Abstrbertindak

Latar belakang: Semakin banyak kajian telah melaporkan kesan terapeutik sel stem mesenchymal (MSC) -eksosom yang dicirikan oleh protein dan miRNA. Walau bagaimanapun, profil proteomik dan miRNA exosom yang diperoleh daripada sel stem embrio manusia (hESCs) dan sel stem pluripotent yang disebabkan oleh manusia (hiPSCs) masih tidak jelas.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan boleh menghilangkan spesies oksigen reaktif, menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada Pukal Serbuk Cistanche Anti-penuaan

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kaedah: Dalam kajian ini, kami mengasingkan eksosom daripada hESC, hiPSC dan sel stem mesenchymal tali pusat manusia (hUC-MSC) melalui ultrasentrifugasi klasik dan 0.22-μm penapis, diikuti dengan pengenalan konservatif. Pelabelan tag jisim tandem dan kuantifikasi peptida relatif bebas label bersama-sama menentukan proteomik mereka. Penjujukan pemprosesan tinggi dilakukan untuk menentukan profil miRNA. Kemudian, kami menjalankan analisis bioinformatik untuk mengenal pasti proses dan laluan biologi yang dominan yang dimodulasi oleh kargo eksosom. Akhirnya, western blot dan RT-qPCR dilakukan untuk mengesan beban sebenar protein dan miRNA dalam tiga jenis exosomes.

Keputusan: Berdasarkan kajian kami, kargo daripada tiga jenis eksosom menyumbang kepada proses biologi yang canggih. Sebagai perbandingan, eksosom hESC (hESC-Exos) lebih unggul dalam mengawal perkembangan, metabolisme, dan antipenuaan, dan eksosom hiPSC (hiPSC-Exos) mempunyai fungsi biologi yang sama seperti hESC-Exos, manakala eksosom hUC-MSCs (hUC-MSC-Exos) menyumbang lebih kepada peraturan imun.

Kesimpulan: Data yang dibentangkan dalam kajian kami membantu mentakrifkan landskap protein dan miRNA bagi tiga eksosom, meramalkan fungsi biologinya melalui analisis rangkaian yang sistematik dan komprehensif pada peringkat sistem, dan mendedahkan potensi aplikasi masing-masing dalam bidang yang berbeza untuk mengoptimumkan pemilihan eksosom dalam praklinikal dan klinikal. percubaan.

Kata kunci: Sel stem embrio manusia, Sel stem pluripoten akibat manusia, Sel stem mesenchymal tali pusat manusia, Exosom, Proteomics, miRNA

pengenalan

Vesikel ekstraselular (EV) ialah vesikel kecil yang dirembeskan secara aktif oleh sel, terutamanya mengandungi eksosom, mikrovesikel (MV), dan badan apoptosis [40, 56, 57]. Mereka diedarkan secara meluas dalam pelbagai cecair badan, seperti air liur, susu ibu, darah, cecair serebrospinal, hempedu, dan air kencing [57]. Antaranya, eksosom mempunyai dwilapisan lipid dengan diameter 40–200 nm, ketumpatan apung 1.13–1.18 g/ml dalam kecerunan sukrosa, dan rupa berbentuk cawan di bawah mikroskop elektron [21, 53]. Pelbagai sebatian bioaktif, termasuk protein, asid nukleik, dan lipid, memberikan fungsi komunikasi antara sel eksosom antara sel [16, 17]. Lipid dwilapisan adalah penghalang halus yang melindungi kandungan eksosom daripada degenerasi enzimatik cecair badan [49]. Eksosom yang stabil boleh menengahi proses fisiologi dan patologi yang rumit melalui aktiviti paracrine, termasuk perkembangan organ dan pembiakan, persembahan antigen, komunikasi neuron, tindak balas imun, peraturan penuaan, dan percambahan sel [57, 62].

Pembentukan dan pelepasan eksosom adalah proses yang dikawal sepenuhnya, dan pengasingan kandungan terkapsul eksosom berlaku dengan mobilisasi pelbagai protein [22, 47]. Berbilang protein adalah penting untuk pembentukan eksosom, yang mengandungi kompleks pengisihan endosom yang diperlukan untuk pengangkutan (ESCRT), tetraspanin (CD9, CD63, dan CD81), gen berkaitan apoptosis 2-interaksi protein X (Alix) dan kerentanan tumor gen 101 (TSG101) [38, 55]. Pemerdagangan eksosom intraselular didorong oleh aktiviti kolektif siri protein, termasuk suis molekul RAB GTPases dan protein sitoskeletal, seperti aktin dan tubulin [24]. Selepas itu, rembesan eksosom dilengkapkan oleh kompleks SNARE dan keluarga sinaptotagmin [22]. Penyelidikan telah menentukan bahawa tunas dan penumpahan eksosom bergantung kepada aktiviti kalsium dan pengambilan ESCRT [15]. Sebagai utusan, pelepasan eksosom terlibat dalam crosstalk sel sebagai tindak balas kepada fisiologi selular dan perubahan patologi, seperti pengaktifan, perubahan pH, hipoksia, kerosakan sinaran, atau tekanan sel [61].

Untuk mendedahkan komponen eksosom dan kemungkinan fungsi fisiologi dan patologinya, teknik proteomik, transkriptomi, dan lain-lain sering digunakan untuk mengkaji RNA dan protein eksosom daripada spesies, tisu, dan sel yang berbeza [44]. Analisis proteomik eksosom biasanya merangkumi tiga langkah: pengasingan, penulenan, dan pencirian eksosom, pengenalpastian komponen protein menggunakan spektrometri jisim, dan analisis data mentah [14]. Keadaan selular memberi kesan ketara kepada komposisi protein dan banyaknya eksosom. Pada masa ini, teknik proteomik kuantitatif untuk menganalisis pencirian dan kelimpahan protein digunakan untuk menjelaskan mekanisme yang mendasari pengeluaran eksosom dan memperdalam pemahaman kita tentang peranan fisiologi dan patologi eksosom dalam sel [39]. Antaranya, teknologi proteomik kuantitatif berasaskan spektrometri jisim digunakan secara meluas, terutamanya termasuk kaedah berlabel isotop bebas label dan stabil [13, 42]. miRNA ialah molekul bioaktif kecil yang berkait rapat dengan pelbagai aktiviti kehidupan. Teknik penjujukan throughput tinggi dicirikan oleh kepekaan dan ketepatan yang tinggi dan mempunyai aplikasi yang luas dalam penjujukan miRNA (18-30 nt) [6]. Memandangkan perkembangan teknologi semasa, tiada halangan untuk membedah profil protein dan miRNA exosom.

hESC dan hiPSC mempunyai potensi pembezaan yang tinggi [36]. Walau bagaimanapun, aplikasi langsung mereka dalam rawatan adalah terhad kerana risiko keganasan dan isu etika [31]. Sebaliknya, sel stem mesenchymal (MSCs) mempunyai aplikasi yang lebih luas untuk campur tangan dalam pelbagai penyakit dalam tetapan klinikal [8]. Walau bagaimanapun, penggunaan langsung mereka masih menghadapi beberapa batasan, termasuk kadar kelangsungan hidup yang rendah, penolakan imunologi, dan isu keselamatan [8, 43]. Pada masa ini, banyak perhatian telah diberikan kepada eksosom kerana biosekuriti, kestabilan, bukan aneuploidi, dan imunogenisiti yang rendah [51]. Kajian terdahulu telah mendokumenkan perbandingan komponen MSC yang diperoleh daripada tisu yang berbeza dan eksosomnya yang mengandungi profil proteomik dan miRNA [59]. Gong et al. juga menggambarkan rangkaian pengawalseliaan vesikel ekstraselular hESC (EV) dari segi proteom, tetapi hanya dalam laluan berkaitan penuaan tanpa memberi tumpuan kepada yang lain [19]. Questa et al. menenun atlas proteomik EV hiPSC yang diperoleh daripada fibroblas kulup manusia (HFFs) [45]. Walaupun kajian ini sebahagiannya telah melaporkan komponen protein EV, mereka tidak menumpukan pada eksosom semata-mata, dan analisis proteomik komprehensif mereka tidak dinyatakan dengan jelas. Khususnya, profil miRNA belum lagi diterangkan. Untuk menangani ini, eksosom yang diasingkan daripada hESC, hiPSC, dan hUC-MSC telah dipilih dalam kajian ini untuk siasatan lanjut yang menyasarkan profil proteom dan miRNA mereka untuk mendapatkan pandangan baru untuk penyelidikan dan aplikasi klinikal mereka.

Kaedah

Penyediaan dan pencirian eksosom

hESC dan hiPSC dibiakkan dalam medium ncTarget (cat. no. RP01020; Nuwacell. Ltd, China), manakala hUC-MSC generasi ke-3 dikultur dalam medium hMSC misi bebas serum (cat. no. RP02010; Nuwacell. Ltd, China). Seterusnya, 350 mL supernatan sel dalam fasa pertumbuhan logaritma (~ 80 peratus pertemuan) telah dikumpulkan untuk penulenan eksosom. Eksosom telah diekstrak oleh satu siri sentrifugasi dan ultrasentrifugasi yang diiktiraf, seperti yang diterangkan sebelum ini [34, 52]. Secara ringkas, media terkondisi (CM) telah dikumpulkan dan tertakluk kepada sentrifugasi kecerunan (300×g selama 10 min, 2000×g selama 15 min, 10, 000×g selama 30 min) untuk memisahkan serpihan sel. Eksosom telah dipeli daripada supernatan yang dikumpul pada 100, 000×g selama 70 minit menggunakan pemutar Ti45 (Beckman Coulter, Amerika Syarikat). Ia kemudiannya digantung semula dalam PBS untuk penapisan seterusnya menggunakan penapis Membran MF-Millipore™ 0.22-μm (Sigma, USA). Turasan telah tertakluk kepada ultrasentrifugasi pada 100, 000×g selama 70 minit. Pelet eksosom akhir telah digantung semula dalam PBS untuk analisis seterusnya. Sistem penyerakan cahaya dinamik (DLS) (Wyatt Technology, USA) digunakan untuk mengukur kepekatan dan saiz eksosom terpencil.

Mikroskopi elektron penghantaran (TEM)

Pengimbasan TEM dilakukan untuk menerangkan morfologi eksosom terpencil, seperti yang diterangkan sebelum ini. Eksosom yang digantung semula (1 ug dalam 10 ul PBS) telah ditanam pada grid kuprum bersalut karbon (200-jaring) dan dibenarkan untuk menjerap ke atasnya selama 2 minit, diikuti dengan dua basuhan dengan air suling dua kali. Kemudian, grid diwarnakan secara negatif dengan 8 μL larutan uranil asetat 2 peratus selama 1 minit. Selepas pengeringan semula jadi, sampel telah diperiksa menggunakan sistem Tecnai Spirit (Thermo Fisher, Amerika Syarikat) pada 120 kV.

Penyerakan cahaya dinamik

Taburan saiz eksosom telah diterangkan melalui analisis penjejakan nanozarah menggunakan penyerakan cahaya dinamik (Wyatt Technology, USA) mengikut arahan pengeluar (271-DPN), seperti yang dilaporkan sebelum ini[23]. Secara ringkas, pelet eksosom telah digantung semula dalam 100 μL PBS. Sepuluh, 50 μL daripada eksosom di atas telah ditambah kepada 1450 μL PBS dan dipusingkan selama 30 saat. Eksosom (1.5 mL) telah dipindahkan ke kuvet pakai buang untuk penyamaan pada 25 darjah selama 30 saat. Nilai indeks biasan penyebaran ialah 1.37, dan kedua-dua Z-purata dan polydispersity (PDI) menentukan saiz zarah eksosom. Pengukuran bebas pokok diambil untuk setiap sampel.

Pelabelan tag jisim tandem (TMT) dan analisis kuantifikasi peptida relatif (LFQ) bebas label

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100, dan P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 dan P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), serta kepentingan statistik (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

analisis profil miRNA

Jumlah RNA diekstrak daripada eksosom terpencil menggunakan Kit Pengasingan miRNA mirVana™ (cat. no. AM1560; Thermo Fisher, USA). Sampel RNA telah tertakluk kepada pemeriksaan kualiti untuk ujian microarray miRNA yang dilakukan oleh LC-Bio Technology Co., Ltd. Analisis data mentah telah dilakukan seperti yang dilaporkan sebelum ini [9]. MiRNA yang dinyatakan secara berbeza telah dipilih sebagai miRNA calon pada nilai p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) dan tenaga bebas maksimum<−10 (miRanda).

Analisis bioinformatik

Data mentah tertakluk kepada analisis menggunakan pakej perisian Maxquant (v1.6.0), dan Swiss-Prot_Data manusia ditetapkan sebagai rujukan (20,600 protein) (ID Proteome: UP000005640) . Protein yang dikenal pasti dipetakan kepada Gene Ontology (GO) dan Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) berdasarkan analisis KOBAS [60] istilah untuk menentukan sifat biologi dan fungsinya. Perisian Cytoscape dan pakej igraph dalam perisian R (versi 3.6.1) digunakan untuk melukis rangkaian terjalin protein eksosom atau miRNA antara laluan isyarat.

Analisis statistik

Semua eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda. Kebolehulangan kuantitatif protein dan miRNA telah dinaikkan melalui analisis komponen utama (PCA), sisihan piawai relatif, dan pekali korelasi Pearson. Keputusan dianalisis menggunakan ujian t Pelajar tidak berpasangan. Data dinyatakan sebagai ralat piawai min bagi min (SEM). Nilai-P dianggap signifikan secara statistik pada *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Keputusan

Pengasingan dan pengenalan yang luar biasa

Kultur dan pengenalpastian tiga sel stem pluripoten manusia telah diterangkan dalam Fail Tambahan 1. Eksosom telah diasingkan daripada media terkondisi tiga jenis sel stem (Fail tambahan 1: Rajah S1) dan dikenal pasti berdasarkan morfologi, saiz zarah, kepekatan, dan penanda permukaan [19]. TEM mendedahkan bahawa eksosom ini mempunyai morfologi berbentuk cawan (Rajah 1A), dan DLS mendedahkan bahawa taburan saiznya adalah dalam lingkungan 50-200 nm (Rajah 1B). Western blotting menunjukkan bahawa eksosom terpencil membawa penanda positif CD63, TSG101, dan HSP70 tetapi bukan penanda negatif calnexin (Rajah 1C). Setiap hESC mempunyai hasil eksosom yang serupa dengan hiPSC, dan kedua-duanya lebih tinggi daripada hUC-MSC (Rajah 1D). Keputusan ini menunjukkan bahawa eksosom perwakilan telah ditangkap, tanpa perbezaan dalam bentuk; walau bagaimanapun, perbezaan didapati di antara kepekatan eksosom yang diasingkan daripada tiga jenis sel stem.

Bioinformatik protein yang dikongsi dan dimuatkan teratas

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (ujian bebas label). Akhirnya, 554, 437, dan 911 biji telah dipilih untuk menganalisis profil protein hESC-Exos, hiPSC-Exos, dan hUC-MSC-Exos, masing-masing (Fail tambahan 1: Rajah S3A). Kemudian calon-calon ini tertakluk kepada ujian rajah Venn untuk memilih protein yang dikongsi (Fail tambahan 1: Rajah S3B). Analisis bioinformatik mendedahkan 303 protein yang dikongsi mendominasi peraturan dalam laluan isyarat ini termasuk peraturan sitoskeleton aktin, lekatan fokus, PI3K-AKT, metabolisme karbon, dll. (Fail tambahan 1: Rajah S3C). Analisis GO juga menunjukkan bahawa protein yang dikongsi telah diperkaya dalam eksosom ekstraselular, membran, pengikatan protein, dan rantau ekstraselular, (Fail tambahan 1: Rajah S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (ujian bebas label) (Gamb. 2A). Berdasarkan keputusan ini, 163, 187, dan 451 protein telah disaring dalam hESC-Exos, hiPSC-Exos, dan hUC-MSC-Exos, masing-masing (Fail tambahan 1: Rajah S3E). Kami kemudiannya menerangkan lengkung kelimpahan ungkapan bagi tiga jenis eksosom dan mengenal pasti sepuluh simbol gen teratas protein yang dimuatkan dalam eksosom (Rajah 2B). Thprotein yang sangat dimuatkan tertakluk kepada bioinformatik berdasarkan algoritma KOBAS. Proteom bagi tiga jenis eksosom semuanya terlibat dalam rangkaian pengawalseliaan laluan isyarat yang kompleks, dan 20 laluan teratas kemudiannya diisih berdasarkan nilai -log10 (nilai-P) (Rajah 2C–E). Semua proteom diperkaya dalam interaksi reseptor matriks ekstraselular (ECM) dan laluan isyarat PI3K-AKT. Analisis interaksi protein-protein (PPI) mendedahkan bahawa protein paling tinggi dalam kedua-dua hESC-Exos dan hiPSC-Exos adalahdiperkaya dalam kitaran sel dan laluan metabolik, manakala protein paling tinggi dalam hUC-MSC-Exos diperkaya dalam laluan berkaitan peraturan imuniti (Rajah 2F-H).

Perbandingan berpasangan proteomik eksosom

Untuk menilai perbezaan antara setiap dua proteom eksosom, kami membina gambar rajah Venn untuk mengenali kelompok gen pengekodan protein yang unik dan bertindih. Gen pengekodan protein yang dikongsi kemudiannya tertakluk kepada analisis gunung berapi dan peta haba dan kepada GSEA, dan protein yang dinyatakan secara berbeza ditapis pada P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Perbandingan antara hESC-Exos dan hUC-MSC- 1: Rajah S4 D) mendedahkan bahawa kelompok gen pengekodan protein unik hESC-Exos terutamanya terlibat dalam EGFR, TGF-, kitaran sel, peraturan pluripotensi dan Wnt isyarat (Fail tambahan 1: Rajah S4E). Sebaliknya, kluster unik hUC-MSC-Exos diperkaya dalam banyak laluan isyarat berkaitan imunoregulation seperti sistem pelengkap, peraturan keradangan dan jangkitan mikrob (Fail tambahan 1: Rajah S4F). Kelompok bertindih sangat diperkaya dalam interaksi ECM-reseptor, pelengkap dan lata pembekuan, dan isyarat PI3K-AKT (Rajah 3D). Plot gunung berapi menggambarkan perbezaan antara hESC-Exos dan hUC-MSC-Exos (Rajah 3E). Protein terkawal dalam hUC-MSC-Exos (Kluster 1) terlibat terutamanya dalam tindak balas pelengkap, aktiviti sel pembunuh semulajadi, dan isyarat Rap1 dan PPAR. Sebaliknya, protein terkawal hESC-Exos terlibat terutamanya dalam isyarat PI3K-AKT, MAPK dan AMPK (Rajah 3F). GSEA mengesahkan keupayaan pengawalseliaan yang lebih tinggi bagi hiPSC-Exos dalam pluripotensi (Fail tambahan 1: Rajah S6A dan D) dan hESC-Exos dalam immunoregulasi, termasuk sitotoksisiti pengantaraan sel pembunuh semulajadi (Fail tambahan 1: Rajah S6B dan E) dan peraturan COVID19-SARS-CoV2 (Fail tambahan 1: Rajah S6C dan F).

Perbandingan hiPSC-Exos dan hUC-MSC-Exos (Fail tambahan 1: Rajah S4G) mendedahkan bahawa set gen pengekodan protein hiPSCExos yang unik dikaitkan dengan ketara dengan penyambungan akhir yang tidak homolog, TGF- , dan metabolisme vitamin B6 (Tambahan fail 1: Rajah S4H), manakala hUC-MSC-Exos terutamanya terlibat dalam laluan berkaitan imunoregulasi (Fail tambahan 1: Rajah S4I). Protein bertindih mereka juga mengambil bahagian dalam pengawalan interaksi reseptor ECM, lata pelengkap dan pembekuan, dan isyarat PI3K-AKT (Rajah 3G). Plot gunung berapi membentangkan protein yang dinyatakan secara berbeza (Rajah 3H). Protein Kluster 1 dalam peta haba menunjukkan bahawa hUCMSC-Exos terutamanya mengawal tindak balas imun dan laluan isyarat AMPK manakala hiPSC-Exos terutamanya mengawal kitaran sel dan laluan isyarat insulin, Hippo, dan mTOR (Rajah 3 I). GSEA seterusnya menyokong peranan dominan hiPSC-Exos dalam pengawalseliaan proses pembangunan (Fail tambahan 1: Rajah S7A dan D) dan penyelenggaraan pluripotensi (Fail tambahan 1: Rajah S7B dan E), manakala hUC-MSC-Exos ialah kebanyakannya terlibat dalam proses imunoregulasi (Fail tambahan 1: Rajah S7C dan F).

Bioinformatik proteom bertindih

Seterusnya, kami menyiasat proteom kongsi tiga jenis eksosom. Secara keseluruhan, 309 gen pengekodan protein (Rajah 4A) telah tertakluk kepada analisis GO dan KEGG. Keputusan menunjukkan bahawa set gen pengekodan protein yang dikongsi di antara tiga jenis eksosom terutamanya terlibat dalam aktiviti ekstraselular dan proses biologi termasuk proses metabolik protein selular, pengikatan reseptor isyarat, pengikatan ATP, pengikatan NAD, penyembuhan luka, dan proses metabolik lipid (Rajah 1). 4B). Mereka juga menyumbang kepada pembinaan rangkaian kawal selia kompleks laluan isyarat seperti PI3K-AKT, glikolisis/glukoneogenesis, Hippo, Oxytocin, HIF-1, kitaran sel dan laluan AMPK (Rajah 4C). Terdapat hubungan kawal selia yang rumit antara laluan isyarat proteomik dan kanonik ini (Rajah 4D). Plot gelembung membuktikan kelimpahan yang berbeza bagi setiap kelompok protein dalam laluan isyarat kanonik. Walaupun hESC-Exos dan hiPSC-Exos mungkin mempunyai kebolehan pengawalseliaan yang lebih kuat daripada hUC-MSC-Exos dari segi kitaran sel dan laluan isyarat AMPK, hUC-MSC-Exos mungkin mempunyai kesan pengawalseliaan yang ketara pada laluan isyarat VEGF dan NF-κB (Tambahan fail 1: Rajah S8).

Analisis peta haba seterusnya mendedahkan perbezaan dalam ekspresi protein yang dikongsi (Rajah 4E). Dalam Kluster A, protein yang terlibat dalam laluan isyarat reseptor PI3K-AKT, Hippo, VEGF, dan sel B telah diperkaya dalam hUC-MSCExos dan hESC-Exos. Protein dalam Kluster B terutamanya mengambil bahagian dalam pengawalan isyarat PPAR, metabolisme kolesterol, dan pengeluaran IgA dan telah habis dalam hESC-Exos. hUC-MSC-Exos terutamanya mengandungi protein Kluster C, yang mengawal tindak balas pelengkap, jangkitan mikrob, isyarat HIF-1, isyarat MAPK, laluan metabolik dan laluan NF-κB. Protein dalam Kluster d, yang diperkaya dalam hiPSC-Exos, mengambil bahagian dalam mengawal selia isyarat Ras, fosforilasi oksidatif, dan isyarat mTOR. Protein dalam Kluster e lebih banyak dalam kedua-dua hiPSC-Exos dan hESC-Exos berbanding hUC-MSCExos, dan ia terlibat dalam pelbagai proses metabolik, seperti kitaran sitrat, kitaran sel, isyarat insulin, metabolisme asid lemak dan isyarat AMPK. . Protein dalam Kluster f mengambil bahagian dalam mengawal selia penyerapan semula kalsium, glikolisis/glukoneogenesis, isyarat adrenergik, dan metabolisme piruvat dan telah habis dalam kedua-dua hUC-MSCExos dan hiPSC-Exos. Protein dalam kelompok yang berbeza disenaraikan dalam Fail tambahan 4.

profil miRNA daripada tiga jenis eksosom

Untuk menyiasat profil miRNA bagi tiga jenis eksosom, jumlah RNA telah diasingkan daripada eksosom untuk menggandingkan hujung 5' dan 3' untuk transkripsi songsang seterusnya. CDNA yang diperoleh digunakan untuk pembinaan perpustakaan dan ujian luas. Nombor integriti RNA (RIN) ialah 2.7, 2.6, dan 2.6 dalam hESC-Exos, hiPSC-Exos, dan hUC-MSC-Exos, masing-masing (Fail tambahan 1: Rajah S9A). Penentuan kepekatan RNA mendedahkan bahawa hESC-Exos mendominasi beban RNA, diikuti oleh hiPSC-Exos dan hUC-MSCExos (Fail tambahan 1: Rajah S9B). Pekali korelasi Pearson (Fail tambahan 1: Rajah S9C) dan PCA (Fail tambahan 1: Rajah S9D) digunakan untuk menilai kebolehulangan miRNA secara kuantitatif. Peta haba digunakan untuk mewakili miRNA yang dinyatakan secara berbeza dalam tiga jenis eksosom (Fail tambahan 1: Rajah S9E), dan bilangan miRNA yang dinyatakan secara berbeza pada P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Untuk menyiasat miRNA yang terlibat dalam proses biologi, miRNA teratas telah ditapis di P<0.05 and read count>1000 untuk ramalan gen sasaran selanjutnya. Gen yang diperkaya kemudiannya tertakluk kepada analisis GO dan KEGG. Keputusan menunjukkan bahawa hESC-Exos miRNAs mempengaruhi proses berikut dengan ketara: Rap1, PI3K-AKT, kalsium, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, kitaran sel, laluan isyarat AMPK, dll. (analisis KEGG) (Rajah 5D), dan kitaran sel, perkembangan pelbagai organisma, transduksi isyarat intrasel, pembezaan sel, penuaan, isyarat Wnt, dan metabolisme asid lemak. (proses biologi) (Rajah 5G). Pengayaan gen sasaran miRNA hiPSC-Exos menunjukkan bahawa proses berikut dikawal dengan ketara: PI3K-AKT, Rap1, Ras, Kalsium, Hippo, cAMP, dan laluan isyarat cGMP-PKG, dsb. (analisis KEGG), dan kitaran sel, pembangunan pelbagai organisma, fosforilasi, pembezaan sel, penghijrahan sel, dan tindak balas kepada hipoksia. (proses biologi) (Rajah 5H). Dalam rangkaian pengawalseliaan miRNA hUC-MSC-Exos, proses biologi yang paling munasabah ialah: Rap1, Ras, PI3K-AKT, kalsium, cAMP, Hippo, kitaran sel, JAK-STAT dan laluan isyarat HIF-1 . (Analisis KEGG) (Rajah 5F), dan fosforilasi, transduksi isyarat intraselular, pengikatan ATP, pembahagian sel, metabolisme lipid, stimulasi bersama sel T, penyembuhan luka, pengikatan NF-κB dan tindak balas keradangan. (proses biologi) (Rajah 5 I). Rangkaian lima miRNA teratas dan laluan pengawalseliaan mereka juga digambarkan (Fail tambahan 1: Rajah S10).

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】