Program Fibrogenesis Renal Dikawal Oleh MikroRNA yang Mengawal Metabolisme Oksidatif
Mar 29, 2022
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob , Diego Rodríguez-Puyolc ,d
Santiago Lamesa,**
a Program of Physiological and Pathological Processes, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Sepanyol
b Kemudahan Genomik, Parque Científico de Madrid, Madrid, Sepanyol
c Jabatan Patologi, Hospital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Sepanyol
d Jabatan Perubatan dan Kepakaran Perubatan, Yayasan Penyelidikan Hospital Universiti "Príncipe de Asturias," IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Sepanyol
Kata kunci: MicroRNAS, Fibrosis buah pinggang, Pengoksidaan asid lemak, matriks ekstraselular, CPT1A, Mitokondria
bina badan cistanche sangat baik untuk fungsi buah pinggang
A B S T R A C T
Pengumpulan matriks ekstraselular (ECM) yang berlebihan adalah ciri penyakit fibrotik. Di buah pinggang, ia adalah laluan biasa terakhir penyakit lazim, yang membawa kepada kegagalan buah pinggang kronik. Walaupun sitokin seperti TGF- memainkan peranan asas dalam transformasi myofibroblast, kerja baru-baru ini telah menunjukkan bahawa disfungsi mitokondria dan pengoksidaan asid lemak yang rosak (FAO), yang menjejaskan sumber tenaga utama untuk sel epitelium tubular renal, telah dicadangkan untuk menjadi penyumbang asas. kepada perkembangan dan perkembangan fibrosis buah pinggang. MicroRNAs (miRNAs), yang mengawal ekspresi gen selepas transkripsi, telah dilaporkan untuk mengawal fibrogenesis buah pinggang. Untuk mengenal pasti miRNA yang terlibat dalam gangguan metabolik fibrosis buah pinggang, kami melakukan skrin tatasusunan miRNA dalam model tetikus halangan ureter unilateral (UUO). MiR-150-5p dan miR-495-3p dipilih untuk pautannya kepada patologi manusia, peranannya dalam metabolisme mitokondria dan penyasarannya terhadap enzim pengangkut asid lemak CPT1A. Kami menemui peningkatan 2- dan 4-kali ganda bagi miR-150-5p dan miR-495-5p, masing-masing, dalam model UUO dan nefropati (FAN) yang disebabkan oleh asid folik , manakala TGF- 1 mengawal selia ekspresinya dalam garisan sel epitelium tiub renal manusia HKC-8. MiRNA ini bersinergi dengan TGF- berkaitan kesan pro-fibrotiknya dengan mempertingkatkan penanda berkaitan fibrosis Acta2, Col1 1 dan Fn1. Kajian biotenaga menunjukkan pengurangan kadar penggunaan oksigen (OCR) berkaitan FAO dalam sel HKC-8 dengan kehadiran kedua-dua miRNA. Secara konsisten, tahap ekspresi gen sasaran berkaitan mitokondria mereka CPT1A, PGC1, dan faktor transkripsi mitokondria A (TFAM), dikurangkan sebanyak separuh dalam sel epitelium buah pinggang yang terdedah kepada miRNA ini. Sebaliknya, kami tidak mengesan perubahan dalam jisim mitokondria dan potensi transmembran (ΔѰm) atau pengeluaran anion radikal superoksida mitokondria. Data kami menyokong bahawa miR-150 dan miR- 495 mungkin menyumbang kepada fibrogenesis buah pinggang dengan memburukkan lagi kegagalan metabolik yang terlibat secara kritikal dalam sel epitelium tiub, yang akhirnya membawa kepada fibrosis.
1. Pengenalan
Penyakit buah pinggang kronik (CKD) adalah keadaan klinikal di mana pengurangan fungsi buah pinggang dikekalkan. Ia biasanya dianggap tidak dapat dipulihkan dan progresif. Ia mewakili masalah kesihatan awam yang penting yang boleh menjejaskan 12-14 peratus daripada populasi umum [1]. Ia mungkin terdapat dalam kira-kira 30-40 peratus pesakit dengan patologi yang sangat lazim seperti diabetes mellitus dan hipertensi, di mana ia menyumbang kepada menentukan evolusi dan prognosis. Tanpa mengira etiologi penyakit, perkembangan CKD membawa kepada fibrosis tubul-interstitial dan glomerular [2]. Fibrosis tubulo-interstitial melibatkan pengembangan ruang antara membran bawah tanah tiub dan kapilari peritubular melalui pemendapan protein matriks (ECM) (terutamanya jenis kolagen I dan III dan fibronektin) yang dikaitkan dengan sel-sel radang, kehilangan sel tiub, dan pengumpulan myofibroblast. [3].
Faktor pertumbuhan mengubah- (TGF-) dianggap sebagai sitokin pro-fibrotik yang penting di mana-mana dan pengawal selia utama pembezaan myofibroblast dalam fibrosis [4]. Kajian terbaru telah menunjukkan bahawa kecacatan global dalam pengoksidaan asid lemak (FAO), yang membawa kepada kompromi dalam sumber tenaga utama untuk sel epitelium tiub, memainkan peranan penting dalam perkembangan fibrosis buah pinggang [5,6]. TGF- menindas FAO dalam cara yang bergantung kepada SMAD3-dan PGC1A, justeru menjejaskan pengawal selia transkrip pengambilan dan pengoksidaan asid lemak, termasuk CPT1A [5]. Perubahan dalam FAO akhirnya mengakibatkan pengumpulan lipid intraselular dan pengurangan ATP, yang membawa kepada fibrosis [5,7]. Oleh itu, strategi yang bertujuan untuk memulihkan gangguan metabolik yang beroperasi dalam CKD boleh memberikan pilihan terapeutik [8].
MicroRNAs (miRNAs) telah muncul sebagai pengawal selia kritikal ekspresi gen melalui tindakan mereka terhadap peraturan posttranskrip. Dalam buah pinggang, miR telah ditunjukkan memainkan peranan penting dalam nefrogenesis, homeostasis, dan penyakit [9]. MiRNA juga mampu mengawal proses fibrotik dan telah dipanggil "fibrosis" [10]. Di samping itu, disebabkan kekurangan terapi yang berkesan untuk mencegah atau memulihkan fibrogenesis buah pinggang [11], manipulasi ekspresi miRNA oleh penghantaran in vivo miRNA mimik atau perencat telah dicadangkan sebagai strategi terapeutik yang menjanjikan untuk CKD [12]. Di samping itu, miRNA yang beredar boleh membentuk biomarker diagnostik dan juga prognostik [13].
Kawalan fibrosis buah pinggang yang dimediasi MiRNA terutamanya berlaku melalui pengawalan isyarat TGF- 1 dalam cara yang bergantung kepada sel dan bergantung kepada konteks, menggunakan laluan Smad sebagai salah satu sasaran utama [14]. Dalam kerja sebelumnya, kami telah mengenal pasti beberapa miRNA yang mempunyai kesan ke atas fibrosis buah pinggang dengan mengawal selia laluan metabolik tertentu [15,16]. Ekspresi berlebihan miR-9-5p menghalang pembezaan sel renal epitelium tiub dan memprogram semula gangguan metabolik berkaitan fibrosis [16], manakala kehilangan fungsi miR-33, sama ada genetik atau farmakologi, mengakibatkan peningkatan FAO dan pencegahan pengumpulan lipid dalam sel epitelium tiub. Ini dikaitkan dengan peningkatan bekalan tenaga, bioenergetik mitokondria yang lebih baik, dan pencegahan fibrosis buah pinggang eksperimen [15]. Oleh itu, miRNA yang mengawal bioenergetik selular juga mampu mengawal fibrogenesis buah pinggang. Dalam kajian ini, kami telah menggunakan strategi berasaskan tatasusunan miRNA dalam model kecederaan buah pinggang kronik halangan ureter unilateral (UUO) untuk mengenal pasti miRNA yang terlibat dalam fenotip fibrotik buah pinggang melalui pengubahsuaian laluan metabolik. Dengan memilih beberapa gen berkaitan fungsi mitokondria (CPT1A, TFAM, PGC1A), kami mengenal pasti kedua-dua miR-150 dan miR-495 sebagai miRNA yang mampu mengurangkan kadar penggunaan oksigen (OCR) berkaitan FAO dan mempromosikan TGF{ {21}}transformasi fibrogenik teraruh dalam saluran sel epitelium tiub renal manusia HKC-8. Penemuan kami menyerlahkan kepentingan miRNA sebagai pengawal selia metabolik mitokondria yang terlibat dalam fibrogenesis buah pinggang.
2. Bahan dan kaedah
Garis sel dan keadaan kultur. Sel epitelium tiub proksimal renal manusia (HKC-8) telah dibiakkan dalam DMEM/F12 (medium Eagle's ubah suai Dulbecco 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) ditambah dengan 15 mM HEPES, 5 peratus (vol/vol) serum lembu janin (FBS)
(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml hidrokortison (Sigma, St. Louis, MO), 50 unit/ mL penisilin dan 50 ug/mL streptomycin (Gibco, Rockville, MD) pada 37◦ C dan 5 peratus CO2. Talian sel ini telah disediakan oleh makmal Dr. Susztak (Philadelphia, Pennsylvania, Amerika Syarikat). Rawatan dengan rekombinan manusia 10 ng/ml TGF- 1 (Sistem R&D, Minneapolis, MN) dilakukan selepas kebuluran sel HKC-8 tanpa serum selama 12 jam.
Prosedur pemindahan. Sel telah disemai ke dalam hidangan kultur 60 mm untuk mencapai pertemuan 70 peratus . Mereka telah ditransfeksi dengan 40 nM sama ada mirVana™ miRNA mimik miR-150, miR-495 atau mirVana™ miRNA mimik kawalan (syarikat Ambion, USA) menggunakan lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Sel telah diinkubasi dengan lipofectamine-pre-miRNA 37 ◦ C selama 6 jam. Selepas itu, 5 ml medium segar yang mengandungi 10 peratus FBS telah ditambah kepada hidangan kultur, dan sel-sel tersebut dikekalkan dalam kultur selama 6 jam sehingga digunakan untuk eksperimen seterusnya. Dalam kes gabungan dengan rawatan TGF{13}}, ia digunakan pada sel selepas ekspresi berlebihan miRNA mengikut bahagian sebelumnya.
Immunoblot. Sel telah dibasuh dalam PBS, dihomogenkan dan dilisekan dalam 100 μL penimbal lisis RIPA yang mengandungi 150 mM NaCl, 0.1 peratus SDS, 1 peratus natrium deoksikolat, 1 peratus NP-40 dan 25 mM Tris– HCl pH 7.6, dengan kehadiran protease (Lengkap, Diagnostik Roche, Mannheim, Jerman) dan perencat fosfatase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dan dituai dengan mengikis. Seperempat keping setiap sampel buah pinggang (diperolehi selepas pembedahan separuh kedua-dua memanjang dan melintang) dihomogenkan dalam penimbal 300 ul RIPA dengan manik keluli tahan karat 5 mm (Qiagen, Valencia, CA) menggunakan TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) bergetar pada 50 Hz selama 15 minit pada 4 ◦ C. Sampel telah dijelaskan dengan sentrifugasi pada 10,000 g selama 15 minit pada 4 ◦ C. Pelet kemudiannya dibuang, dan supernatan disimpan sebagai lisat protein. Kepekatan protein ditentukan oleh Kit Ujian Protein BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL) dan diukur dalam Sistem Pengesanan Berbilang Glomax® (Promega, Madison, WI). Jumlah protein yang sama (10–50 ug) daripada jumlah ekstrak telah diasingkan pada 8–10 peratus gel SDS–polyacrylamide dan dipindahkan ke membran blotting nitrocellulose (GE Healthcare, Chicago, IL) pada 12 V selama 20 minit dalam separa kering Sistem Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Hercules, California).
Membran disekat melalui pengeraman selama 1 jam dengan 5 peratus susu tanpa lemak dalam PBS yang mengandungi 0.5 peratus Tween-20 dan dipadamkan semalaman dengan antibodi khusus: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C semalaman), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C semalaman), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 jam, suhu bilik ). Selepas inkubasi dengan antibodi sekunder IRDye 800 kambing anti-arnab dan IRDye 600 kambing anti-tikus (1:15,000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE), membran telah diimej dalam tiga kali ganda dengan Sistem Pengimejan Inframerah Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Densitometri jalur dilakukan menggunakan perisian ImageJ 1.48 (//rsb.info.nih.gov/ij) dan ekspresi protein relatif ditentukan dengan menormalkan kepada GAPDH. Perubahan lipatan telah dinormalkan kepada nilai keadaan kawalan.
Pengekstrakan RNA. Jumlah RNA telah diekstrak daripada sel HKC-8 atau buah pinggang tikus menggunakan Kit Mini miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA) mengikut arahan pengilang. Kuantiti dan kualiti RNA ditentukan pada 260 nm oleh spektrofotometer Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL).
Analisis ekspresi mRNA. Transkripsi terbalik (RT) telah dijalankan dengan 500 ng jumlah RNA menggunakan kit Sintesis cDNA iScript™ (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT–PCR dilakukan dengan iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), menggunakan 96-Telaga Bio-Rad CFX96 RT–PCR System dengan C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) mengikut arahan pengilang. Nilai Ct diperoleh daripada setiap lengkung amplifikasi menggunakan perisian analisis CFX96 yang disediakan oleh pengilang. Ekspresi mRNA relatif ditentukan menggunakan kaedah 2 - ΔΔCt [17]. Gen 18S digunakan untuk tujuan normalisasi. Urutan primer yang digunakan untuk pengkuantifikasian mRNA ialah: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGAATCGTGGACTCCT), COL1A1 (FW: CGGAATCGTGACCT, FW: CGGATCGGACCTG, FW: CGGATCGTCCTG, COL1A1 (FW: CGGATCGGGTCGGT), GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATCAA) , 18S (ATTCGGACTCGGT: ATCTAGCCATG, 18S (ATTCGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTCGCTGTCGTC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATCAA). Perubahan lipatan telah dinormalkan kepada nilai keadaan kawalan.
Kuantifikasi ekspresi miRNA. Kuantifikasi ekspresi miRNAs dilakukan menggunakan miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Maklum Balas, Denmark). Mengikuti RT, templat cDNA telah dikuatkan menggunakan primer LNA khusus mikroRNA untuk miR150-5p atau miR-495-3p matang (Exiqon, Maklum Balas, Denmark). qRT–PCR telah dilakukan dalam 96-Telaga Sistem PCR Masa Nyata Bio-Rad CFX96 dengan C1000 Thermal Cycler menggunakan iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) mengikut arahan pengeluar . Nilai Ct untuk telaga tiga kali ganda diperoleh daripada setiap lengkung amplifikasi menggunakan perisian CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Nilai Ct telah dinormalisasi kepada kawalan endogen 5S rRNA. Tahap miRNA plasma telah dinormalkan kepada miR-103a-5p. Ekspresi miRNA relatif ditentukan menggunakan kaedah 2 - ΔΔCt [17]. Perubahan lipatan telah dinormalkan kepada nilai keadaan kawalan.
Model tikus fibrosis buah pinggang. Tikus ditempatkan di kemudahan haiwan Bebas Patogen Khusus (SPF) di CBMSO mengikut peraturan EU untuk semua prosedur. Haiwan dikendalikan mengikut persetujuan dengan Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal yang terkandung dalam Arahan 2010/63/EU Parlimen Eropah. Kelulusan telah diberikan oleh lembaga semakan etika tempatan Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" di Madrid, jawatankuasa Etika di CSIC, dan Unit Kawal Selia untuk Prosedur Eksperimen Haiwan dari Comunidad de Madrid.
Halangan ureter unilateral (UUO): Prosedur pembedahan UUO telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [18]. Secara ringkas, tikus telah dibius dengan isoflurane (3-5 peratus untuk induksi dan 1-3 peratus untuk penyelenggaraan) dan dibahagikan kepada dua kumpulan eksperimen: kumpulan UUO dan kumpulan operasi palsu. Dalam kumpulan UUO, tikus dicukur di sebelah kiri perut, hirisan menegak dibuat melalui kulit dengan pisau bedah dan kulit ditarik balik. Senggatan kedua dibuat melalui peritoneum untuk mendedahkan buah pinggang. Ureter kiri diikat dua kali 15 mm di bawah pelvis buah pinggang dengan sutera pembedahan dan ureter kemudiannya terputus di antara kedua-dua ligatur. Kemudian, buah pinggang yang diikat diletakkan perlahan-lahan kembali ke kedudukan anatomi yang betul dan garam steril ditambah untuk menambah kehilangan cecair. Senggatan dijahit dan tikus dikurung secara individu. Operasi palsu dilakukan dengan cara yang sama tetapi tanpa pengikatan ureter. Buprenorphine digunakan sebagai analgesik. Dos pertama diberikan 30 min sebelum pembedahan dan kemudian setiap 12 jam selama 72 jam, pada dos 0.05 mg/kg secara subkutan. Dalam model ini, aliran darah buah pinggang dan kadar penapisan glomerular menjadi berkurangan dengan ketara dalam masa 24 jam dan keradangan interstisial (puncak pada 2-3 hari), pelebaran tiub, atrofi tiub dan fibrosis jelas selepas 7 hari. Buah pinggang yang tersumbat mencapai disfungsi maksimum sekitar 2 minggu selepas prosedur. Tikus telah dikorbankan oleh overdosis CO2 dan kawalan dan sampel buah pinggang dan darah yang terhalang telah dituai selepas perfusi dengan PBS pada 3, 5, 7, 10, dan 15 hari selepas UUO.
Nefropati akibat asid folik (FAN): Dalam model ini, fibrosis buah pinggang disebabkan oleh suntikan intraperitoneal (ip) dengan 25{3}} mg asid folik (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) setiap kg berat badan yang dilarutkan dalam 0.3 M natrium bikarbonat (kenderaan) seperti yang diterangkan sebelum ini [19]. Haiwan kawalan menerima 0.3 ml kenderaan (ip). Tikus telah dikorbankan oleh overdosis CO2 dan buah pinggang dan sampel darah dituai selepas perfusi dengan PBS selepas 15 hari pentadbiran FA.
pemprofilan mikroRNA. Untuk mengenal pasti miRNA khusus yang mengawal hasil fibrotik, susunan mikroRNA LNA miRCURY tersuai (Exiqon, Maklum Balas, Denmark) telah dipilih sebagai platform untuk pemprofilan mikroRNA. Platform ini terdiri daripada sejumlah 175 ujian unik khusus untuk miRNA tetikus yang terdapat dalam Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. UK). Bagi setiap mikroRNA, helai semasa telah dipilih untuk analisis. Pemilihan MiR adalah berdasarkan ramalan gen sasaran yang berkaitan dengan fibrosis buah pinggang, metabolisme mitokondria, proses redoks, dan irama sirkadian. Analisis ini dilakukan dengan alat bioinformatik untuk ramalan sasaran miRNA berasaskan jujukan, mikrokosmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) dan miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Selepas pengekstrakan RNA daripada sampel buah pinggang 7 hari-UUO, pecahan miRNA yang terdapat dalam 20 ng jumlah RNA tertakluk kepada transkripsi terbalik menggunakan Kit RT LNA miRCURY (Exiqon, Maklum Balas, Denmark) mengikut arahan pengilang. CDNA yang dihasilkan telah dianalisis dengan Panel PCR miRNA miRCURY dalam sistem PCR Masa Nyata Roche LightCycler 480 menggunakan miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Maklum Balas, Denmark). Setiap sampel dianalisis dalam pendua. Prosedur ini dilakukan di Kemudahan Genom di Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Sepanyol). Perisian LC480 telah digunakan untuk mendapatkan nilai Cq (Cq) bagi setiap miRNA. Nilai delta Ct (ΔCt) dikira dengan menormalkan nilai Ct kepada pengemasan endogen snRNAU6. Peta haba dijana dengan data PCR masa nyata yang dibentangkan sebagai ΔCt. Pengelompokan hierarki dibina mengikut nilai ΔCt. Nilai delta Ct (ΔΔCt) dikira dengan menolak ΔCt kumpulan sampel rujukan (buah pinggang kawalan) daripada ΔCt setiap sampel buah pinggang yang terhalang. Kuantifikasi relatif (RQ) atau perubahan lipatan setiap miRNA dijana menggunakan kaedah 2 - ΔΔCt [17]. MiRNA yang dinyatakan secara berbeza telah dikenal pasti oleh ujian Limma parametrik. Untuk mengambil kira ujian hipotesis berbilang, nilai-P telah dilaraskan (adj.) menggunakan pembetulan kadar penemuan palsu Benjamini-Hochberg (FDR) [25]. Keputusan telah digraf dalam plot gunung berapi.
analisis miRNA dalam plasma darah daripada pesakit CKD. Tahap miRNA terpilih telah dianalisis dalam sampel plasma daripada kohort 100 pesakit CKD, yang diperincikan di bawah. Darah vena periferal dikumpulkan dalam vacutainer bersalut semburan EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ). Untuk mendapatkan plasma, darah disentrifugasi pada 4{51}}0 g selama 20 minit, supernatan dipindahkan ke dalam tiub baru dan disentrifugasi pada 800 g selama 20 minit. Plasma dikumpulkan dan disimpan beku dalam aliquot pada − 80 ◦ C. Plasma miRNA diekstrak daripada darah menggunakan Kit Pengasingan RNA miRCURYTM—Biofluids dan UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Denmark). Analisis tahap miR-150 dalam sampel ini telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam kuantifikasi bahagian prosedur ekspresi miRNA. Pengukuran kadar penggunaan oksigen. Kadar penggunaan oksigen berkaitan pengoksidaan asid lemak (OCR) (terikat kepada fosforilasi oksidatif) dan kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) (dikaitkan dengan pengeluaran laktat dan glikolisis) telah dikaji menggunakan penganalisis metabolik Biosains Seahorse mengikut arahan pengeluar [26]. Sel HKC-8 telah disemai dalam plat p60 dan pemindahan mikroRNA dilakukan seperti yang diterangkan di atas apabila ia mencapai pertemuan 70 peratus 48 jam kemudian, sel HKC-8 dirawat dengan 10 ng/ml TGF{{ 18}} selama 48 jam. Kemudian, sel telah disemai pada 2 × 104 sel setiap telaga dalam mikroplat kultur sel Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Selepas pematuhan sel, medium pertumbuhan digantikan dengan medium terhad substrat, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ditambah dengan 0.5 mM Glukosa dan 1 mM Glutamat. Satu jam sebelum pengukuran ujian, sel telah diinkubasi dengan medium ujian Krebs-Henseleit Buffer (KHB) ditambah dengan 0.2 peratus karnitin pada 37 ◦ C tanpa CO2. Lima belas minit sebelum ujian, perencat CPT1 Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM telah ditambah ke telaga yang sepadan, dan sel telah diinkubasi pada 37 ◦ C tanpa CO2. Akhirnya, sejurus sebelum ujian, Substrat FAO BSA atau 200 μM Palmitate-BSA (Teknologi Agilent, Santa Clara, CA, Amerika Syarikat) telah ditambah. Serta-merta, Ujian Tekanan Mito Sel XF telah dilakukan dalam penganalisis tenaga Seahorse XFe24 dengan menambah beberapa modulator fungsi mitokondria secara berurutan. Pertama, oligomycin perencat sintase ATP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM) digunakan berikutan pengukuran basal. Ini mengurangkan aliran elektron melalui ETC, mengakibatkan pengurangan dalam respirasi mitokondria. Seterusnya, ejen pelepas gandingan sianida 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), yang meruntuhkan kecerunan proton dan mengganggu potensi membran mitokondria telah ditambah. Akibatnya, aliran elektron melalui ETC tidak dihalang, dan penggunaan oksigen oleh kompleks IV mencapai maksimumnya. Suntikan ketiga dan terakhir ialah campuran perencat kompleks III dan I anti-mycin/rotenone (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Gabungan ini menutup respirasi mitokondria dan membolehkan pengiraan respirasi bukan mitokondria yang didorong oleh proses di luar mitokondria. Substrat/perencat disediakan dalam medium yang sama di mana eksperimen dijalankan dan disuntik dari port reagen secara automatik pada masa yang dinyatakan. Pengukuran telah didaftarkan untuk 3-tempoh masa min (sepanjang tempoh 2 jam) dan nilai telah dinormalkan untuk jumlah kandungan protein. Protein diekstrak daripada telaga dengan 0.1 peratus larutan NP-40-PBS dan dikira dengan ujian protein BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Empat telaga digunakan untuk setiap kumpulan eksperimen. Ujian Tekanan Mito Sel XFp kuda laut telah digunakan untuk menentukan parameter utama fungsi mitokondria: respirasi mitokondria basal, respirasi berkait ATP, kebocoran proton (penggunaan oksigen bukan berkait ATP), respirasi maksimum, respirasi bukan mitokondria. , dan rizab kapasiti pernafasan, seperti yang diterangkan sebelum ini [27].
Ujian Luciferase. Untuk mencirikan tapak pengikatan calon miRNA-150 dan miRNA-495 dalam CPT1A 3′-UTR manusia, ujian reporter luciferase yang mengandungi CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347) telah digunakan. Mutasi terarah tapak di kawasan benih tapak miR-150 dan miR{12}} yang diramalkan dalam 3′ - UTR dijana dengan menggunakan kit mutagenesis terarah Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) mengikut kepada protokol pengeluar. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGCCCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Semua binaan telah disusun sebelum digunakan untuk mengesahkan ia adalah struktur yang betul. Sel HKC-8 telah disemai dalam plat telaga ap24-dan ditransfeksi bersama secara sementara dengan 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (binaan utuh atau bermutasi) dan 4 ng pGL3-Promoter (luciferase kelip-kelip di bawah kawalan promoter SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) plasmid wartawan dan 40 nM sama ada mirVana™ miRNA mimik miR-150, miR -495 atau mirVana™ miRNA meniru kawalan negatif (syarikat Ambion, USA) menggunakan lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) apabila mereka mencapai pertemuan 70 peratus seperti yang diterangkan di atas. Empat telaga digunakan untuk setiap kumpulan eksperimen. Ujian Luciferase dilakukan 24 jam kemudian menggunakan sistem wartawan Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI). Isyarat luciferase vanila dan kunang-kunang dikesan menggunakan sistem pengesanan berbilang Glomax (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Aktiviti renilla luciferase telah dinormalkan oleh aktiviti luciferase kelip-kelip.
Keupayaan membran mitokondria (MMP). Perubahan dalam MMP ditentukan sebagai perbezaan dalam pendarfluor tetramethylrhodamine metil ester (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). Ia terkumpul dalam mitokondria terkutub bercas negatif dan pendarfluor dalam oren. Apabila potensi membran mitokondria runtuh dalam sel apoptosis atau tertekan secara metabolik, reagen TMRM tersebar di seluruh sitosol sel dan tahap pendarfluor menurun secara mendadak. Sel HKC-8 telah dikultur dan ditransfeksi seperti yang diterangkan dalam bahagian kultur sel dan prosedur pemindahan. Seterusnya, medium pertumbuhan digantikan dengan Penyelesaian Garam Seimbang Hank (HBSS) bebas fenol merah dengan 10 mM Hepes. Rawatan dengan oligomycin (5 μM) dan FCCP (4 μM) selama 5 minit digunakan sebagai keadaan kawalan positif dan negatif. Seterusnya, sel telah diwarnai dengan 250 nM TMRM selama 30 minit pada 37 ◦ C. Sel dituai dengan trypsin, disentrifugasi (3000 rpm, 5 min) dan pelet digantung semula dalam 200 μL HBSS dengan 1 peratus Bovine Serum Albumin (BSA) dan 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Keamatan pendarfluor diukur dengan sitometri aliran menggunakan panjang gelombang pelepasan 570 nm untuk TMRM (FL2) [28] dalam sistem BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) dan dianalisis dengan perisian FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland). , ATAU). Bagi setiap keadaan eksperimen, sekurang-kurangnya 20,000 singlet dianalisis dalam tiga kali ganda.
Pengeluaran anion radikal superoksida mitokondria. Penilaian penghasilan anion radikal superoksida telah dilakukan dengan menggunakan penunjuk anion radikal superoksida Mito-SOX™ Red mitokondria (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat), pewarna fluorogenik yang sangat selektif untuk anion radikal superoksida mitokondria dalam sel hidup, menurut pengilang arahan. Sel HKC-8 telah dikultur dan ditransfeksi seperti yang diterangkan dalam bahagian kultur sel dan prosedur pemindahan. Seterusnya, medium pertumbuhan digantikan dengan Penyelesaian Garam Seimbang Hank (HBSS) bebas fenol merah dengan 10 mM Hepes. Rawatan dengan antimycin A (150 μM) dan karbonil sianida m-chlorophenylhydrazone (CCCP) (50 μM) selama 5 minit digunakan sebagai keadaan kawalan positif dan negatif. Seterusnya, sel telah diwarnai dengan 5 μM MitoSOX™ Red selama 30 minit pada 37 ◦ C. Sel telah dituai seperti yang diterangkan dalam bahagian potensi membran mitokondria. Keamatan pendarfluor diukur dengan sitometri aliran menggunakan panjang gelombang pelepasan 580 nm untuk MitoSOX™ Red (FL2) dalam sistem BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) dan dianalisis dengan perisian FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland, ATAU). Untuk setiap keadaan percubaan, sekurang-kurangnya 20,000 singlet dianalisis dalam rangkap tiga.
Pelabelan mitokondria. Penilaian kandungan mitokondria dilakukan dengan menggunakan MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), yang secara pasif meresap merentasi membran plasma dan terkumpul dalam mitokondria aktif tanpa mengira potensi membran mitokondria, mengikut arahan pengeluar. Sel HKC-8 telah dikultur dan ditransfeksi seperti yang diterangkan dalam bahagian kultur sel dan prosedur pemindahan. Seterusnya, medium pertumbuhan digantikan dengan Penyelesaian Garam Seimbang Hank (HBSS) bebas fenol merah dengan 10 mM Hepes. Sel telah diwarnai dengan 150 nM dengan FM hijau MitoTracker™ selama 30 minit pada 37 ◦ C. Untuk analisis sitometri aliran, sel telah dituai seperti yang diterangkan dalam bahagian potensi membran mitokondria. Keamatan pendarfluor diukur menggunakan panjang gelombang pancaran 516 nm untuk dengan FM hijau MitoTracker™ (FL1) dalam sistem BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) dan dianalisis dengan perisian FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC , Ashland, ATAU). Untuk setiap keadaan percubaan, sekurang-kurangnya 20,000 singlet dianalisis dalam tiga kali ganda. Untuk pengimejan pendarfluor, nukleus juga diwarnai dengan DAPI (Sigma, St. Louis, MO) selama 5 minit di RT. Sel hidup telah divisualisasikan oleh mikroskop konfokal Zeiss LSM 710 terbalik dengan Sel diperhatikan, objektif 63X/1.2 Air C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 dan dianalisis dengan perisian Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Jerman) .
Penentuan nombor salinan mitokondria. DNA genomik telah diekstrak daripada sel HKC-8 menggunakan Kit Darah & Tisu DNeasy (Qiagen, Valencia, CA) mengikut arahan pengilang. Kelimpahan mitokondria ditentukan dengan Kit Ujian Nombor Salinan DNA Mitokondria Manusia (Detroit R&D, Detroit, MI). Nombor salinan mtDNA relatif dibentangkan sebagai nisbah DNA mtDNA-kepada-nuklear.
Sampel pesakit CKD manusia. Satu kohort 100 pesakit CKD (peringkat 3-4) dari Hospital Principe de Asturias telah dipilih untuk analisis tahap plasma miRNA. Ia termasuk dua subkumpulan berbeza yang dikelaskan mengikut evolusi fungsi buah pinggang mereka berdasarkan penunjuk GFR MDRD [29] dalam tempoh 24 bulan: 50 pesakit menunjukkan kurang daripada 10 peratus daripadabuah pinggangkemerosotan fungsi manakala selebihnya telah mengalami sekurang-kurangnya 40 peratus pengurangan dalam fungsi buah pinggang atau telah memulakanbuah pinggangterapi gantian (dialisis). Kami juga mengukur tahap fibrosis dalambuah pinggangbiopsi daripada kohort berbeza daripada 26 pesakit dengan disfungsi rasuah berikutanbuah pinggangpemindahan dari Hospital Ramn y Cajal. Semua biopsi dinilai mengikut kriteria Banff 2007 [30].
Analisis statistik. Data dianalisis menggunakan ujian bukan parametrik kecuali yang ditunjukkan. Perbezaan antara dua kumpulan bebas telah diperiksa dengan ujian Mann-Whitney, manakala lebih daripada dua kumpulan dibandingkan dengan ujian Kruskall-Wallis. Nilai P sebanyak 0.05 atau kurang dianggap signifikan secara statistik (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0.001).="" data="" dianalisis="" menggunakan="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" data="" dilaporkan="" sebagai="" min="" ±="" ralat="" standard="" min="">
3. Keputusan
data ekspresi miRNA dalam fibrotik yang disebabkan oleh UUObuah pinggang. Untuk menguraikan sumbangan miRNA kepada peraturan metabolikbuah pinggangfibrogenesis, model UUO 7 hari telah dilakukan dalam tikus WT. RNA telah diasingkan daripada kawalan dan fibrotikbuah pinggangsampel dan profil ekspresi miRNA dianalisis dalam susunan mikroRNA tersuai. Pemilihan miRNA adalah berdasarkan potensi sasaran enzim utama yang terlibat dalam metabolisme mitokondria, proses redoks dan irama sirkadian selepas analisis "dalam siliko" (perincian lanjut dalam bahagian Kaedah). Peta haba mendedahkan corak ekspresi yang jelas berbeza dalam beberapa miRNA apabila membandingkan fibrotik dan kawalanbuah pinggangsampel (Rajah 1A). Analisis plot gunung berapi menunjukkan bahawa 73 daripada 175 miRNA dinyatakan secara berbeza, 17 ke atas dan 56 dikawal ke bawah, dalam sampel buah pinggang fibrotik berbanding dengan yang dikawal (Rajah 1B, Jadual Tambahan1). Antaranya, miRNA khusus yang boleh mengawal hasil fibrotik dalam buah pinggang melalui laluan metabolik telah dipilih. Untuk tujuan itu, analisis silico 3'UTR (wilayah tidak diterjemahkan) gen tertentu yang terlibat dalam fungsi metabolik dan mitokondria, CPT1A, TFAM, PGC1A telah dilakukan dengan tiga alat ramalan bebas (Targetscan, miRWalk dan miRanda). Kriteria pemilihan juga termasuk tahap ekspresi buah pinggang, kebaharuan sasaran, tahap pengetahuan tentang laluan metabolik dan kepentingan biologi. Pautan kepada patologi manusia, tahap ekspresi tisu buah pinggang, peranannya dalam metabolisme mitokondria dan potensi penyasaran enzim pengangkut asid lemak CPT1A menggalakkan kami memfokuskan pada tiga miRNA, miR-150-5p, miR-495-3p dan miR-33-5p, sebagai calon yang mampu mengawal selia perubahan metabolik yang berkaitan dengan fibrogenesis buah pinggang (Rajah 1C). Sebagai makluman, CPT1A 3′-UTR mengandungi satu tapak benih untuk miR-150 dan dua tapak benih untuk miR-495. Kami memerhatikan bahawa miR-150 dan miR-495 mengurangkan aktiviti ujian wartawan luciferase yang mengandungi CPT1A 3'-UTR masing-masing sebanyak ~15 peratus dan 25 peratus. Penurunan peraturan ini telah dimansuhkan sepenuhnya dalam kes mutasi titik (PM) dalam 3′-UTR CPT1A untuk tapak pengikatan miR-150 (PM2) dan sebahagiannya tidak hadir dalam kedua-dua tapak pengikatan miR-495 (PM1 dan PM3) (Tambahan Rajah 1A dan B). Data ini menunjukkan interaksi langsung CPT1A dengan miR-150 dan miR-495. MiR-33-5p telah menjadi objek kajian berasingan [15]. MiR-150-5p dan miR-495-3p telah dikawal selia dalam sampel buah pinggang fibrotik berbanding dengan kawalan, dengan perubahan kali ganda 3.69 (nilai-P: 0.012 ) dan 1.95 (nilai-P: 0.012), masing-masing.
MiR-150 dan miR-495 meningkatkan tindak balas profibrotik TGF dalam manusiabuah pinggangsel epitelium tiub. Tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (qRT–PCR) telah dilakukan untuk mengesahkan perubahan ekspresi miR-150-5p dan miR-495-3p yang telah dikenal pasti melalui pemprofilan ekspresi miRNA dalam UUObuah pinggangsampel (Rajah 2A dan B). Selain itu, kinetik ekspresi miR-150-5p dan miR- 495-3p dalam buah pinggang 3, 5, 7, 10 dan 15 hari selepas prosedur UUO dianalisis oleh qRT-PCR. Ekspresi miRNA ini telah dipertingkatkan dengan ketara sebanyak 2-kali ganda pada 5 hari selepas UUO dan kekal dinaikkan 15 hari selepas UUO (Rajah 2C dan D). Tahap ekspresi miRNA ini juga dinilai dalam model nefropati asid folik (FAN). Kami menjumpai 4- dan 2-kawal selia lipatan miR-495-3p dan miR-150-5p, masing-masing, dalam fibrotikbuah pinggangsampel daripada model FAN (Rajah 2E). TGF- 1, salah satu pengawal selia induk fibrogenesis, turut mendorong ekspresi miR-150 dan miR-495 dalam sel HKC-8 lebih daripada 2-kali ganda dan {{ 6}}lipatan, masing-masing, selepas 48 jam, menyokong peranan yang berpotensi untuk miRNA ini dalam peristiwa berkaitan isyarat TGF (Rajah 3A dan B). Untuk menilai sama ada miR-150 dan miR-495 terlibat dalam transformasi pro-fibrotik sel epitelium tiub oleh TGF- 1, garisan sel manusia HKC-8 telah ditransfeksi dengan miR -150-5p atau miR-495-3p dan dirawat dengan TGF- 1 untuk masa yang berbeza. Meningkatkan tahap miR-150-5p dan miR-495-3p dengan ketara meningkatkan ekspresi tahap mRNA- 1-terdorong TGF bagi penanda berkaitan fibrosis Acta2, Col1 1 dan Fn1 ( Rajah 3C dan D). Begitu juga, ekspresi berlebihan miR-150-5p atau miR-495-3p sangat mengurangkan CPT1A dan meningkatkan kelimpahan protein -SMA (Rajah 3E dan F). Data ini mencadangkan bahawa miRNA ini boleh mengambil bahagian dalam patogenesisbuah pinggangfibrosis dengan menggalakkan TGF- 1-penyahbezaan epitelium bergantung kepada sel tubular, serta dengan menjejaskan ekspresi enzim kritikal yang terlibat dalam FAO.
MiR-150 dan miR-495 mendorong perubahan bioenergetik mitokondria dan mengurangkan ekspresi gen yang terlibat dalam fungsi mitokondria yang penting. Untuk mendapatkan gambaran tentang akibat metabolik yang disebabkan oleh pentadbiran miR-150-5p atau miR-495-3p kami mengkaji profil bioenergetik manusiabuah pinggangsel epitelium tiub.
Rajah 1. data ekspresi miRNA dalam fibrosis yang disebabkan UUO. (A) Peta haba menunjukkan ekspresi miRNA relatif kontralateral dan terhalangbuah pinggangdaripada C57/BL6-J tikus tertakluk kepada prosedur UUO selama 7 hari (n=6). Bar skala berjulat dari hijau ke merah (ungkapan tinggi ke rendah) dan nombor mewakili nilai ΔCt. Di sebelah kiri ditunjukkan miRNA yang dipilih untuk kajian. ( B ) Analisis plot gunung berapi bagi miRNA termodulat UUO. Log1{13}} kuantifikasi relatif (RQ) dan negatif ( − ) log10 dilaraskan (adj.) P-nilai diplot pada paksi-x dan y. Setiap miRNA diwakili oleh satu titik. 73 daripada 175 miRNA menunjukkan ekspresi yang diubah dalam sampel berserabut (adj. P-nilai Lebih besar daripada atau sama dengan 0.05). MiRNA terpilih untuk analisis lanjut diserlahkan. (C) miR-150-5p dan miR-495-3p dipilih berdasarkan kuasanya untuk penyasaran dalam siliko gen CPT1A, TFAM dan PGC1A. Bagi setiap mikroRNA terpilih, tapak sasaran benih yang dipelihara dalam 3'UTR gen ini, perubahan lipatan dan kepentingannya (nilai P adj.) ditunjukkan.
Rajah 2. Tahap ungkapan miR-150-5p dan miR-495-5p dalambuah pinggangdaripada model UUO dan FAN. (A, B) analisis qRT-PCR bagi ungkapan miR-150-5p (A) dan miR-495- 3p (B) dalambuah pinggangdaripada tikus 7 hari selepas UUO dalam sampel yang dianalisis sebelum ini dengan susunan mikroRNA. (C–E) analisis qRT-PCR bagi ekspresi miR-150-5p dan miR-495-3p selepas model FAN (C) dan 3, 5, 7, 10 dan 15 hari selepas UUO untuk miR-150-5p (D) dan miR{{10}}p (E). Graf bar mewakili min tahap ekspresi perubahan lipatan ± sem daripada 6 (A, B, E) dan 3 (C dan D) tikus setiap kumpulan. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" berbanding="" dengan="" keadaan="" kawalan="" yang="" sepadan;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01 berbanding="">buah pinggangdaripada tikus dengan rawatan eksperimen yang sama.
TGF- 1 digunakan sebagai sitokin model yang terlibat dalam perubahan berkaitan pro-fibrotik. Untuk menentukan status bioenergetik sel-sel ini, kadar penggunaan oksigen (OCR) berkaitan FAO dan kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) sel HKC-8 diukur semasa rawatan berurutan dengan sebatian yang memodulasi aktiviti mitokondria dengan kehadiran palmitat. , menggunakan Penganalisis Fluks Ekstraselular Seahorse XF24 (perincian lanjut dalam bahagian Kaedah). Selepas 48j dengan TGF- 1, sel HKC-8 dengan kehadiran miR-150-5p menunjukkan penurunan yang konsisten dalam basal, OCR digandingkan dengan penjanaan ATP, pernafasan berkaitan ATP dan pernafasan maksimum, yang berkaitan dengan OCR sensitif FCCP (Rajah 4A). Kemerosotan dalam OXPHOS dicerminkan oleh penurunan kandungan ATP dalam sel HKC{12}} yang terlalu mengekspresikan miR-150-5p (Gamb. 4C). Kami tidak melihat bahawa miRNA ini menyebabkan variasi dalam ECAR (data tidak ditunjukkan). Selaras dengan ini, tahap ekspresi mRNA mitokondria mereka
gen sasaran yang berkaitan CPT1A, PGC1 dan faktor transkripsi mitokondria A (TFAM), telah dikurangkan sebanyak separuh dalam sel yang dirawat dengan miR-150 mimik berbanding dengan miRNA mimik sel yang dirawat NC (Rajah 4E). Kajian menggunakan pendekatan percubaan yang sama dengan miR-495-3p menghasilkan keputusan yang serupa (Rajah 4B, D, F). Walau bagaimanapun, jisim mitokondria, ditentukan oleh nombor salinan mtDNA dan pewarnaan mitokondria dengan FM hijau MitoTrackerTM, tidak dimodulasi dengan ketara oleh miRNA-150 dan miRNA- 495 kedua-duanya dalam keadaan basal dan di bawah rawatan TGF. Trend menurun dalam parameter ini diperhatikan secara asas (Tambahan Rajah 2A, B, C). Secara keseluruhan, data ini menyokong bahawa miR-150 dan miR-495 mempromosikan a
tindakan pro-fibrotik dalam sel epitelium tiub melalui kemerosotan fungsi mitokondria.
MiR-150 dan miR-495 tidak mengubah potensi transmembran mitokondria (ΔѰm) dan radikal superoksida mitokondria
Rajah 3. MiR-150 dan miR-495 meningkatkan tindak balas pro-fibrotik yang bergantung kepada TGF- 1-pada manusiabuah pinggangsel epitelium tiub. (A, B) Analisis RT–PCR bagi ekspresi miR{{0}}p (A) dan miR-495-3p (B) dalam sel HKC-8 dirawat dengan 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 untuk masa yang dinyatakan. (C, D) tahap mRNA aktin otot licin alfa ( -SMA), kolagen jenis-1 alfa 1 (Col1 1), fibronektin (FN) daripada sel yang ditransfeksi dengan miR-NC dan mimik miR -150-5p (C) atau miR-495-3p (D) ditentukan oleh qRT-PCR menggunakan Sybr green. Sel telah dirawat dengan TGF- 1 (10 ng/ml) selepas ekspresi berlebihan miRNA jika ditunjukkan (lihat juga bahagian kaedah). (E, F) Imunoblot yang menggambarkan tahap protein CPT1A dan -SMA dalam sel yang ditransfeksi dengan miR-NC dan meniru miR-150-5p (E) atau miR{{20}}p (F) untuk titik masa yang ditunjukkan. GAPDH digunakan untuk tujuan normalisasi. Graf bar (panel kanan) mewakili min bagi ungkapan perubahan lipatan ± sem daripada 3 eksperimen bebas. *P < {{30}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" berbanding="" dengan="" keadaan="" kawalan="" yang="" sepadan;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 berbanding="" sel="" yang="" dirawat="" dengan="" mir-nc="" dengan="" keadaan="" eksperimen="" yang="">
Rajah 4. MiR-150 dan miR-495 meningkatkan penindasan FAO 1-TGF dalam sel HKC-8. (A, B) Kadar penggunaan oksigen (OCR) sel HKC-8 yang ditransfeksi dengan
40 nM miR-NC dan meniru miR-150-5p (A) atau miR-495-3p (B) dan terdedah kepada 10 ng/ml TGF{{5} } selepas ekspresi berlebihan miRNA (lihat juga bahagian kaedah). Graf bar (panel kanan) menunjukkan kadar OCR yang dikaitkan dengan kapasiti basal, kebocoran proton, ATP, maksimum dan rizab serta status pernafasan bukan mitokondria. Data diwakili selepas normalisasi dengan jumlah protein. (C, E) Tahap ATP dalam sel HKC-8 ditransfeksi dengan miR-NC dan meniru miR-150-5p (C) atau miR-495-3p (E). (D, F) tahap mRNA CPT1A, PGC1A dan TFAM dalam sel HKC{15}} yang ditransfeksi dengan miR-NC dan mimik miR-150-5p (D) atau miR-495-3p (F) adalah ditentukan oleh qRT-PCR menggunakan Sybr green. Graf bar menunjukkan min ± sem bagi 4 eksperimen bebas. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" berbanding="" dengan="" keadaan="" kawalan="" yang="" sepadan;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 berbanding="" sel="" yang="" dirawat="" dengan="" mir-nc="" dengan="" keadaan="" eksperimen="" yang="">
penghasilan anion. Potensi membran mitokondria (ΔΨm) yang dihasilkan oleh pam proton (Kompleks I, III, dan IV) adalah komponen penting dalam proses penyimpanan tenaga semasa pemfosforilasi oksidatif. Peningkatan ΔѰm boleh menyebabkan gangguan redoks mitokondria, manakala penurunannya menyebabkan pengurangan pengeluaran ATP, menjejaskan daya maju sel [254]. Anion radikal superoksida (O2•− ) ialah radikal bebas yang boleh dijana dalam mitokondria akibat daripada kebocoran elektron yang mungkin berlaku dalam beberapa langkah ETC. Penjanaan O2•− dalam matriks mitokondria juga sangat bergantung pada nisbah NADH/NAD tambah dan CoQH2/CoQ dan kepekatan O2 tempatan [255]. Pengeluaran berlebihannya boleh menyebabkan kehilangan homeostasis redoks mitokondria melalui mekanisme yang berbeza, satu keadaan yang berkaitan dengan banyak keadaan patologi termasuk AKI dan CKD [201]. ΔѰm telah diperiksa dengan pewarna TMRM dan pengeluaran anion radikal superoksida dengan pewarna MitoSOX. Mula-mula, kami mengesahkan ujian ini dengan rawatan sel dengan FCCP dan CCCP sebagai kawalan negatif, untuk TMRM dan MitoSOX masing-masing, dan Oligomycin dan Antimycin A sebagai kawalan positif, untuk TMRM dan MitoSOX masing-masing, dalam garisan sel manusia HKC{{7} }. Dalam kes ujian TMRM, rawatan oligomisin menyebabkan peningkatan 3-kali ganda dalam purata pendarfluor TMRM berbanding pewarna kawalan, manakala rawatan FCCP menghasilkan 9-penurunan kali ganda. Antimycin A dan CCCP menghasilkan peningkatan 35-kali ganda dan 2-penurunan kali ganda, masing-masing dalam ujian MitoSOX (Tambahan Rajah 3A dan B). Untuk menentukan sama ada miR-150 dan miR-495 kesan pada metabolisme mitokondria mencetuskan perubahan dalam parameter ini, sel HKC-8 telah ditransfeksi dengan miR-150-5p atau miR{{17} }p meniru atau miR-NC yang sepadan. Tiada perbezaan ketara secara statistik dalam kuantifikasi pendarfluor probe TMRM atau MitoSOX ditemui antara keadaan rawatan dengan miR dan miR-NC terpilih (Tambahan Rajah 3C).
Tahap MiR-150 dan miR-495 tidak terjejas dalam sampel plasma dan buah pinggang daripada pesakit CKD. Kami menilai ekspresi miRNA terpilih dalam plasma dan biopsi buah pinggang daripada pesakit dengan CKD. Analisis biopsi buah pinggang daripada 26 pesakit (Hospital Ramn y Cajal) tidak menunjukkan korelasi antara tahap fibrosis dan tahap miR-150-5p dan miR-495-3p, masing-masing (Tambahan Rajah 4A dan B) . Tahap plasma beredar miR-150-5p, miRNA dengan ekspresi buah pinggang tertinggi kedua-duanya, juga ditentukan dalam kohort 100 pesakit CKD (Hospital Príncipe de Asturias). Disebabkan oleh pengehadan dalam ketersediaan sampel, kami tidak dapat menentukan nilai serum miR- 495-3p dalam kohort ini. Pesakit-pesakit ini sebelum ini dibahagikan kepada dua subkumpulan berdasarkan evolusi fungsi buah pinggang mereka dalam tempoh 24 bulan supaya 50 pesakit menunjukkan kurang daripada 10 peratus kemerosotan fungsi buah pinggang manakala selebihnya telah mengalami sekurang-kurangnya 40 peratus pengurangan buah pinggang. fungsi. Kuantifikasi qRT-PCR paras plasma miR-150-5p tidak menunjukkan arah aliran yang jelas ke arah ekspresi pembezaan dalam dua subkumpulan pesakit (Tambahan Rajah 4C).
4. Perbincangan
Penemuan miRNA sebagai pengawal selia utama proses patofisiologi telah memupuk penyelidikan mengenai penggunaannya sebagai agen terapeutik dalam hampir setiap keadaan klinikal, termasuk penyakit buah pinggang [31]. Fibrosis buah pinggang adalah hasil yang sangat lazim bagi penyakit buah pinggang kronik (CKD) dengan bebas daripada etiologi, dan kehadirannya adalah peramal evolusi yang jelas. Oleh itu, usaha penting telah ditumpukan untuk mengenal pasti miRNA yang dikaitkan dengan fibrosis buah pinggang [32,33]. Dalam kajian ini, kami memberi tumpuan kepada peranan yang semakin penting dalam gangguan metabolikbuah pinggangkerosakandan kami mengenal pasti dua miRNA, miR-150 dan miR-495, yang sebelum ini merupakan pelakon yang tidak dikenali dalam tempat kejadian. Lebih-lebih lagi, kami mendapati bahawa mereka memberi kesan mendalam pada bioenergetik selular dengan bersinergi dengan TGF- dan mengubah suai laluan metabolik utama yang berkaitan dengan lemak.asid pengoksidaan.
Kecederaan epitelium wujud bersama dengan kecacatan pada lemakasidpengoksidaan, sumber tenaga utama untuk sel epitelium tiub [5]. Ia membawa kepada penyahbezaan mereka yang mendorong kemerosotan fungsi tiub, mencetuskan penangkapan kitaran sel, dan menggalakkan pembebasan sitokin pro-fibrotik kritikal yang boleh menyumbang kepada mengaktifkan myofibroblast interstisial [5,34]. Ekspresi MiR-150 dan miR-495 telah ditingkatkan dalam tetikusberserabutbuah pinggangdan dalammanusia buah pinggangsel epitelium (HKC-8) selepas rawatan dengan TGF-, mencadangkan penglibatan mereka dalam tindak balas pro-fibrotik. Menariknya, analisis silico bagi pengekodan kawasan genom untuk miR-150 dan miR-495 membenarkan pengecaman tapak pengikat untuk faktor transkripsi yang berkaitan dengan isyarat TGF dan laluan lain yang terlibat dalam kerosakan UUO (carian dalam genecards.org untuk miR-150 dan miR-495). Kedua-dua miR-150 dan miR-495 menurunkan tahap ekspresi gen sasaran mereka CPT1A, PGC1 dan TFAM, yang dicerminkan dalam kandungan OCR dan ATP asas, terpaut ATP dan maksimum yang berkurangan selepas rawatan dengan miR-150 dan miR-495. Kesan ini disertai dengan tindak balas pro-fibrotik TGF yang dipertingkatkan dalam sel HKC{17}}. Kami mendapati bahawa TGF- menurunkan jisim mitokondria dan DNA mitokondria. Selepas rawatan dengan miRNA-150 dan miRNA-495, aliran menurun diperhatikan dalam kandungan mitokondria dalam keadaan basal, walaupun tidak mencapai kepentingan. Ini menunjukkan mekanisme yang bebas daripada peranan PGC1 atau TFAM dan kemungkinan besar berkaitan dengan kesan metabolik yang dikaitkan dengan downregulation CPT1A sebagai pembolehubah utama yang dipengaruhi oleh kehadiran miRNA. Perubahan dalam bioenergetik mitokondria adalah kritikal dalam penyakit buah pinggang [35]. Dalam mengekalkan, kami baru-baru ini menunjukkan bahawa CPT1A ialah enzim kritikal untuk pemeliharaan petak tiub yang sihat, kerana ekspresi berlebihannya melindungi daripada fibrosis buah pinggang [6]. Walau bagaimanapun, PGC1
dan gen TFAM juga berkait rapat dengan fungsi mitokondria dan biogenesis [36]. Ekspresi terjejas gen ini dikaitkan dengan CKD, manakala pemeliharaannya menyumbang kepada integriti buah pinggang seperti yang ditunjukkan dalam beberapa model kerosakan. Oleh itu, Han et al. mendapati bahawa fungsi keuntungan tiub PGC1 melindungi tikus terhadap fibrosis buah pinggang yang disebabkan oleh Notch dan membalikkan disfungsi mitokondria yang berkaitan dengan model ini [37]. Begitu juga, ekspresi semula Tfam dalam sel tubul menghalang pemrograman semula metabolik dan pro-fibrotik yang disebabkan oleh Notch [38]. Oleh itu, boleh dibayangkan bahawa ekspresi mRNA yang berkurangan bagi gen mitokondria ini, yang disebabkan oleh miR-150 dan miR-495, juga menyumbang kepada fenotip epitelium yang rosak.
Penurunan yang kami perhatikan dalam OCR yang dikaitkan dengan kerosakan sel epitelium adalah menurut laporan sebelumnya, termasuk kajian kami dengan miR-33 dan miR-9 [15,16]. Manakala Kang et al. juga melaporkan bahawa pengoksidaan glukosa adalah lebih rendah dalam model manusia dan tetikus fibrosis buah pinggang [5], data kami menunjukkan bahawa pengurangan pengantaraan mikroRNA dalam OCR tidak mendorong variasi per se dalam ECAR, menunjukkan bahawa penutupan glikolitik dalam keadaan fibrotik kemungkinan besar bergantung pada rangsangan fibrotik dan bukannya pada fosforilasi oksidatif terjejas. Beberapa miRNA telah dikenal pasti sebagai pengubah suai utama fungsi mitokondria, termasuk miRNA pro-fibrotik pola dasar, miR-21 [39]. Penindasan ekspresi PPAR oleh miR{10}} telah digunakan sebagai mekanisme yang miRNA ini melaksanakan tindakan pro-fibrotiknya. Selain menghalang FAO, gen sasaran untuk miR{12}} menunjukkan bahawa miRNA ini menyenyapkan pelbagai proses mitokondria. Contoh lain termasuk mir-9 [16], miR-33 [15] dan miR-30e [40,41]. Walau bagaimanapun, untuk pengetahuan kami, terdapat beberapa laporan yang menangani peraturan mikroRNA gen CPT1A, PGC1 dan TFAM dalam konteks fibrosis buah pinggang. Menariknya, mikroRNA-214 yang menggalakkan peralihan epitelium-ke-mesenchymal (EMT) semasa fibrosis buah pinggang, secara langsung menyasarkan TFAM dalam sel kanser kolon [42]. Penindasan ini juga dilaporkan untuk miR-590-3p [43]. Keluarga miR-29, salah satu pengawal selia pengeluaran ECM yang berciri terbaik dalam fibrosis organ, secara langsung menyasarkan PGC1 , memelihara homeostasis jantung. Oleh itu, penyenyapan patologi miR-29 membawa kepada pengawalseliaan PGC1, menghasilkan perubahan mendalam dalam biogenesis mitokondria yang menyumbang kepada penyakit jantung [44]. Walaupun data kami jelas menyokong peranan miR-150 dan miR-495 dalam fibrosis buah pinggang, kajian in vivo selanjutnya akan diperlukan untuk mengesahkan perbalahan ini.
Untuk menilai integriti rantaian pengangkutan elektron mitokondria (ETC), kami memberi tumpuan kepada dua ciri: ΔѰm dan pengeluaran anion radikal superoksida. Kami mendapati bahawa miR-150 dan miR-495 tidak mengubah parameter ini. ΔѰm yang stabil diperlukan untuk daya maju sel dan magnitudnya berbeza-beza antara jenis sel [45]. Penyelenggaraannya diperhalusi dengan ketat kerana peningkatan dalam ΔѰm boleh menyebabkan gangguan dalam keadaan redoks, manakala penurunannya menyebabkan pengurangan pengeluaran ATP dan boleh mencetuskan apoptosis. Dalam kajian kami, perubahan dalam ΔѰm dikira dengan pewarna pendarfluor kationik TMRM, manakala pengeluaran anion radikal superoksida mitokondria diukur dengan pewarna fluorogenik MitoSOX Red. Penggunaan alat ini dalam keadaan yang menjejaskan fungsi buah pinggang tidak begitu ketara dalam kesusasteraan. Walau bagaimanapun, dalam menghadapi ketiadaan perubahan dalam kajian kami, kami tidak meneruskan strategi lain yang mendalam untuk menilai hormesis redoks, dan oleh itu, kami tidak boleh mengecualikan bahawa miRNA ini boleh mengubah nada nukleofilik atau fungsi beberapa komponen DLL.
Dalam persekitaran klinikal, miR-150 telah dicadangkan sebagai miRNA pro-fibrotik dalam nefritis lupus dengan memodulasi isyarat TGF [46,47], manakala miR-495 dikaitkan dengan peranan perlindungan dalam jantung diabetes. fibrosis [48]. Untuk mengetahui potensi penglibatan mereka dalam CKD, kami menilai tahap serum dan parenkim mereka dalam dua kohort pesakit yang berbeza. Tahap serum miRNA telah dicadangkan sebagai biomarker berpotensi untuk perkembangan CKD [49,50]. Oleh itu, paras miR-21 serum yang beredar dan banyaknya miR-29c dalam eksosom kencing berkait dengan fibrosis buah pinggang, mencadangkan potensi peranannya sebagai biomarker [51, 52]. Walau bagaimanapun, tahap miR-150 dan miR-495 tidak berbeza sama ada dalam sampel plasma atau buah pinggang daripada pesakit CKD. Corak ekspresi mikroRNA yang berbeza antara spesies dan jenis sel mungkin menjelaskan ketiadaan perbezaan dalam tahap miR-150 dan miR-495 dalam tisu fibrotik ini [53]. Walaupun dalam beberapa kes yang dilaporkan tahap plasma mikroRNA boleh mencerminkan mereka dalam tisu buah pinggang, mekanisme lain yang berkaitan dengan rembesan miRNA ke sistem peredaran darah atau mengimbangi rembesan ini oleh organ lain juga harus dipertimbangkan [13,54].
Secara keseluruhannya, hasil kami menyokong bahawa miR-150 dan miR-495 mempromosikanbuah pinggangepiteliumselpenyahbezaan kemungkinan besar melalui kekurangan tenaga, yang disampaikan oleh penindasan gen berkaitan fungsi mitokondria CPT1A, PGC1, dan TFAM. Mereka juga memberi asas untuk meneruskan peranan mereka dalam vivo, serta potensi kegunaan mereka sebagai biomarker diagnostik atau prognostik.
Sumbangan pengarang
SL mengandung dan mengarahkan penyelidikan. VM mereka bentuk, melaksanakan dan menganalisis kebanyakan eksperimen. RR membantu dengan analisis susunan mikroRNA. DRP dan LGB melakukan kajian dalam dua kohort berbeza pesakit CKD. Semua pengarang membantu dengan perbincangan keputusan dan SL dan VM menulis manuskrip.
Pengisytiharan kepentingan bersaing
Pengarang tidak mempunyai konflik kepentingan.
Ucapan terima kasih
Kerja ini disokong oleh geran daripada Kementerian Sains Sepanyol SAF2015-66107-R dan PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) yang dibiayai bersama oleh Eropah Dana Pembangunan Wilayah, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 dan RD16/ 0009/0016 (SL dan DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751 (SL dan DRP), geran bantuan daripada Persatuan Nefrologi Sepanyol (Fundacin Senefro 2017) kepada SL dan Fundacionbuah pinggang"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) semuanya dari Sepanyol. CBMSO menerima sokongan institusi daripada Fundacion "Ramn Areces". VM disokong oleh persekutuan predoctoral Program FPI (BES- 2013-065986) daripada Kementerian Sains Sepanyol.
