Status Semasa Neuroprotection dalam Penyakit Jantung Kongenital Bahagian 3

3.2. Penilaian Separa Kuantitatif DNA Mitokondria Ektopik

Imej pewarnaan Hsp60 (matriks mitokondria) dan pewarnaan histon-H2B (penanda nuklear) telah ditolak daripada imej pewarnaan dsDNA. Kemudian, menggunakan fungsi "AdjustThreshold" perisian lmage] (National Institutes of Health), imej telah diduakan.

Mitokondria ialah kilang tenaga dalam sel, bertanggungjawab untuk mensintesis ATP untuk menyediakan tenaga yang diperlukan oleh sel. Matriks mitokondria ialah cecair dalaman mitokondria, yang mengandungi pelbagai enzim dan ion dan merupakan tapak utama untuk pelbagai tindak balas biokimia mitokondria. Ingatan adalah salah satu kebolehan kognitif yang paling penting bagi manusia. Walaupun kedua-duanya kelihatan tidak berkaitan, mereka berkait rapat.

Penyelidikan menunjukkan interaksi antara matriks mitokondria dan ingatan. Enzim dan ion dalam matriks mitokondria boleh secara langsung mempengaruhi keceriaan neuron dengan mengawal metabolisme tenaga dan status saluran ion dalam sel neuron, sekali gus menjejaskan ingatan. Di samping itu, terdapat pelbagai molekul isyarat dalam matriks mitokondria, yang boleh dihantar ke neuron hiliran melalui akson dan sinaps neuron, menjejaskan kecekapan transduksi isyarat neuron, sekali gus menjejaskan pembentukan dan penyatuan ingatan.

Pada masa yang sama, aktiviti ingatan juga secara langsung mempengaruhi keadaan matriks mitokondria. Aktiviti ingatan akan meningkatkan penggunaan tenaga neuron dan menggalakkan tindak balas redoks dalam matriks mitokondria, dengan itu menjejaskan tahap metabolik mitokondria dan keseimbangan ion intrasel, seterusnya menjejaskan keceriaan dan kecekapan transduksi isyarat neuron.

Oleh itu, mengekalkan kesihatan mitokondria yang baik adalah penting untuk mengekalkan fungsi ingatan yang baik. Dengan mengekalkan tabiat hidup yang baik, seperti diet biasa, senaman sederhana, tidur yang mencukupi, dan lain-lain, anda boleh membantu mengekalkan kesihatan matriks mitokondria. Selain itu, fungsi ingatan juga boleh dipertingkatkan melalui campur tangan farmaseutikal yang sesuai untuk menggalakkan tindak balas biokimia dan isyarat dalam matriks mitokondria.

Dalam kehidupan seharian, kita boleh menggunakan daya ingatan dalam pelbagai cara, seperti membaca, belajar, berfikir, permainan, dan lain-lain. Pada masa yang sama, kita juga harus memberi perhatian untuk mengekalkan kesihatan yang baik untuk mengekalkan kesihatan matriks mitokondria dengan lebih baik. Saya percaya bahawa melalui usaha ini, kita pasti akan mempunyai ingatan yang lebih baik dan lebih baik menghadapi pelbagai cabaran dalam kehidupan dan pekerjaan. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan memori dengan ketara, kerana Cistanche deserticola juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Bahan-bahan ini sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche deserticola juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrien dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Kami memilih puncta dsDNA dalam julat saiz dari 2 hingga 20 um' (circularity 0.1-1.0)menggunakan fungsi "Analyze-Analyze Particles". jika perlu, imej asal telah diperiksa untuk pengiraan akhir. Jika isyarat histon H2B adalah kecil. maka imej yang ditolak menunjukkan struktur seperti donat.

Ini mewakili dsDNA sitosolik asal nuklear dan harus disingkirkan daripada kuantiti dsDNA sitosolik asal mitokondria. Julat saiz boleh diubah suai mengikut jenis sel atau asal spesimen histologi. Rajah lE menunjukkan contoh pengiraan DNA mitokondria ektopik

titik menggunakan 1B D.

Sebagai alternatif, imej pewarnaan Hsp60 telah ditolak daripada imej pewarnaan dsDNA. Kemudian, bilangan puncta dsDNA dikira menggunakan fungsi "Laraskan-Ambang "Analisis-Analisis Zarah". Selepas itu, puncta dsDNA tanpa isyarat histone-H2B dikira melalui pemerhatian langsung. Kaedah terakhir ini sesuai apabila imej histone-H2B menunjukkan nisbah isyarat kepada hingar yang rendah.

Secara keseluruhannya, kaedah ini dapat menunjukkan dengan jelas DNA mitokondria ektopik yang bocor ke dalam sitoplasma dan membolehkan penilaian objektif dan statistik DNA mitokondria ektopik tersebut dalam sel.

4. Perbincangan

Dalam kajian kami, kami membangunkan kaedah yang membolehkan pengiraan DNA mitokondria sitoplasma. Pengesanan DNA mitokondria sitoplasma telah dilaporkan dengan menggunakan teknik imunofluoresensi, tetapi kaedah tersebut bukanlah kuantitatif untuk penilaian DNA mitokondria sitoplasma dalam kebanyakan kes [15,25]. Dalam kajian lain, titisan PCR telah dijalankan untuk mengukur DNA mitokondria yang beredar [9].

baru-baru ini, Sato et al. [26,27] menerbitkan protokol yang sangat baik untuk menilai DNA sitoplasma melalui immunofluorescencemicroscopy menggunakan antibodi Lamin B1 (LMNB1) sebagai penanda struktur nuklear dan subunit cytochrome c oxidase 4 (COX4) sebagai penanda struktur mitokondria. Protokol ini kelihatan sangat berguna untuk mengira dsDNA sitoplasma asal nuklear.

Walau bagaimanapun, apabila kami mencuba COX4 atau penanda membran mitokondria lain, termasuk kedua-dua penanda dalaman dan luaran, adalah sangat sukar untuk membezakan sitoplasma daripada mitokondria dengan tepat.

Sebagai contoh, jika kita memerhati isyarat bulat menggunakan penanda membran mitokondria dan isyarat dsDNA diperhatikan di dalam, maka dsDNA ini boleh mewakili sama ada mitokondriaDNA di dalam mitokondria bulat (normal) atau DNA mitokondria sitoplasma di luar mitokondria seperti donat (ektopik). Oleh itu, kami menggunakan Hsp60 sebagai penanda pelabelan matriks mitokondria untuk menilai DNA mitokondria ektopik dalam sitoplasma.

Seperti yang diterangkan dalam ulasan baru-baru ini [23], terdapat pelbagai jenis cytoplasmicdsDNA asal nuklear, dan kebanyakannya positif untuk penanda histon. Disebabkan oleh pengehadan gabungan antibodi yang digunakan untuk pewarnaan tiga kali ganda, kami menggunakan histon H2Bas sebagai penanda histon.

Walau bagaimanapun, jika had ini diselesaikan, H2AX mungkin penanda yang lebih baik untuk dsDNA sitoplasma asal nuklear. DsDNA sitoplasma histone-H2B-negatif jarang diperhatikan dalam sel HeLa kawalan yang digunakan dalam kajian ini, tetapi dsDNA asal nuklear sedemikian mungkin terdapat jika garisan atau keadaan sel lain digunakan.

Hibridisasi in situ DNA mitokondria yang digunakan dalam makalah terbaru kami adalah sesuai untuk penilaian kualitatif, tetapi mungkin sukar untuk menggunakan hibridisasi in situ untuk penilaian kuantitatif [8].

Hibridisasi in situ mendedahkan spesimen kepada suhu tinggi, yang boleh mengakibatkan ubah bentuk atau bunyi pada beberapa bahagian spesimen. Sebaliknya, kaedah imunositokimia yang dibentangkan dalam kertas ini boleh mendapatkan isyarat dengan bunyi latar belakang yang rendah. Dalam kertas kerja terbaru kami, dalam sel manusia dan ikan zebra yang digunakan sebagai model penyakit Parkinson, kami menunjukkan bahawa DNA mitokondria telah bocor ke dalam sitoplasma, yang merupakan toksik kepada sel. Kami juga memerhatikan bahawa kuantiti DNA mitokondria sitosol telah meningkat dalam tisu otak post-mortem pesakit dengan penyakit Parkinson [8].

Garis bukti ini menunjukkan bahawa peningkatan kuantiti DNA mitokondria ektopik yang bocor keluar dari mitokondria boleh menyebabkan keradangan akut dan kronik yang mengakibatkan pelbagai penyakit, termasuk penyakit Parkinson dan kegagalan jantung; oleh itu, upregulationof cytosolic-DNA degradasi atau perencatan sensornya boleh menjadi sasaran terapeutik yang berpotensi untuk penyakit ini [8,28].

Kaedah yang diperkenalkan dalam kertas ini untuk penilaian kuantitatif DNA mitokondria ektopik berfungsi sebagai alat penting untuk penyelidikan lanjut dalam bidang ini.

Sumbangan Pengarang: HM dan MTH merumuskan hipotesis, mereka bentuk majoriti eksperimen, melakukan eksperimen, menganalisis data dan menulis manuskrip. NMmelaksanakan eksperimen yang berkaitan dengan sel kultur. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi terbitan manuskrip.

Pembiayaan: Kerja ini disokong oleh geran daripada AMED (nombor geran JP21gm6110028 danJP19dm0107154 (HM)), Yayasan Sains Takeda (HM), JSPS KAKENHI (nombor geran JP14516799 (HM), JP 16690735 (4HM), dan JP 16690735 (4HM) ), JST (Moonshot R&D; nombor geranJPMJMS2024 (HM)) dan Geran Bantuan daripada TBRF (nombor geran TBRF-RF 21-135 (HM)).

Pernyataan Ketersediaan Data: Data dan alat yang diterangkan dalam manuskrip ini tersedia atas permintaan.

Penghargaan: Kami menghargai Shinano Kobayashi kerana mengambil bahagian dalam perbincangan yang berguna dan memberikan sokongan berterusan. Kami menghargai Yayasan Penyelidikan Biokimia Tokyo (TBRF) kerana menyediakan persekutuan pasca doktoral TBRF untuk penyelidik asing kepada MH (TBRF-RF 21-135).

Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Matahari, L.; Chen, ZJ Peranan penting isyarat cGAS-cGAMP dalam pertahanan antiviral dan kesan pembantu imun. Sains 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Pengecaman genom Herpesvirus disebabkan asetilasi nuklear IFI16 adalah penting untuk translokasi sitoplasma, inflammasom dan tindak balas IFN-nya. Pathog PLoS. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Restoran, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM cGAS-pengantara penstabilan IFI16 menggalakkan isyarat semula jadi semasa jangkitan virus herpes simplex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP yang dirembeskan oleh Listeria monocytogenes intraselular mengaktifkan tindak balas Iinterferon jenis hos. Sains 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Cytoplasmicchromatin mencetuskan keradangan pada penuaan dan kanser. Alam 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Tukang Gunting Rambut, GN; et al.Downregulation DNase sitoplasma terlibat dalam pengumpulan DNA sitoplasma dan SASP dalam sel senescent. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.;Chin, HS; et al. Makropori BAK/BAX memudahkan herniasi mitokondria dan efluks mtDNA semasa apoptosis. Sains 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Cytosolic dsDNA asal mitokondria mendorong sitotoksisiti dan neurodegenerasi dalam model selular dan ikan zebra bagi penyakit Parkinson. Nat. Commun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Matahari, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin dan PINK1mengurangkan keradangan yang disebabkan oleh STING. Alam 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, MP; Croteau, DL; Suplemen Bohr, VA NAD(+) mengurangkan keradangan saraf dan penuaan sel dalam model tikus transgenik penyakit Alzheimer melalui cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com