Keberkesanan Sensitif Umur Sekatan Kalori Pada Biogenesis Mitokondria Dan Kerosakan MtDNA dalam Hati Tikus

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Sekatan kalori(CR) ialah rawatan yang paling mujarab untuk melambatkan permulaan perubahan berkaitan usia seperti disfungsi mitokondria. Walau bagaimanapun, sensitiviti penanda mitokondria kepada CR dan sempadan berkaitan umur keberkesanan CR tidak dijelaskan sepenuhnya. Kami menggunakan sampel hati daripada tikus yang diberi makan secara ad libitum (AL) dibahagikan kepada:18-berumur sebulan (AL-18), 28-berumur sebulan (AL-28) , dan kumpulan 32-bulan (AL-32) dan daripada CR-treated (CR) 28-month-old (CR-28) dan 32- rakan sejawat (CR-32) sebulan untuk menguji kesan CR pada beberapa penanda mitokondria. Penurunan berkaitan usia dalam aktiviti sintase sitrat, dalam jumlah protein TFAM, MFN2 dan DRP1, dan dalam kandungan mtDNA dalam kumpulan AL-28 telah dihalang dalam CR-28 rakan sejawat. Sehubungan itu, CR mengurangkan kerosakan mtDNA oksidatif yang dinilai melalui kejadian purin teroksida di kawasan mtDNA tertentu dalam CR-28 haiwan. Penemuan ini menyokong kesan anti-penuaan CR sehingga 28 bulan. Sebaliknya, jumlah protein LonP1, Cyt c, OGG1 dan APE1 dan kandungan pemadaman mtDNA 4.8 Kb tidak terjejas dalam CR-28 tikus. Ketiadaan perbezaan ketara antara nilai AL-32 dan rakan sejawatan CR-32 mencadangkan sempadan CRefficacy yang berkaitan dengan usia pada usia ini.puritan vitamin cWalau bagaimanapun, ini hanya sebahagiannya menyekat faedah CR dalam mengatasi penurunan penuaan umum dan penglibatan mitokondria yang berkaitan.

Kata kunci:hati tikus; penuaan; sekatan kalori; biogenesis mitokondria; kerosakan mtDNA; keberkesanan CR yang sensitif terhadap umur

KSL21

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Menurut perkembangan mengagumkan kajian yang menyiasat proses penuaan, beberapa definisi proses yang berbeza telah disusun secara berurutan, dan satu set laluan dan mediator telah dikenal pasti sebagai apa yang dipanggil ciri penuaan [1,2]. Antaranya, disfungsi mitokondria, tekanan oksidatif, dan kerosakan molekul mitokondria telah muncul sebagai faktor penting. Ciri penting penuaan ialah kekhususan tisu yang telah diserlahkan untuk penglibatan mitokondria [3,4], perubahan epigenetik [5], dan perubahan lain seperti panjang telomere [6]. Antara pelbagai rawatan yang bertujuan untuk mencegah atau melambatkan permulaan perubahan berkaitan usia, sekatan kalori(CR) ialah strategi tertua yang dicadangkan [7], dan masih mewakili piawaian emas untuk bilangan kesan berfaedah yang sangat besar yang disampaikan oleh campur tangan ini. Sesungguhnya, kajian terbaru tentang mekanisme molekul yang ditimbulkan oleh CR telah menunjukkan bahawa beberapa laluan dipengaruhi secara positif oleh campur tangan pemakanan ini [8-10].sistancheTambahan pula, penemuan ini juga sangat menyokong kewujudan "keplastikan" penuaan [5,9,11,12] yang boleh dimodulasi melalui interaksi alam sekitar seperti intervensi pemakanan atau farmaseutikal atau tabiat gaya hidup. CR telah ditunjukkan untuk mengatasi perubahan berkaitan usia biogenesis dan metabolisme mitokondria dalam beberapa tisu tikus dengan kesan khusus tisu [3,13,14]. Lebih khusus lagi, kajian terdahulu oleh kumpulan kami mengenai hati tikus, yang sangat dipengaruhi oleh penuaan di peringkat mitokondria, memeriksa penanda organel menunjukkan kesan positif CR pada perubahan berkaitan usia mitokondria. Malah, dalam tikus berumur 28-bulan yang dirawat CR, kandungan DNA mitokondria (mtDNA), jumlah protein yang terlibat dalam biogenesis mitokondria atau sensitif ROS dan tahap pengikatan faktor transkripsi mitokondria A(TFAM) di kawasan mtDNA tertentu membentangkan nilai yang jauh berbeza daripada nilai yang dipadankan dengan ad libitum (AL) rakan sejawat dan tidak berbeza secara statistik daripada haiwan yang diberi makan AL yang lebih muda 18-bulan [15]. Baru-baru ini, analisis biogenesis mitokondria dan kerosakan mtDNA dalam hati daripada tikus berumur AL (28-bulan) dan sangat berumur (32-bulan), membolehkan kami mengkaji pelbagai parameter mitokondria dan untuk mencadangkan kadar penuaan yang berbeza berhubung dengan penglibatan mitokondria, dalam beberapa haiwan secara semula jadi mencapai umur panjang berkenaan dengan majoriti mereka yang semakin tua [16,17]. Dengan premis ini, kami menyasarkan untuk menilai keberkesanan CR pada set besar penanda mitokondria pada pelbagai peringkat umur dalam hati tikus. Untuk tujuan ini, kami menggunakan haiwan daripada strain hibrid Fischer 344× Brown Norway yang sangat lama hidup, yang daripadanya 18-tikus yang diberi makan secara ad libitum (AL-18) telah dipilih sebagai kawalan, untuk dibandingkan dengan haiwan yang diberi makan secara ad libitum, berumur(AL-28) dan sangat tua(AL-32) dan haiwan yang dipadankan dengan umur yang dirawat CR(CR-28 dan CR{ {39}}). Dalam kumpulan tikus ini, kami menilai: Aktiviti enzim mitokondria sitrat sintase, ekspresi set protein termasuk TFAM, Lon protease (LonP1) dan cytochrome c(Cyt c), enzim pembaikan mtDNA 8- oxo DNA glycosylase/apurinic atau apyrimidinic(AP) lyase (OGG1) dan apurinic/apyrimidinic endonuclease 1(APE1), dan protein dinamik mitokondria mitofusin 2 (MFN2) dan protein berkaitan dinamin 1(DRP1). Akhirnya, kandungan mtDNA dan kerosakan oksidatif di kawasan tertentu juga ditentukan.

2. Keputusan

2.1. Eoaluasi Umur dan Kesan CR pada Penanda Kefungsian Mitokondria

Aktiviti sintase sitrat, yang juga merupakan penanda jisim mitokondria, ditentukan dalam kelima-lima kumpulan tikus untuk menilai sensitiviti fungsi mitokondria kepada penuaan dan CR (Rajah 1).

Penurunan ketara secara statistik berkaitan umur dalam aktiviti sintase sitrat diperhatikan dalam AL-28(-41 peratus ) dan AL-32(-40 peratus ) tikus berbanding dengan AL{{ 5}} kawalan umur. Tiada perbezaan ketara secara statistik ditemui antara kumpulan AL-28 dan AL-32. Kesan CR ditunjukkan oleh aktiviti enzim yang jauh lebih tinggi ( ditambah 40 peratus ) dalam tikus CR-28 berbanding dengan nilai tikus AL-28 yang dipadankan dengan umur. Tambahan pula, aktiviti CR-28 adalah serupa dengan yang diperhatikan dalam tikus kawalan AL-18 yang lebih muda (Rajah 1). Kesan ini sebaliknya telah tumpul dalam haiwan CR-32. Malah, pada usia lebih tua 32 bulan, tiada perbezaan statistik dapat diperhatikan antara kumpulan AL dan CR.

KSL22

cistanche boleh anti penuaan

Untuk memperdalam analisis kesan umur dan CR pada fungsi mitokondria, jumlah protein TFAM dan LonP1 ditentukan dalam mitokondria yang diasingkan daripada semua kumpulan tikus oleh analisis Western blot, di mana protein dari membran mitokondria luar VDAC digunakan sebagai kawalan pemuatan dalaman (Rajah 2).

Rajah 2. Jumlah protein TFAM dan LonP1 dalam mitokondria hati terpencil daripada AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 dan CR-32-bulan -tikus tua. (A). Jumlah protein TFAM dalam mitokondria hati terpencil daripada kumpulan tikus yang berbeza. Dalam inset, wakil Western blot telah dijalankan ke atas seekor tikus daripada setiap kumpulan yang diuji. Jalur imunoreaktif, dari atas ke bawah, masing-masing mewakili isyarat daripada TFAM dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur TFAM, dinormalkan kepada keamatan VDAC.(B). Jumlah protein LonP1 dalam mitokondria hati terpencil daripada kumpulan tikus yang berbeza. Dalam inset, wakil Western blot telah dijalankan ke atas seekor tikus daripada setiap kumpulan yang diuji. Dari atas ke bawah, jalur imunoreaktif mewakili, masing-masing, isyarat daripada LonP1 dan VDAC.apa itu cistancheHistogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur LonP1, dinormalkan kepada keamatan VDAC. (A, B) Data mewakili keputusan daripada percubaan Western blot tiga kali ganda dan dianalisis menggunakan ujian ANOVA Sehala dan ujian perbandingan berbilang Tukey . Bar mewakili nilai min dan SD untuk lima kumpulan eksperimen. Data telah dinormalkan terhadap nilai tikus AL-18, ditetapkan sebagai 1.*p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

KSL23

Untuk menilai kesan penuaan dan CR pada fungsi metabolik mitokondria lain yang merupakan permulaan laluan apoptosis intrinsik mitokondria, kami menentukan, dengan eksperimen Western blot, jumlah intra-mitokondria Cyt c (Rajah 3).

Rajah 3. Jumlah protein Cyt c dalam mitokondria hati terpencil daripada AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 dan CR-32-bulan- tikus tua. Dalam inset, wakil Western blot telah dijalankan ke atas seekor tikus daripada setiap kumpulan yang diuji. Dari atas ke bawah, jalur imunoreaktif mewakili, masing-masing, isyarat daripada Cyt c dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur Cyt c yang dinormalkan kepada keamatan VDAC. Semua data mewakili keputusan daripada percubaan Western blot tiga kali ganda dan dianalisis menggunakan ujian ANOVA Sehala dan ujian perbandingan berganda Tukey. Bar mewakili nilai min dan SD untuk lima kumpulan eksperimen. Data telah dinormalkan terhadap nilai tikus AL-18, ditetapkan sebagai 1.* p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">Cistanche anti penuaanKesan CR tidak relevan sama sekali kerana tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam jumlah protein Cyt c antara kumpulan AL dan CR yang dipadankan dengan umur pada 28 dan juga pada 32 bulan. Penurunan yang berkaitan dengan umur dalam jumlah Cyt c dalam kedua-dua kumpulan menunjukkan aliran yang serupa dengan yang diperhatikan dalam kumpulan AL-28 dan AL-32 dengan penurunan yang lebih berkaitan dalam CR-28 haiwan sebahagiannya dihalang pada tikus CR-32 yang lebih tua.

2.2.Penilaian Umur dan Kesan CR ke atas Enzim Pembaikan mtDNA

Memandangkan penuaan telah terbukti sebahagian besarnya dikaitkan dengan pengumpulan kerosakan kepada mtDNA, kami mengukur, dengan eksperimen Western blot, dalam mitokondria hati terpencil ungkapan dua enzim pembaikan mtDNA utama, iaitu 8-oxo DNA glycosylase/apurinic atau apyrimidinic(AP)lyase (OGG1) dan apurinic/apyrimidinic endonuclease 1(APE1), kedua-duanya terlibat dalam pembaikan eksisi asas (BER) yang merupakan mekanisme pembaikan mtDNA yang lazim (Rajah 4).

Rajah 4. Jumlah protein OGG1 dan APEl dalam mitokondria hati terpencil daripada AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 dan CR-32-bulan -tikus tua. (A).Dalam inset, wakil Western blot telah dijalankan ke atas seekor tikus daripada setiap kumpulan yang diuji. Jalur imunoreaktif, dari atas ke bawah mewakili, masing-masing, isyarat daripada OGGl dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur OGG1 yang dinormalkan kepada keamatan VDAC.(B). Dalam inset, tompok Barat yang mewakili telah dijalankan pada satu tikus daripada setiap kumpulan yang diuji.cistanche beefíciosDari atas ke bawah, jalur imunoreaktif mewakili, masing-masing, isyarat daripada APE1 dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur APE1 yang dinormalkan kepada keamatan VDAC. (A, B) Data mewakili keputusan daripada percubaan Western blot tiga kali ganda dan dianalisis menggunakan ujian ANOVA Sehala dan ujian perbandingan berganda Tukey. Bar mewakili nilai min dan SD untuk lima kumpulan eksperimen. Data telah dinormalisasi terhadap nilai tikus AL-18, ditetapkan sebagai 1. n: Bilangan haiwan yang dianalisis.

KSL24

Jumlah protein intra-mitokondria kedua-dua enzim mempunyai trend yang sama seperti kesan umur dan CR. Khususnya, OGG1 dan APE1 tidak menunjukkan sebarang perubahan berkaitan umur yang signifikan secara statistik dalam kedua-dua kumpulan AL dan CR yang menunjukkan tiada kesan umur sama sekali. Secara tidak dijangka, CR juga tidak menyebabkan sebarang kesan ketara pada jumlah OGG1 dan APE1 dalam kumpulan CR-28 berbanding dengan haiwan AL yang dipadankan dengan umur, serta antara 32-kumpulan berusia sebulan.

2.3. Penilaian Kesan Umur dan CR pada Dinamik Mitokondria

Setelah melaporkan kesan umur yang ketara pada ekspresi protein yang terlibat dalam gabungan (MFN2) dan pembelahan (DRP1) [16], kami menilai di sini kesan CR dalam jangka masa yang lama pada penanda ini. Oleh itu, jumlah protein MFN2 dan DRP1 ditentukan, oleh eksperimen Western blot, dalam mitokondria hati terpencil daripada semua kumpulan tikus (Rajah 5).

Rajah 5. Jumlah protein MFN2 dan DRP1 dalam mitokondria hati terpencil daripada AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 dan CR-32-bulan -tikus tua. (A).Dalam inset, wakil Western blot telah dijalankan ke atas seekor tikus daripada setiap kumpulan yang diuji. Dari atas ke bawah, jalur imunoreaktif mewakili, masing-masing, isyarat daripada MFN2 dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur MFN2dinormalkan kepada keamatan VDAC.(B). Dalam inset, wakil Western blot telah dijalankan ke atas seekor tikus daripada setiap kumpulan yang diuji. Jalur imunoreaktif, dari atas ke bawah mewakili, masing-masing, isyarat daripada DRP1 dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi keamatan jalur DRP1 yang dinormalkan kepada keamatan VDAC.(A, B)Data mewakili keputusan daripada percubaan Western blot tiga kali ganda dan dianalisis menggunakan ujian ANOVA Sehala dan ujian perbandingan berbilang Tukey. Bar mewakili nilai min dan SD untuk lima kumpulan eksperimen. Data telah dinormalkan terhadap nilai AL{14}} tikus, ditetapkan sebagai 1. *p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

Kami mendapati penurunan berkaitan umur yang ketara secara statistik (-43 peratus ) dalam MFN2 dalam tikus AL-28 berbanding dengan kawalan AL-18. Penurunan sedemikian telah dihalang pada tikus AL-32 yang menunjukkan kesan umur yang kompleks, sama seperti yang dilaporkan untuk Cyt c. Walau bagaimanapun, berbeza daripada Cyt c, CR mempunyai kesan yang sangat positif pada 28-haiwan berumur sebulan, menghalang dalam CR-28 tikus penurunan berkaitan umur haiwan AL-28 dan membawa kepada peningkatan ketara yang ketara ( ditambah 52 peratus ) dalam MFN2 berbanding rakan sejawat padanan umur AL. Selain itu, jumlah MFN2 dalam tikus CR-28 tidak berbeza daripada nilai dalam kawalan AL-18, menunjukkan pencegahan berkesan terhadap kesan berkaitan usia. Tiada perbezaan ketara ditemui antara kumpulan AL-32 dan CR-32, sekali gus menunjukkan kesan terhad CR dalam haiwan tertua. Selain itu, tiada kesan berkaitan umur ditemui untuk MFN2 dalam kumpulan AL-32 berbanding dengan AL-18 rakan sejawat. Begitu juga, jumlah protein DRP1 menunjukkan penurunan ketara berkaitan usia (-49 peratus ) dalam AL-28 tikus berbanding kumpulan AL-18 yang dihalang oleh CR dalam {{29 }}haiwan berumur sebulan. Sesungguhnya, kumpulan CR-28 membentangkan perbezaan positif( tambah 50 peratus ) berbanding dengan AL-28, menunjukkan kesan CR yang kuat. Walau bagaimanapun, ketiadaan perbezaan antara AL-32 dan CR-32 bagi jumlah protein DRP1 seterusnya menunjukkan keberkesanan terhad CR dalam penuaan lanjutan. Sekali lagi, tiada kesan umur yang jelas juga untuk jumlah DRP1 yang berpindah daripada kumpulan AL-18 kepada kumpulan AL-32. Kemudian, kami menentukan nilai indeks gabungan (FI sebagai nisbah antara MFN2 / DRP1 untuk setiap tikus yang diperiksa (Rajah 6).

Nilai FI dalam kumpulan AL{{0}} meliputi julat sempit antara 1.37 hingga 2.64, manakala dalam kumpulan AL-28 semua nilai lebih tinggi antara 2.20 hingga 8.24 . Nilai FI kumpulan CR{{10}} berjulat dari 0.99 hingga 5.14 dan agak serupa dengan tikus AL-18. Dalam haiwan AL-32, nilai FI berjulat dari 0.70 hingga 2.27, dengan itu meliputi selang yang serupa dengan kumpulan AL-18 yang mencadangkan ketiadaan kesan umur yang ketara. Dalam kumpulan CR-32, nilai FI berjulat antara 0.87 hingga 2.02 dan setanding dengan haiwan AL-32, sekali gus menyokong idea bahawa penuaan lanjutan (32 bulan) mungkin kurang sensitif terhadap CR daripada penuaan (28 bulan).

Analisis statistik nilai FI daripada semua kumpulan dibentangkan dalam Rajah 7. Dalam perbandingan antara kumpulan AL-18 dan AL-28, nilai FI yang lebih tinggi bagi kumpulan tersebut menunjukkan perubahan berkaitan umur bagi keseimbangan dinamik. Bagi tikus yang dirawat CR, nilai kumpulan CR-28 tidak berbeza daripada nilai kumpulan AL-18 dan menyokong keberkesanan diet dalam perbandingan dengan rakan makan AL yang dipadankan dengan umur. . Menganalisis nilai AL-32 dan CR-32 FI menunjukkan ketiadaan perbezaan yang ketara antara mereka, mengukuhkan idea mengurangkan keberkesanan diet dalam haiwan secara semula jadi mencapai penuaan lanjutan. Tambahan pula, nilai FI bagi kedua-dua kumpulan 32-bulan tidak berbeza daripada AL{13}}, menyokong ketiadaan kesan umur yang ketara dalam haiwan tertua.