µM Ectoine menyebabkan ekspresi maksimum protein HO-1, Nrf2 dan NQO-1 pada titik masa 4 jam. -GCLC ditunjukkan pada titik masa 8j (Rajah 5A). Data yang diperoleh daripada lengkung masa membawa kita untuk menguji kesan kepekatan Ectoine pada ekspresiantioksidanprotein pada titik masa 4j. Rajah 5B menunjukkan bahawa ketiga-tiga protein antioksidan menunjukkan ekspresi maksimum pada 1.5 µM kepekatan Ectoine. Kemudian, kesan pra-rawatan Ectoine telah diuji pada ungkapan nisbah Nrf2 dan Keap-1 dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Analisis data Barat menunjukkan bahawa pra-rawatan dengan 1.5 µM Ectoine menunjukkan peningkatan dalam nisbah Nrf2/Keap-1 dalam sel HaCaT yang disinari UVA (Rajah 5C). Kami juga melihat data yang konsisten dengan peningkatan ekspresi NQO Protein -1, HO-1 dan -GCLC dalam sel HaCaT pra-rawatan Ectoine yang disinari dengan 3 J/cm2 UVA (Rajah 5D). Data ini menyimpulkan bahawa pra-rawatan Ectoine memainkan peranan perlindungan dalam sel HaCaT yang disinari UVA.

3.5. Pelbagai Laluan Isyarat Terlibat dalam Pengaktifan Nrf2 dalam Sel HaCaT yang Dirawat Ectoine

Kami menentukan laluan isyarat yang terlibat dalam translokasi nuklear pengantara Ectoine Nrf2. Sel HaCaT telah dirawat terlebih dahulu dengan perencat farmakologi PI3K / AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS, dan laluan isyarat CKII, diikuti oleh 1.5 μM Ectoine. Data blot barat Nrf2 nuklear menunjukkan bahawa laluan p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC, dan CKII terlibat dalam mekanisme ini (Rajah 6A). Daripada maklumat yang diperoleh, kami juga menentukan kesan pra-rawatan Ectoine terhadap peranan yang dimainkan oleh laluan ini dalam ekspresi protein antioksidan. Rajah 6B menunjukkan bahawa perencatan farmakologi laluan MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII, dan PKC merendahkan ekspresi NQO-1, HO-1 dan -GCLCantioksidanprotein dalam sel HaCaT. Selain itu, masa yang diambil untuk fosforilasi AKT, p38, dan ungkapan PKC dan CKII semasa terdedah kepada Ectoine menunjukkan bahawa, kecuali p-AKT, fosforilasi p38 dan ungkapan PKC dan CKII berlaku pada kemudiannya. mata masa sahaja (selepas 30 min) (Rajah 6C). Dalam kes AKT, fosforilasi diperhatikan dari titik masa 15 minit yang telah mencapai puncak pada 30 minit (Rajah 6C). Dalam kes AKT, fosforilasi diperhatikan dari titik masa 15 minit yang telah mencapai puncak pada 30 minit (Rajah 6C). Keputusan kumulatif ini mencadangkan bahawa laluan isyarat p38, AKT, PKC, dan CKII mengaktifkan translokasi nuklear pengantara Ektoin Antioksidan Nrf2 yang membawa kepada ekspresi protein antioksidan.

3.6. Kesan Anti-Melanogenik Pengantaraan Ectoine telah Ditindas disebabkan oleh Knockdown Nrf2

Peranan Nrf2 dalam anti-pengantara Ectoinemelanogenesisditentukan dengan menyenyapkan Nrf2 dalam sel HaCaT. Data daripada Western blot menunjukkan bahawa sel knockdown Nrf2 yang terdedah kepada 1.5 μM Ectoine menunjukkan ekspresi minimum NQO-1, HO-1 dan -GCLCantioksidanprotein (Rajah 7A). Kemudian, kami menguji kesan knockdown Nrf2 pada ekspresi tahap -MSH dalam sel HaCaT yang disinari UVA (3 J/cm2). Keputusan Western blot menunjukkan bahawa untuk mengawal sel yang ditransfeksi siRNA, penyinaran UVA adalah penting dalam penyelarasan ekspresi tahap -MSH dalam sel yang tidak terdedah kepada Ectoine (Rajah 7B). Walau bagaimanapun, 1.5 μM Ectoine telah menyekat kesan ini. Untuk kes lain, sel yang ditransfeksi dengan siNrf2 menunjukkan penurunan dalam ekspresi tahap -MSH dalam kedua-dua sel yang tidak dirawat dan dirawat (Rajah 7B). Sama seperti data -MSH, data pendarfluor kami juga menunjukkan bahawa penyinaran UVA secara signifikan mengimbangi pengeluaran ROS dalam sel siRNA kawalan Ectoine yang tidak dirawat (Rajah 7C, D). Walau bagaimanapun, kesan ini ditindas dengan ketara apabila sel terdedah kepada 1.5 µM Ectoine. Sebaliknya, sel HaCaT yang ditransfeksi Nrf2 dan disinari UVA menunjukkan peningkatan lebih kurang 8-kali ganda dalam tahap ROS berbanding dengan sel yang ditransmisikan Nrf2 yang tidak disinari dengan UVA tetapi terdedah kepada rawatan Ectoine (Rajah 7C, D). Semua data ini menandakan peranan perlindungan pengantara Ectoine yang dimainkan oleh Nrf2 dalam meminimumkan pengeluaran melanin dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Antioksidan 2020, 9, x UNTUK SEMAKAN RAKAN SEBAYA 11 daripada 15 disinari dengan UVA tetapi terdedah kepada rawatan Ectoine (Rajah 7C, D) . Semua data ini menandakan peranan perlindungan pengantara Ectoine yang dimainkan oleh Nrf2 dalam meminimumkan pengeluaran melanin dalam sel HaCaT yang disinari UVA.

khasiat cistanche: memutihkan kulit

4. Perbincangan

Pelbagai kulit-pemutihanejen digunakan dalam industri kosmetik. Kebanyakan agen ini berasal dari bahan kimia dan mengalami batasan yang menyebabkan pelbagai kesan sampingan termasuk kanser [24-26]. Oleh itu, pengenalpastian agen pemutih kulit yang selamat dan semulajadi mewakili keperluan semasa. Ectoine (Rajah 1A) telah diketahui digunakan sebagai bahan aktif dalam krim muka dan ejen kosmetik lain. Ini bertindak sebagai agen pelembap kulit dan juga dianggap melambatkan penuaan kulit pramatang juga [27]. Hampir semua agen pemutih kulit yang diketahui menyasarkan downregulationoftyrosinaseaktiviti enzim dalam sel yang disinari UV yang mengurangkanmelanogenesisdalam sel kulit.Yao et al. menunjukkanpemutihansifat-sifat Ectoine terbiosintesis dan mencadangkan bahawa ia adalah agen pemutihan aputatif. Dalam kajian mereka, mereka menguji kepekatan tinggi (500 µM) Ectoine untuk kesan pemutihannya pada melanoma tikus (B16F0) dan garisan sel melanoma manusia (A2058) dan membuat kesimpulan bahawa Ectoine adalah selamat dan agen berpotensi untuk aplikasi kosmetik dan klinikal [20]. Walau bagaimanapun, dalam kajian ini, kami selanjutnya menguji kesan berfaedah kepekatan rendah Ectoine (0.5–1.5 µM) pada sel HaCaT yang disinari UV dan mekanisme molekul asas telah ditafsirkan. Dalam kajian kami, telah ditunjukkan bahawa Ectoine, melalui laluan Nrf2/ARE, bukan sahaja telah mendorong ekspresi ekspresi gen antioksidan tetapi juga menurunkan tahap -MSH dalam sel HaCaT yang disinari UVA melalui penindasan POMC. Penurunan paras -MSH dikaitkan dengan penurunan regulasi aktiviti enzim tirosinase yang membawa kepada penurunan pengeluaran melanin. Dari pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama yang dibuktikan oleh mekanisme yang ditimbulkan oleh Ectoine dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Kajian ini menggariskan mekanisme molekul yang dipamerkan oleh Ectoine dalam sel HaCaT sebagai sistem model selular.

Kami mula-mula menentukan kepekatan sub-maut Ectoine serta kesan sinaran UVA terhadap daya maju sel HaCaT. Data MTT kami menunjukkan bahawa kepekatan rendah Ectoine (0.5–1.5 µM) tidak mempunyai kesan ketara ke atas daya maju sel HaCaT (Rajah 1B). Pra-rawatan ektoin meningkatkan daya maju 3 J/cm2 sel HaCaT yang disinari UVA (Rajah 1B). Berdasarkan pemerhatian ini, kami meneruskan eksperimen selanjutnya menggunakan 1.5 µM pra-rawatan Ectoine dan penyinaran UVA pada dos 3 J/cm2.

Pengeluaran ROS yang disebabkan oleh penyinaran UVA dalam keratinosit kulit adalah fakta yang terkenal [28]. Oleh itu, kami juga menguji untuk sebarang kesan berfaedah daripada pra-rawatan Ectoine dalam pengeluaran ROS yang disebabkan oleh sinaran UVA dalam sel HaCaT. Data keamatan DCF-pendarfluor kami menunjukkan bahawa pra-rawatan dengan 1.5 µM Ectoine secara signifikan menurunkan kawal selia inkeratinosit pengeluaran ROS yang disebabkan oleh sinaran UVA. Ia juga dapat diperhatikan bahawa 1.5 µM Ectoine boleh menyebabkan peningkatan tahap basal dalam paras ROS dalam sel HaCaT yang ditunjukkan secara statistik (Rajah 1D, E).

Rousseau et al. melaporkan bahawa POMC dirembeskan oleh keratinosit epidermis manusia dan melanosit dan telah merangsangmelanogenesis[29]. Dengan mengekalkan pandangan ini, kami juga menguji kesan penyinaran UVA dan pra-rawatan Ectoine pada protein yang berkaitan dengan melanogenesis dalam sel HaCaT. Data Western blot kami menunjukkan penurunan regulasi bergantung dos bagi ekspresi protein -MSH dan POMC dalam sel HaCaT yang disinari UVA disebabkan oleh prarawatan oleh Ectoine. Sebaliknya, pra-rawatan Ectoine mempunyai kesan pembezaan pada corak ekspresimelanogenesis-protein yang berkaitan. Terutama, hampir semua protein yang diuji (Tirosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinase, CREB dan MITF) menunjukkan penurunan ekspresi dengan peningkatan kepekatan rawatan Ectoinepre dalam sel HaCaT yang disinari UVA (Rajah 2A, B). Data ini menandakan fakta bahawa Ectoine memiliki sifat anti-melanogenik dalam sel HaCaT yang disinari UVA.

Keberkesanan anti-melanogenik Ectoine telah diuji selanjutnya dalam sel B16F10, garis sel melanoma yang terkenal digunakan dalammelanogenesiskajian [30]. Salah satu pemerhatian yang ketara dalam kajian kami ialah, berbeza dengan sel HaCaT, kepekatan tinggi Ectoine (100-400 µM) diperlukan untuk menyekat sintesis melanin dalam sel B16F10 yang dirangsang -MSH (Rajah 3B). Blotdata Barat kami menunjukkan bahawa dos Ectoine yang bergantung kepada mengecilkan ungkapantyrosinasedan p-CREBprotein dalam sel B16F10 yang dirangsang -MSH, yang membawa kepada kesan yang disebutkan di atas (Rajah 3C). Oleh itu, kami juga menguji jika kepekatan tinggi Ectoine ini boleh menjejaskan daya maju sel B16F10. Keputusan MTT kami menunjukkan bahawa kepekatan tinggi Ectoine (100-400 µM) tidak mempunyai kesan ke atas daya maju sel B16F10 (Rajah 3A). Keputusan ini menandakan bahawa keratinosit memainkan peranan penting dalam Ectoine-mediatedanti-melanogenesisdan kesan depigmentasi.

Peranan faktor transkripsi Nrf2 dalam metabolisme sel kulit telah didokumenkan dengan baik [31]. Oleh itu, kami menguji lagi mekanisme yang dimainkan oleh laluan Nrf2/Keap-1 dalam kesan pengantaraan Ectoine dalam keratinosit. Rajah 4A menunjukkan bahawa bergantung kepada dos Ectoine dan meningkat dengan ketara nisbahNrf2/Keap-1 dengan kesan maksimum diperhatikan pada kepekatan Ectoine 1.5 µM. Ia juga diperhatikan bahawa 1.5 µM Ectoine menyukai translokasi nuklear protein Nrf2 dengan ekspresi maksimum Nrf2 daripada pecahan protein nuklear yang diperhatikan pada titik masa 2 jam (Rajah 4B). Data yang diperoleh daripada pewarnaan imunofluoresensi sel HaCaT juga telah menyokong kesan ini. (Rajah 4D).

Dalam melanosit dan keratinosit manusia, Marrot et al. dan yang lain telah menjelaskan kepentingan laluan pertahanan Nrf2 dalam tindak balas tekanan foto-oksidatif [32]. Kami juga mengkaji kesan ekspresi protein antioksidan Ectoinemediated dalam sel HaCaT. Data lengkung masa kami menunjukkan bahawa ekspresi Ectoinemediated bagi ketiga-tiga protein anti-oksidan (H O-1, NQO-1, -GCLC), dan Nrf2 ditunjukkan untuk menyatakan dalam cara dwifasa dengan masa yang semakin meningkat ({{ 8}}.5–12 h) dengan kesan yang boleh diperhatikan dicatatkan pada titik masa 4 jam (Rajah 5A). Daripada ini, keluk kepekatan yang mengukur kesan Ectoineconcentration padaantioksidanekspresi protein juga ditentukan pada titik masa 4j. Rajah 5B menunjukkan bahawa berbanding dengan sel yang tidak dirawat, rawatan Ectoine mempunyai peningkatan bergantung dos pada ekspresi protein HO-1, NQO-1, -GCLC. Kami juga mengukur bagaimana kepekatan Ectoine mempamerkan kesan perlindungan dalam sel HaCaT yang terdedah kepada sinaran UVA. Data Western blot menunjukkan bahawa bergantung kepada dos Ectoine meningkatkan ekspresi protein anti-oksidan dengan regulasi dramatik dalam nisbah Nrf2/Keap-1 juga (Rajah 5C, D). Keputusan ini menunjukkan bahawa Ectoinepretreatment (1.5 µM, 4 h) mempunyai kesan berpotensi untuk mendorong ekspresi protein antioksidan dalam HaCaTcells yang boleh mengatasi kesan buruk yang ditimbulkan oleh pendedahan UVA.

cistanche antioksidan

5. Kesimpulan

Daripada data di atas, kami membuat kesimpulan bahawa kepekatan rendah Ectoine (0.5–1.5 µM) boleh mengurangkan -MSH dan pengeluaran melanin melalui penindasan POMC dantyrosinaselaluan dalam sel HaCaT yang disinari UVA, menunjukkan anti-melanogenesiskeberkesanan. Selain itu, Ectoine juga terlibat dalam penindasan pengeluaran ROS intraselular dalam sel HaCaT. Tidak seperti sel HaCaT, kepekatan tinggi Ectoine (50–400 µM) dapat menunjukkan kesan yang sama dalam sel melanoma B16F10 yang menandakan fakta bahawa keratinosit boleh memainkan peranan penting dalam pengantaraan Ectoine anti-melanogenesisdan kulit-pemutihankesan dalam sel kulit. Paling penting, Ectoine memediasi kesan berfaedah melalui pengaktifan laluan Nrf2, yang mendorong ekspresiantioksidanprotein HO-1, NQO-1 dan -GCLC. AKT ditunjukkan sebagai laluan isyarat pertama yang memulakan pengaktifan Nrf2 diikuti oleh laluan lain (p38, PKC, dan CKII). Akhirnya, pembungkaman Nrf2 secara langsung memberikan bukti bahawa Nrf2 memainkan peranan penting dalam pengawalan ROS intraselular serta pengeluaran -MSH. Kami menyimpulkan bahawa mekanisme pemutihan utama Ectoine harus disebab oleh perencatan laluan ROS-p53/POMC- -MSH dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Oleh itu, Ectoine atau derivatifnya boleh menjadi bahan aktif dalam pelembap dan losyen yang digunakan sebagai kulit berpotensi dan berasaskan semula jadipemutihanagen dalam industri kosmetik.

suplemen cistanche antioksidan